王澤華，王 梓，方香玲

（草種創(chuàng)新與草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地微生物中心 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020）

苜蓿(Medicagosativa)是一種多年生豆科牧草，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好、耐受性強(qiáng)，是我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)牧草[1-3]。尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)引起的苜蓿枯萎病是苜蓿上的重要病害之一，會(huì)嚴(yán)重影響苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，在我國(guó)東北、西北和華北等苜蓿種植區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重制約著苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。尖孢鐮刀菌是一種在全世界各種土壤中廣泛分布的土傳病原真菌[4]，寄主范圍廣，能夠引起100 多種作物發(fā)生枯萎病或根腐病[5-6]。在沒有合適寄主植物的情況下，尖孢鐮刀菌分生孢子可以在植物表面存活較長(zhǎng)時(shí)間，或者以厚垣孢子在土壤種存活數(shù)年[6-7]。土壤中微生物區(qū)系復(fù)雜，普通培養(yǎng)基難以直接分離出尖孢鐮刀菌。為了從土壤中快速高效地分離尖孢鐮刀菌，本研究對(duì)特異性培養(yǎng)基進(jìn)行了探索，從而為該菌的快速檢測(cè)定量以及病害的發(fā)生機(jī)制和監(jiān)測(cè)預(yù)警等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤采集自蘭州大學(xué)榆中半干旱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)實(shí)踐基地，采樣前去除土壤表面的植物殘?bào)w等之后，取0－10 cm 深的土壤，過2 mm 孔徑土篩后備用。

尖孢鐮刀菌選擇性分離培養(yǎng)基(selective isolation media forFusarium oxysporum, SIMF)的配置方法：取馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)干粉4.8 g，用蒸餾水將其溶解，加CuSO4·5H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.3 g、瓊脂15.0 g，后加蒸餾水補(bǔ)足至1 L，利用1.0 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.5，121 ℃高壓滅菌20 min。冷卻至45 ℃左右時(shí)加入95%酒精10 mL、敵磺鈉飽和溶液10 mL、20%硫酸鏈霉素4 mL、5%氯霉素溶液1 mL，攪拌均勻，倒制平板[8-10]。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基的配制方法：取PDB 粉末4.8 g 和瓊脂15.0 g，用1 L 蒸餾水溶解，121 ℃高壓滅菌20 min，倒制平板。PDB 液體培養(yǎng)基的配制方法：稱取PDB 干粉4.8 g，用1 L 蒸餾水溶解，分裝于100 mL錐形瓶，121 ℃高壓滅菌20 min 備用。

1.2 選擇性培養(yǎng)基的分離驗(yàn)證

采用稀釋平板法，取發(fā)病植株根圍土壤1.0 g，用9 mL 無菌蒸餾水稀釋；吸取稀釋液1 mL，用9 mL無菌蒸餾水稀釋后將稀釋液0.1 mL 于選擇性培養(yǎng)基上涂布，以涂布等量無菌水的PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照。室溫靜置10 min，將涂布的平板和對(duì)照倒置放在培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)5～7 d。挑取分離得到的菌落于PDA 培養(yǎng)基和SIMF 培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)4～5 d，采用十字交叉法，每天測(cè)量菌株直徑，并依據(jù)Booth 的鐮刀菌分類標(biāo)準(zhǔn)[11]，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

將分離的菌株接種于PDB 培養(yǎng)基120 r·min-1、25 ℃搖床培養(yǎng)3 d。參考Fang 等[12]的方法提取菌株DNA。利用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′) / ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)[13]，和EF1 (5′-ATGGGTAAGGARGACAAGA C-3′) / EF2 (5′-GGARGTACCAGTSATCATG-3′)[14]分別擴(kuò)增供試菌株ITS 和TEF 序列。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果獲得同源性最高鐮刀菌的ITS 和TEF 序列[13,15-17]。

1.3 土壤中尖孢鐮刀菌的分離率

將分離得到的菌株進(jìn)行PDB 搖瓶培養(yǎng)并收集孢子懸浮液106個(gè)·mL-1，然后按照梯度稀釋法稀釋為不同的濃度，與滅菌土壤按比例混勻，制作成每克 土 含 量 為50 000個(gè)、5 000 個(gè) 和500 個(gè) 的 土 壤 樣品，利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離和計(jì)數(shù)，每隔24 h統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，并計(jì)算分離率。分離率 = (樣品涂布定量結(jié)果/樣品中孢子實(shí)際數(shù)量) × 100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表利用Excel 2010 進(jìn)行。測(cè)序結(jié)果通過BLAST 比對(duì)分析，從GenBank 下載鐮刀菌屬代表種序列，利用MEGA (6.0)通過鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)利用Bootstrap(1 000 次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIMF 培養(yǎng)基特異性驗(yàn)證

通過涂布發(fā)病土壤稀釋液于不同的培養(yǎng)基上驗(yàn)證了尖孢鐮刀菌選擇性分離培養(yǎng)基的特異性。發(fā)病土壤稀釋液涂布于PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d 后培養(yǎng)基上滋生了多種菌，菌落形態(tài)各異(圖1A)，而發(fā)病土壤稀釋液涂布于SIMF 培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出形態(tài)一致的菌落(圖1B)。將在SIMF 培養(yǎng)基上的單菌落接種于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5 d，分離到的菌株菌落淡紫色，菌絲呈條紋狀、絨毛狀至叢卷毛狀(圖1C、D)。小型分生孢子大量產(chǎn)生，橢圓形無隔或僅有一個(gè)分隔；大型分生孢子兩端尖，呈梭形或鐮刀形，通常有3 個(gè)分隔(圖1E)。

圖1 SIMF 培養(yǎng)基的特異性驗(yàn)證Figure 1 Specificity of SIMF medium

對(duì)分離菌株進(jìn)行ITS 和TEF 的PCR 擴(kuò)增及測(cè)序，并將序列測(cè)定結(jié)果在NCBI 進(jìn)行比對(duì)。該菌株的序列與已知尖孢鐮刀菌苜蓿專化型如LZ22 (GenBank ITS序列號(hào)MW036290，TEF 序列號(hào)MW560899)[17]的序列同源性為100%。根據(jù)ITS和TEF 序列，采用鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離得到的菌株與尖孢鐮刀菌聚為一支(圖2、圖3)。

圖2 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建的鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Fusariumphylogenetic tree constructed based on the rDNA-ITS sequence

圖3 基于TEF 序列構(gòu)建的鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Fusariumphylogenetic tree based on the TEF sequence

2.2 尖孢鐮刀菌在SIMF 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性

尖孢鐮刀菌在SIMF 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)初期，菌落呈白色圓形且菌絲質(zhì)密；培養(yǎng)5 d 后菌絲呈松散絨毛狀，中間密邊緣稀疏；菌落邊緣有缺口呈鋸齒狀，中心呈淡黃色，菌落直徑為22 mm，生長(zhǎng)速度為4.4 mm·d-1(圖4A)。在PDA 培 養(yǎng) 基 上 培 養(yǎng)5 d 后 直 徑為66 mm，SIMF 培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度小于PDA上的生長(zhǎng)速度。平板中有多個(gè)菌落時(shí)，菌落生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)5 d 時(shí)菌絲呈輻射狀生長(zhǎng)，菌落形態(tài)為白色不規(guī)則狀，在平板上容易辨認(rèn) (圖4B)。

圖4 尖孢鐮刀菌在SIMF 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Figure 4 Colony morphology of Fusarium oxysporumon SIMF medium

2.3 分離率隨培養(yǎng)天數(shù)的變化

利用孢子含量為5 000 個(gè)每克帶菌土壤驗(yàn)證培養(yǎng)基的分離率，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)天數(shù)的菌落數(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，分離率逐漸增加，初期生長(zhǎng)較快，期間有一個(gè)生長(zhǎng)緩慢的階段(圖5)。培養(yǎng)7 d時(shí)，菌落數(shù)趨于穩(wěn)定，分離率達(dá)86.4%，培養(yǎng)7 d 后菌落有交叉重疊的現(xiàn)象，不利于計(jì)數(shù)。

圖5 不同培養(yǎng)天數(shù)分離率Figure 5 Changes in isolation rate at different culture days

2.4 土壤中不同含量尖孢鐮刀菌的分離率

將孢子含量分別為每克土500、5 000、50 000 個(gè)的土壤涂布于選擇性培養(yǎng)基上，測(cè)定土壤攜菌分離率，發(fā)現(xiàn)分離率在50%～94%，平均分離率為79.3%，表明該選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)效果較好。不同含菌量土壤的分離率不同，這與稀釋濃度和平板菌落數(shù)相關(guān)。本研究中，孢子含量為每克土500 個(gè)～5 000 個(gè)時(shí)，平板菌落數(shù)介于30～50 個(gè)時(shí)計(jì)數(shù)最準(zhǔn)確。孢子濃度為每克土50 000 個(gè)時(shí)，菌落數(shù)過多，有菌落重疊的現(xiàn)象不利于計(jì)數(shù)。

3 討論

尖孢鐮刀菌是土壤習(xí)居菌，可以在土壤中存活多年，一旦條件適宜，能夠從根部入侵植物，危害植物健康[18]。常用的分離純化土壤真菌的方法需要將土壤懸浮液涂布于培養(yǎng)基平板上，根據(jù)菌落形態(tài)特征初步鑒定，然后挑單菌落進(jìn)行分離純化3～4 次，從而獲得目標(biāo)菌株。但是這種操作過程復(fù)雜且費(fèi)時(shí)，而使用選擇性培養(yǎng)基能夠從土壤中快速分離出尖孢鐮刀菌，通過1 次純化即可獲得單一的純菌株。已有關(guān)于尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基的報(bào)道，篩選出特異性分離尖孢鐮刀菌古巴?；?F.oxysporumf.sp.cubense)和棉花專化型(F.oxysporumf.sp.vesinfectum)的選擇性培養(yǎng)基[8,19-20]，但是關(guān)于苜蓿?；偷倪x擇性培養(yǎng)基未見報(bào)道。本研究在這些報(bào)道的基礎(chǔ)上[8]，對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化。碳源是微生物生長(zhǎng)發(fā)育、孢子萌發(fā)的重要影響因素[21]。景曉輝等[8]以土豆(Solanum tuberosum)提取物為碳源，但土豆品種和個(gè)體之間差異會(huì)造成培養(yǎng)基碳源含量的差異，本研究利用成品PDB 干粉為碳源，為分離菌株提供了穩(wěn)定一致的碳源，從而提高了培養(yǎng)基的穩(wěn)定性。培養(yǎng)基中添加的敵磺鈉對(duì)多種土壤真菌如絲囊菌(Aphanomyces)等具有抑制作用；鏈霉素對(duì)多種細(xì)菌如變形桿菌屬(Proteus)和沙門菌屬(Salmonella)具有抑制作用，但對(duì)多種革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制作用較差；而氯霉素是抑菌性廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有抑制作用，能夠有效防止細(xì)菌的污染[22]。

本研究研制的尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基能夠快速分離出土壤中的尖孢鐮刀菌。該培養(yǎng)基平均分離率為79.3%，平板菌落數(shù)在30～50 個(gè)時(shí)計(jì)數(shù)最為準(zhǔn)確。培養(yǎng)7 d 后菌落數(shù)趨于穩(wěn)定。結(jié)合稀釋平板涂布法，可以將選擇性培養(yǎng)基用于土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量的定量研究。平板涂布法測(cè)定的菌為具有活性的菌數(shù)量，常與熒光定量方法一起用于土壤中尖孢鐮刀菌的定量研究[23]。利用選擇性培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)了香蕉(Musa nana)枯萎病發(fā)生率及嚴(yán)重程度與初始接種濃度有關(guān)，病害發(fā)生初期，土壤中病原菌的含量與病害嚴(yán)重程度正相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，發(fā)病香蕉根際土壤中病原菌的含量高于根圍土[24-25]。通過利用Komada 選擇性培養(yǎng)基對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，間作模式有利于降低西瓜(Citrullus lanatus)根際尖孢鐮刀菌數(shù)量，從而降低西瓜枯萎病的嚴(yán)重程度[26]。本研究的選擇性培養(yǎng)基將為研究尖孢鐮刀菌在苜蓿種植地土壤中的富集和定殖及病害發(fā)生規(guī)律等提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究研制了一種快速分離和定量土壤中尖孢鐮刀菌的特異性培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的成分及配置方法：馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)干粉4.8 g，用蒸餾水溶解后加CuSO4·5H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.3 g、瓊脂15.0 g，加蒸餾水補(bǔ)足至1 L，利用1 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.5，121 ℃高壓滅菌20 min。冷卻至45 ℃左右時(shí)加入95%酒精10 mL、敵磺鈉飽和溶液10 mL、20%硫酸鏈霉素4 mL 和5%氯霉素溶液1 mL，攪拌均勻后倒制平板備用。