焦燁磊，陳慧聰，黃旭雄,2,3，王偉隆

（1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306）

類胡蘿卜素（carotenoids）是含40 個(gè)碳的類異戊烯聚合物一類天然色素的總稱，普遍存在于動(dòng)物、高等植物、真菌、藻類中。類胡蘿卜素可分為兩類：碳?xì)湫偷暮}卜素類-Carotenes 和氧化型的葉黃素類-Xanthophylls，前者只由碳、氫組成，主要代表為β-胡蘿卜素，后者由碳、氫、氧組成，主要代表為蝦青素、蝦黃素、葉黃素和角黃素[1,2]。迄今為止，從自然界中鑒定出的類胡蘿卜素約有750 多種[2]，主要由各種光合細(xì)菌、植物、藻類及部分真菌合成。動(dòng)物不能從頭合成類胡蘿卜素，可從食物中吸收和代謝類胡蘿卜素[3]。微藻中主要存在β-胡蘿卜素—海膽酮—角黃素—蝦青素和β-胡蘿卜素—玉米黃質(zhì)—蝦青素2 條蝦青素合成途徑[4]；Tanaka 等[5]提出甲殼類動(dòng)物體內(nèi)存在兩條類胡蘿卜素代謝途徑，一是β-胡蘿卜素—異黃素—海膽酮—角黃素—紅黃素—蝦青素，二是玉米黃質(zhì)—4-酮玉米黃質(zhì)—蝦青素；Franz-Christian 等[6]提出，在加利福尼亞鹵蟲和加拿大鹵蟲體內(nèi)可能存在兩種不同的酮基類胡蘿卜素代謝路徑，前者可將β-胡蘿卜素代謝為海膽酮和角黃素，而后者除海膽酮及角黃素外還可以代謝產(chǎn)生蝦青素。類胡蘿卜素是體內(nèi)維生素A 的主要來源，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、延緩衰老等功效[7]。類胡蘿卜素在水產(chǎn)中的主要應(yīng)用主要是著色和抗氧化能力。為了維持或增強(qiáng)體色、提高機(jī)體免疫力、改善健康狀況，通常在飼料中添加類胡蘿卜素，是一類重要的功能性飼料添加劑。類胡蘿卜素中的β-胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素等常用于水產(chǎn)動(dòng)物的著色和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[8]。鹵蟲無節(jié)幼體是魚蝦幼體重要的活餌料，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物苗種生產(chǎn)中，其營養(yǎng)價(jià)值影響育苗的成敗。已有的研究表明，不同產(chǎn)地甚至是同一產(chǎn)地不同季節(jié)鹵蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量與組成也存在顯著差異[9]。有關(guān)鹵蟲營養(yǎng)研究大多聚焦于鹵蟲體內(nèi)高不飽和脂肪酸[10]，而對于鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素的蓄積和代謝的研究鮮有報(bào)道，對于鹵蟲體內(nèi)是否存在蝦青素及能否代謝產(chǎn)生蝦青素也尚未明確。

本文超高效液相色譜（UPLC）檢測方法，調(diào)查了我國三產(chǎn)地鹵蟲卵及無節(jié)幼體體內(nèi)涉及甲殼類動(dòng)物類胡蘿卜素代謝途徑的5 種重要類胡蘿卜素的含量，為后續(xù)探究鹵蟲類胡蘿卜素代謝及調(diào)控鹵蟲類胡蘿卜素營養(yǎng)積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用三種鹵蟲休眠卵的原產(chǎn)地分別為青海鹽湖、內(nèi)蒙古鹽湖及渤海灣鹽場，購自山東濱州前華水產(chǎn)有限公司。三產(chǎn)地鹵蟲卵分別在淡水中吸漲1 h 后，參照Lim 等[11]方法用次氯酸鈉溶液去殼，收集去殼卵。脫氯處理后收集洗凈的去殼卵，冷凍干燥后用于類胡蘿卜素分析。另取三產(chǎn)地鹵蟲卵分別在25 L 鹽度25 的人工海水孵化桶內(nèi)孵化24 h 后分離無節(jié)幼體用于后續(xù)試驗(yàn)，孵化水溫27 ℃～28 ℃，連續(xù)光照并充氣。

1.2 鹵蟲無節(jié)幼體的饑餓實(shí)驗(yàn)

將孵化的三產(chǎn)地初孵無節(jié)幼體分別轉(zhuǎn)移到過濾人工海水中，暫養(yǎng)密度為25～30 ind./mL，在鹽度25、水溫27 ℃～28 ℃下進(jìn)行饑餓試驗(yàn)。試驗(yàn)期間連續(xù)充氣，每隔12 h 換1/3 的水。在試驗(yàn)開始后0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 定時(shí)收集部分活的無節(jié)幼體，漂洗后冷凍干燥用于測定。

1.3 鹵蟲類胡蘿卜素含量檢測方法構(gòu)建及鹵蟲類胡蘿卜素含量測定

從德國Sigma 公司購買5 種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品：蝦青素（純度≥97%）、玉米黃質(zhì)（純度≥95%）、角黃素（純度≥95%；）、海膽酮（純度≥95%）和β-胡蘿卜素（純度≥95%）標(biāo)準(zhǔn)品，用含0.1% BHT 的甲醇-乙腈（甲醇∶乙腈,v/v,3∶7）溶液定容為5 μg/mL的類胡蘿卜素單一標(biāo)準(zhǔn)溶液及20.0 μg/mL、5.0 μg/mL、2.0 μg/mL、1.0 μg/mL 和0.2 μg/mL 的5 個(gè)濃度的類胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm 親水濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中備檢。以超高效液相色譜儀（帶ACQ-QSM 型四元泵、ACQ-FTN 型自動(dòng)進(jìn)樣器和ACQ-PDA 檢測器，美國Waters）為分析平臺(tái)，選用ACQUITY UPLCBEH C18 1.7 μm（2.1 mm×150 mm Column）色譜柱，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例及流速等參數(shù)，獲得能有效分離5 種色素的色譜條件。

稱取凍干鹵蟲樣品100.0 mg 于10 mL 離心管中，加入3 mL 丙酮∶甲醇（v/v，2∶1）溶液，渦旋震蕩混勻，然后在24 Hz 下冰浴超聲波處理30 min、65 ℃浸提20 min，4 000 r/min 離心10 min，收集上清液于新的離心管中，整個(gè)提取步驟重復(fù)三次。合并上清液后用氮?dú)獯蹈?，? mL 乙腈-甲醇溶液（70∶30，v/v）復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 親水濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中備檢。在構(gòu)建的可有效分離5 種色素的色譜條件下檢測樣品中的色素組成及含量。

單個(gè)鹵蟲無節(jié)幼體（去殼卵）重量的測定：將含鹵蟲無節(jié)幼體（去殼卵）的水體裝入1 000 mL 量筒，從底部充氣使無節(jié)幼體或去殼卵均勻分布，用移液槍移取0.5 mL 于浮游生物計(jì)數(shù)板上，經(jīng)魯哥試劑固定后在解剖鏡下計(jì)數(shù)，重復(fù)4 次。測得1 000 mL 水體中鹵蟲無節(jié)幼體（去殼卵）的數(shù)量。將1 000 mL 水體中的鹵蟲無節(jié)幼體（去殼卵）濾出，收集于10 mL離心管中，冷凍干燥至恒重，設(shè)3 個(gè)平行，計(jì)算每萬只鹵蟲無節(jié)幼體（去殼卵）的質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果及分析

2.1 超高效液相色譜（UPLC）檢測鹵蟲類胡蘿卜素含量方法

在超高效液相色譜儀上，通過調(diào)解流動(dòng)相比例及流速等參數(shù)，獲得能高效分離5 種類胡蘿卜素的色譜條件：初始流動(dòng)相為：10%水+90%甲醇-乙腈溶液（v/v，3∶7），于16 min 切換流動(dòng)相為20%叔丁基甲基醚溶液+80%甲醇-乙腈溶液（v/v，3∶7），流速0.30 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣體積10 μL，檢測波長為475 nm。在此色譜條件下，5 種類胡蘿卜素的分離效果如圖1 所示。β-胡蘿卜素的檢測限為0.05 μg/mL，其余4 種類胡蘿卜素的檢測限為0.02 μg/mL。在色素濃度為0～20 μg/mL 范圍內(nèi)，各色素濃度和峰面積呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系（表1）。同一批次的鹵蟲樣品，加入3 個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平測定6 次，加標(biāo)回收率和精密度見表2。由表2 可知，本方法的回收率好，精密度高。

表1 5 種類胡蘿卜素UPLC 法檢測的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linear equation,correlation coefficient and detection limit of 5 carotenoids with UPLC detection

表2 方法的回收率和精密度（n=6）Tab.2 Recoveries and relative standard deviations（n=6）of the method

圖1 超高效液相色譜獲得的5 種類胡蘿卜素的出峰效果Fig.1 Peak curves of five carotenoids on UPLC

2.2 三產(chǎn)地鹵蟲去殼卵及初孵無節(jié)幼體類胡蘿卜素含量的比較

在三產(chǎn)地鹵蟲去殼卵及初孵無節(jié)幼體內(nèi)均未檢測到β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和蝦青素，但都能檢測到角黃素和海膽酮，且無節(jié)幼體角黃素含量有所升高（表3）。渤海灣產(chǎn)鹵蟲去殼卵內(nèi)角黃素和海膽酮含量顯著高于青海鹵蟲，但與內(nèi)蒙古產(chǎn)鹵蟲無顯著差異（P＜0.05）。內(nèi)蒙古產(chǎn)鹵蟲初孵無節(jié)幼體角黃素含量最高，青海鹵蟲初孵無節(jié)幼體角黃素含量最低；而青海產(chǎn)鹵蟲初孵無節(jié)幼體海膽酮含量最高，內(nèi)蒙古產(chǎn)鹵蟲初孵無節(jié)幼體海膽酮含量最低。

表3 三產(chǎn)地鹵蟲去殼卵及初孵無節(jié)幼體中類胡蘿卜素含量（μg/萬只）的比較Tab.3 Comparisons of carotenoids contents（μg/104 ind.）in decapsulated cyst and newly hatched nauplii of brine shrimp from three different regions

2.3 三產(chǎn)地鹵蟲初孵無節(jié)幼體饑餓過程中類胡蘿卜素含量的變化

隨著饑餓時(shí)間的延長，三產(chǎn)地鹵蟲初孵無節(jié)幼體體內(nèi)角黃素含量均逐漸降低。青海產(chǎn)鹵蟲無節(jié)幼體角黃素消耗速率和消耗量小于內(nèi)蒙古和渤海灣產(chǎn)的鹵蟲無節(jié)幼體（圖2）。

圖2 三產(chǎn)地鹵蟲無節(jié)幼體饑餓過程中角黃素含量（μg/萬只）的變化Fig.2 The variations in canthaxanthin contents（μg/104 ind.）in brine shrimp nauplii from three locations during 48 h starvation

三產(chǎn)地鹵蟲無節(jié)幼體體內(nèi)海膽酮含量隨饑餓時(shí)間的延長逐漸降低，饑餓24 h 后，內(nèi)蒙古和青海產(chǎn)鹵蟲無節(jié)幼體體內(nèi)海膽酮含量趨于穩(wěn)定，渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體在饑餓48 h 過程中海膽酮含量逐漸降低（圖3）。

圖3 三產(chǎn)地鹵蟲無節(jié)幼體饑餓過程中海膽酮含量（μg/萬只）的變化Fig.3 The variations in echinenone contents（μg/104 ind.）in brine shrimp nauplii from three locations during 48 h starvation

3 討論

甲殼類動(dòng)物體內(nèi)的類胡蘿卜素主要是酮基類胡蘿卜素，比如蝦青素、角黃素和海膽酮，它們以游離態(tài)及酯-蛋白質(zhì)混合物的存在形式[12]。有關(guān)蝦蟹、枝角類等甲殼動(dòng)物的類胡蘿卜素研究較多。對蝦外骨骼中沉積的主要類胡蘿卜素是蝦青素、蝦青素酯和β-胡蘿卜素[13]，且飼料中的蝦青素、β-胡蘿卜素和角黃素主要是以蝦青素酯的形式沉積在對蝦體內(nèi)[14]。對韓氏溪蟹（Potamon dehaan）的研究發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素在蟹體內(nèi)的分布具有組織特異性。蟹殼和卵巢中發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素主要為葉黃素和蝦青素，而肝胰腺中主要為葉黃素和β-胡蘿卜素，還存在少量的3′-表葉黃素、玉米黃質(zhì)、蝶刺桐酮、α-皮黃素、二羥基胡羅卜酮、毛茛黃素和新黃質(zhì)[15]。其他淺海生活的底棲甲殼動(dòng)物通常會(huì)在組織中沉積葉黃素、玉米黃質(zhì)、新黃質(zhì)、毛茛黃素等一種或多種植物色素[16-19]。Glyphyocrangon vicaria、Munidopsis albatrossae 等深海底棲甲殼動(dòng)物中存在異隱黃質(zhì)、異玉米黃質(zhì)、甲殼黃素等色素[17]。端足類（Amphipoda）等小型食草甲殼動(dòng)物含有包括蝦青素在內(nèi)的大量類胡蘿卜素[18]。鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素的研究相對較少，但對鹵蟲類胡蘿卜素的組成有不同觀點(diǎn)。Gilchrist 等[19]在用面包酵母喂養(yǎng)的鹵蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了蝦青素酯。Hsu 等[20]在加利福尼亞灣的鹵蟲卵以及初孵無節(jié)幼體只檢測出了角黃素和海膽酮。本研究中，對內(nèi)蒙古、青海和渤海灣三個(gè)產(chǎn)地的鹵蟲去殼卵和無節(jié)幼體的檢測中也均只檢測到角黃素和海膽酮兩種類胡蘿卜素，未檢測出β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)以及蝦青素。這一結(jié)果與Hsu 等[20]的結(jié)果相一致，說明鹵蟲胚胎和早期內(nèi)源性營養(yǎng)階段只存在角黃素和海膽酮兩種類胡蘿卜素。然而，Gilchrist等[20]研究發(fā)現(xiàn)，給鹵蟲投喂富含β-胡蘿卜素的杜氏鹽藻（Dunalielia salina），在成蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了酯化蝦青素。白巖研究認(rèn)為，鹵蟲攝食冰涼花后，冰涼花中的蝦青素酯可以轉(zhuǎn)化為蝦青素單體并在鹵蟲體內(nèi)積累[21]。表明鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素的蓄積可能存在組織器官和發(fā)育階段階段的特異性，卵母細(xì)胞不蓄積蝦青素。

本研究中，不同產(chǎn)地去殼卵和初孵無節(jié)幼體內(nèi)檢測到的類胡蘿卜素含量存在差異。餌料中類胡蘿卜素影響?zhàn)B殖動(dòng)物的抗氧化能力、機(jī)體免疫力和健康狀況，因此不同產(chǎn)地鹵蟲的類胡蘿卜素營養(yǎng)價(jià)值不同。鹵蟲的非選擇性濾食習(xí)性，通過營養(yǎng)強(qiáng)化技術(shù)可定向提高鹵蟲作為餌料的類胡蘿卜素營養(yǎng)價(jià)值，即攝食外源性類胡蘿卜素的鹵蟲體內(nèi)色素的組成與餌料有關(guān)。能檢測到β-胡蘿卜素和蝦青素的鹵蟲或許采自富含β-胡蘿卜素及蝦青素食物源的環(huán)境。三產(chǎn)地初孵無節(jié)幼體角黃素含量較去殼卵大幅增加，而海膽酮含量變化不顯著，表明鹵蟲休眠卵在發(fā)育過程中可能存在一定的將其他類胡蘿卜素代謝合成角黃素的能力，這還有待進(jìn)一步研究。另一方面，三產(chǎn)地鹵蟲去殼卵和初孵無節(jié)幼體中類胡蘿卜素總量均表現(xiàn)為青海產(chǎn)鹵蟲小于內(nèi)蒙古和渤海灣產(chǎn)鹵蟲。這或許與三產(chǎn)地所處的海拔高度和緯度差異有關(guān)。青海處于青藏高原，海拔高度總體上大于內(nèi)蒙古和渤海灣；而內(nèi)蒙古所處的緯度又大于青海和渤海灣。通常海拔越高，紫外線輻射越強(qiáng)；緯度越高，紫外線輻射越弱。紫外線輻射強(qiáng)度會(huì)影響鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素含量的變化。Kumar 等[24]發(fā)現(xiàn)，鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素含量隨著紫外線照射時(shí)間的增加而降低，未被紫外線照射的對照組類胡蘿卜素含量較高，紫外線照射影響鹵蟲類胡蘿卜素含量的原因推測與紫外線輻射可導(dǎo)致硫胺素-二聚體的堿基對發(fā)生變化有關(guān)[22]。

Herring 等[23]提出了淡水枝角類體內(nèi)類胡蘿卜素的代謝路徑，淡水枝角類能將β-胡蘿卜素經(jīng)異隱黃素、海膽酮和角黃素這些中間產(chǎn)物代謝為蝦青素。Katayama 等[24]認(rèn)為，類胡蘿卜素在日本對蝦（Marsupenaeus japonicus）體內(nèi)有兩條代謝途徑，可以將β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)經(jīng)中間產(chǎn)物最終轉(zhuǎn)化為蝦青素。鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化代謝機(jī)制尚未完全清楚。尚沒有證據(jù)表明鹵蟲與其他甲殼動(dòng)物在類胡蘿卜素的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)方面存在差異。Hata 等[25]認(rèn)為，鹵蟲應(yīng)該會(huì)像其他甲殼類動(dòng)物一樣在性腺和卵中代謝類胡蘿卜素。本研究中，饑餓過程中所有產(chǎn)地鹵蟲體內(nèi)有且僅有角黃素和海膽酮兩種類胡蘿卜素含量發(fā)生了變化，此間也未有其他類胡蘿卜素產(chǎn)生，表明鹵蟲無節(jié)幼體在不攝食的情況下無法將海膽酮或角黃素轉(zhuǎn)化為其他類胡蘿卜素。結(jié)合前文提到的甲殼類動(dòng)物的代謝通路以及鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素種類，推測鹵蟲可能具有類似但不完整（不能轉(zhuǎn)化成蝦青素）的類胡蘿卜素代謝途徑，不具備玉米黃質(zhì)——蝦青素代謝途徑，其確切的代謝途徑仍有待于后續(xù)營養(yǎng)強(qiáng)化試驗(yàn)驗(yàn)證。三個(gè)產(chǎn)地鹵蟲無節(jié)幼體內(nèi)角黃素和海膽酮含量均隨著饑餓時(shí)間的延長而逐漸降低，饑餓48 h 后發(fā)現(xiàn)饑餓前類胡蘿卜素總量較低的青海鹵蟲無節(jié)幼體體內(nèi)角黃素及海膽酮含量均成為三個(gè)產(chǎn)地中最高，表明饑餓情況下青海鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素的消耗速率以及消耗量小于內(nèi)蒙古和渤海灣鹵蟲。已知甲殼類動(dòng)物貯能物質(zhì)的消耗優(yōu)先級(jí)與饑餓時(shí)間密切相關(guān)[26，27]，這可能是導(dǎo)致不同饑餓階段類胡蘿卜素消耗速率及消耗量不同的原因之一。

綜上所述，三產(chǎn)地的去殼卵及初孵無節(jié)幼體內(nèi)均不含有β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和蝦青素，僅含有角黃素和海膽酮。不同產(chǎn)地鹵蟲的類胡蘿卜素含量與其緯度和海拔高度有關(guān)，饑餓過程中三產(chǎn)地鹵蟲無節(jié)幼體角黃素和海膽酮的含量均隨饑餓時(shí)間的延長而降低。鹵蟲不能合成蝦青素，但可能存在β-胡蘿卜素——海膽酮——角黃素的代謝通路。