林敏婕　程修文　楊云聰　章明豪　蔡玉榮

摘 要： 以海藻酸鈉為殼材，透明質(zhì)酸鈉為囊材，苯硼酸接枝的絲素蛋白納米晶須為殼層增強(qiáng)相，采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備具有葡萄糖響應(yīng)性的增強(qiáng)型海藻酸鈉/透明質(zhì)酸鈉載藥微囊，并對微囊的形貌結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、葡萄糖響應(yīng)性及細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：采用同軸靜電紡絲技術(shù)可成功制備具有核殼結(jié)構(gòu)的海藻酸鈉/透明質(zhì)酸鈉微囊，添加絲素蛋白納米晶須可有效提高微囊的穩(wěn)定性和藥物包封率；絲素蛋白納米晶須的添加量為1.0 mg/mL時，微囊的穩(wěn)定性最佳，藥物負(fù)載量達(dá)32.56%，藥物緩釋時間可長達(dá)24 h，該微囊具有靈敏的葡萄糖響應(yīng)性和良好的生物相容性，是一種具有較好應(yīng)用潛能的糖尿病藥物載體。

關(guān)鍵詞： 絲素蛋白納米纖維晶須；苯硼酸；葡萄糖響應(yīng)；海藻酸鈉水凝膠；藥物緩釋

中圖分類號： TB34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1673-3851 （2023） 03-0228-09

引文格式：林敏婕，程修文，楊云聰，等. 苯硼酸響應(yīng)的增強(qiáng)型海藻酸鈉載藥微囊的制備與性能［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2023，49（2）：228-236.

Reference Format： LIN Minjie， CHENG Xiuwen， YANG Yuncong， et al. Preparation and properties of glucose-responsive drug-loaded calcium alginate microcapsules［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（2）：228-236.

Preparation and properties of glucose-responsive drug-loaded calcium alginate microcapsules

LIN Minjie， CHENG Xiuwen， YANG Yuncong， ZHANG Minghao， CAI Yurong

（School of Materials Science & Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract：? The enhanced sodium alginate/sodium hyaluronate microcapsules were prepared by coaxial electrospinning with sodium alginate as shell materials， sodium hyaluronate as the core material and silk fibroin nanowhiskers grafted by phenylboronic acid as the shell reinforcement phase. The morphology， stability， glucose responsiveness and cytotoxicity of the microcapsules were studied. The results show that the core-shell structured sodium alginate/sodium hyaluronate microcapsules can be successfully prepared by coaxial electrospinning， and the addition of silk fibroin nanowhiskers can effectively improve the stability and drug encapsulation rate of the microcapsules. When the dosage of silk fibroin nanowhiskers is 1.0 mg/mL， the stability of the microcapsules is the best， the drug loading efficiency reaches 32.56%， and the drug sustained release time can be prolonged to 24 h. As the microcapsules are sensitive to glucose and have good biocompatibility， they are a promising drug carrier for diabetes drugs.

Key words： silk fibroin nanowhiskers; phenylboronic acid; glucose-responsive; sodium alginate hydrogel; drug sustained release

0 引 言

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的代謝疾病，主要表現(xiàn)為長期高血糖，由糖尿病引起并發(fā)癥包括高血壓、眼部疾病、腎病、心腦血管疾病、皮膚感染和下肢損傷等。2019年，全球20～79歲的成年人估計(jì)有4.63億患有糖尿病，400多萬人死于糖尿?。?］；預(yù)計(jì)2045年糖尿病患者將達(dá)到6.93億人［2］。目前臨床使用較多的藥物有胰島素、促進(jìn)胰島素分泌藥物、胰島素增敏劑和酶靶點(diǎn)調(diào)節(jié)劑；其中，以鹽酸二甲雙胍（Metformin hydrochloride， MH）為代表的胰島素增敏劑，可增加葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)、增強(qiáng)外周組織的糖利用率、有效減少腸道對葡萄糖的吸收，且具有價(jià)格便宜等優(yōu)勢，成為許多糖尿病患者的首選藥物［3］。然而，MH直接服用存在利用度較低（50%～60%）、半衰期短且波動較大（0.9～2.6 h）的問題［4］，在臨床上需要大劑量多次用藥才能維持有效血藥濃度，但攝入過量容易引起乳酸中毒等并發(fā)癥，加劇患者的病情［5］。

為保證MH的有效性，減少副作用，需要設(shè)計(jì)一種有緩釋功能的載藥微囊。海藻酸鈉（Sodium alginate， SA）微球已用于MH緩釋，有效提高了藥物包封率和緩釋性能［6］。為保持血糖穩(wěn)定，載藥微囊需要在病人血糖升高后及時釋放藥物，須在微囊中加入葡萄糖響應(yīng)性結(jié)構(gòu)單元［7］。葡萄糖響應(yīng)性結(jié)構(gòu)單元將葡萄糖濃度檢測和藥物釋放結(jié)合在一起，在濃度較低的情況下緩慢釋放藥物，在高濃度下快速響應(yīng)，釋放更多藥物，有效維持血糖的正常濃度［8］。用作葡萄糖響應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元主要有葡萄糖氧化酶（GOx）、苯硼酸（PBA）及其衍生物和伴刀豆凝集素（Con A）3大類［8］。GOx和Con A為蛋白質(zhì)，存在易變性失活的問題，應(yīng)用受限［9］。苯硼酸是一種路易斯酸，易于修飾和改性，可以與含有鄰二醇的物質(zhì)（如葡萄糖）結(jié)合形成可逆的共價(jià)鍵［10］。苯硼酸在水溶液中存在電離平衡，有帶負(fù)電的親水離子和不帶電的疏水分子兩種形式；當(dāng)葡萄糖濃度升高時，帶負(fù)電的苯硼酸離子與葡萄糖結(jié)合，苯硼酸由疏水轉(zhuǎn)為親水而表現(xiàn)出葡萄糖響應(yīng)性，利用苯硼酸的這一特性可有效構(gòu)建葡萄糖響應(yīng)的載藥微囊［11］。

同軸靜電紡絲技術(shù)可以制備出核殼結(jié)構(gòu)微囊，可將藥物包埋在微囊中實(shí)現(xiàn)藥物的保護(hù)和緩釋［12］。SA的生物相容性和穩(wěn)定性較好，滴加入凝固浴中可制備成微囊，可以通過延長藥物作用于靶點(diǎn)的時間來提高藥效［13］。透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid， HA）作為生物體中廣泛存在的物質(zhì)，具有很好的生物親和性，可以有效保護(hù)藥物和人體細(xì)胞，降低感染的可能性［14］。絲素蛋白納米纖維（Silk nanowhiskers， SNWs）作為一種天然的高分子材料，具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，可以用于生物復(fù)合材料、抗菌材料、載物載體、組織學(xué)支架、醫(yī)學(xué)移植等。

本文利用同軸靜電紡絲技術(shù)，以SA為殼材，HA為囊材和MH為藥物模型，制備SA/HA微囊；在SA/HA微囊中添加SNWs制備得到更加穩(wěn)定、更高強(qiáng)度的SNWs-SA/HA微囊，并在SNWs上接枝PBA，制備得到具有葡萄糖響應(yīng)性的PBA-SNWs-SA/HA微囊；分析微囊對小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）的毒性，探究微囊的性能、藥物負(fù)載和釋放情況，以期獲得兼具緩釋和葡萄糖響應(yīng)功能且生物相容性良好的載藥微囊。

1 實(shí)驗(yàn)試劑與方法部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

蠶繭購于湖州新天絲生物技術(shù)有限公司，碳酸鈉（Na2CO3）、海藻酸鈉（（C6H7O6Na）n）、透明質(zhì)酸鈉（（C14H21NaNO11）n）、氯化鈣（CaCl2）、氫氧化鈉（NaOH）、尿素（CH4N2O）、鹽酸二甲雙胍（C4H12ClN5）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、氯化鈉（NaCl）、4-羧基苯硼酸（C7H7BO4）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （C8H17N3·HCl）（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（C4H5NO3）（NHS）、葡萄糖（C6H12O6）均購自上海阿拉丁生化有限公司，DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖溶液（pH值7.4）、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗混合液、胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）和CCK-8均購自杭州蘭堡海博生物技術(shù)有限公司。本文所有試劑均為分析純。

1.2 SA/HA微囊的制備

以0.01 mol/L的CaCl2溶液為凝固浴，在靜電紡絲機(jī)上利用同軸針頭制備具有核殼結(jié)構(gòu)的SA/HA微囊，其中主軸內(nèi)是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HA溶液，推速為0.0010 mm/min，副軸內(nèi)是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的SA溶液，推速為0.0250 mm/min，電壓為8.5 kV。

1.3 SNWs-SA/HA微囊的制備

將蠶繭剪成大小約為1×1 cm2，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的Na2CO3溶液中，其中蠶繭和Na2CO3溶液的質(zhì)量比為1∶100；煮沸1 h后撈出，用去離子水充分洗滌，除去蠶絲上未被完全溶解的絲膠，處理好的蠶絲放在50 ℃烘箱中烘干至恒重。SNWs制備方法參考Niu等［15］，具體步驟如下：稱取NaOH 6.48 g，尿素12.18 g，溶解在81.00 g的去離子水中，置于-20 ℃冰箱中預(yù)冷；4 h后稱取3 g烘干蠶絲分散到溶液中，懸浮液每12 h攪拌10 min，共3 d；將懸浮液裝入透析袋（MWCO=7 500 kDa）中透析3 d；最后將透析好的混合物在300 W的超聲粉碎機(jī)中30 min，以4 500 r/min離心20 min回收上層懸浮液，得到SNWs。將SNWs摻雜到SA溶液中，得到SNWs摻雜量在0～1.6 mg/mL（梯度設(shè)置：0.2 mg/mL）的1.5% SA溶液，參照1.2中方法制備得到SNWs-SA/HA微囊。

1.4 PBA-SNWs-SA/HA微囊的制備

稱取20 mg 4-羧基苯硼酸，通過超聲波分散到10 mL PBS緩沖溶液中，加入80 mg EDC和120 mg NHS，于37 ℃搖床上150 r/min振蕩15 min，快速離心，除去上清液；取20 mg SNWs加入10 mL PBS緩沖溶液后，加入活化后的4-羧基苯硼酸，于37 ℃搖床150 r/min振蕩過夜，離心洗滌得到PBA-SNWs；將PBA-SNWs摻雜到SA溶液中，獲得PBA-SNWs摻雜量為1.0 mg/mL的1.5% SA溶液，參照1.2中方法制備得到PBA-SNWs-SA/HA微囊。

1.5 載藥微囊的制備

在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HA溶液中添加MH，其中MH在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，參照1.2中方法制備得到SA/HA、SNWs-SA/HA和PBA-SNWs-SA/HA載藥微囊。

1.6 性能表征

1.6.1 理化性質(zhì)

利用光學(xué)顯微鏡（E100，日本Nikon）拍攝微囊的形貌；利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Ultra 55，德國Carl Zeiss）分析SNWs的結(jié)構(gòu)形貌；利用傅里葉紅外光譜（Nicolet 5700，美國Thermo Electron）分析PBA在SNWs上的接枝情況，測試范圍為500～4 000 cm-1。

1.6.2 微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性測試

利用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值為7.2、7.4和7.6的PBS緩沖液；向不同pH值的PBS緩沖溶液中放入SA/HA微囊、SNWs-SA/HA微囊、PBA-SNWs-SA/HA微囊各100顆，于37 ℃搖床150 r/min振蕩，在6、12、24 h和48 h用顯微鏡觀察微囊表面囊膜的完整性，計(jì)算破損率；測試微囊的化學(xué)穩(wěn)定性，具體方法參考文獻(xiàn)［16］，每組設(shè)置3個平行樣。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，于37 ℃搖床150 r/min振蕩72 h，通過顯微鏡觀察微囊表面囊膜的完整性，根據(jù)式（1）計(jì)算破損率：

RB/%=（N破損/N總）×100（1）

其中：RB為微囊破損率；N破損為微囊的破損個數(shù)；N總為微囊總數(shù)。并測試微囊的機(jī)械穩(wěn)定性，方法參考文獻(xiàn)［16］，每組設(shè)置3個平行樣。

1.6.3 微囊的藥物包封率和緩釋分析

利用紫外分光光度計(jì)（UH4150，日本日立）測定1.0～10.0 μg/mL的MH溶液在233 nm處的吸光度，得到MH的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擬合方程。具體方法如下：取分別制備了100顆SA/HA微囊、SNWs-SA/HA微囊的CaCl2溶液，測試CaCl2溶液在233 nm處的吸光度；由MH標(biāo)準(zhǔn)曲線確定CaCl2溶液中MH的濃度C非荷載，將制備得到的100顆SA/HA微囊、SNWs-SA/HA微囊分別加入去離子水，置于300 W超聲粉碎機(jī)下超聲10 min，離心取上清液，測試上清液在233 nm處的吸，具體方法參考文獻(xiàn)［17］，由MH標(biāo)準(zhǔn)曲線確定微囊中MH的濃度為C荷載，根據(jù)式（2）計(jì)算MH的包封率：

EC/%=【C荷載/C（荷載+C非荷載）】×100（2）

其中：EC為MH的包封率；C荷載為微囊中的MH的濃度；C非荷載為CaCl2溶液中MH的濃度。

將100顆SA/HA微囊、SNWs-SA/HA微囊分別置于30 mL pH值7.4的PBS緩沖溶液中，在37 ℃搖床上150 r/min進(jìn)行振蕩，在1、2、3、4、5、12 h和24 h時取上清液50 μL，并補(bǔ)加50 μL PBS緩沖溶液，測試上清液在233 nm處的吸光度，由MH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度，得到藥物的累計(jì)釋放率，每組設(shè)置3個平行樣。

1.6.4 微囊的葡萄糖響應(yīng)性及藥物緩釋

將SA/HA微囊、SNWs-SA/HA微囊、PBA-SNWs-SA/HA微囊放入0、1、2 mg/mL和3 mg/mL葡萄糖濃度的PBS緩沖溶液中，每隔30 min在顯微鏡下觀察微囊的尺寸變化，每組設(shè)置3個平行樣。將100顆載藥后的SA/HA微囊、SNWs-SA/HA微囊、PBA-SNWs-SA/HA微囊放入0、1、2 mg/mL和3 mg/mL葡萄糖濃度的30 mL pH值7.4的PBS緩沖溶液中，于37 ℃搖床上150 r/min進(jìn)行振蕩，在1、2、3、4、5、12 h和24 h時取上清液50 μL，并補(bǔ)加50 μL PBS緩沖溶液，測試上清液在233 nm處的吸光度，由MH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度，得到藥物的累計(jì)釋放率。

1.6.5 細(xì)胞毒性評價(jià)

取SA/HA微囊、SNWs-SA/HA微囊、PBA-SNWs-SA/HA微囊各100個，分別放入10 mL完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗溶液的體積比為100∶10∶1）中，在37 ℃培養(yǎng)箱中浸泡72 h，回收上清液作為微囊的浸出液。

以L929為細(xì)胞模型，將處于指數(shù)生長期的L929細(xì)胞接種在96孔板中，加入完全培養(yǎng)基100 μL/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；細(xì)胞貼壁完成后，棄去原培養(yǎng)液，向孔板中分別加入各微囊的浸出液，各100 μL/孔，每組設(shè)置6個復(fù)孔，并設(shè)置陽性對照組（DMSO）和陰性對照組（完全培養(yǎng)基），在培養(yǎng)箱中孵育24 h；最后，向孔中滴加10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h后取出，利用酶標(biāo)儀測試孔板在450 nm處的吸光度。根據(jù)式（3）計(jì)算細(xì)胞的存活率：

CV/%=（OD實(shí)驗(yàn)/OD對照）×100（3）

其中：CV為細(xì)胞的存活率；OD實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)組在450 nm處的吸光度；OD對照為陰性對照組在450 nm處的吸光度。

利用Prism軟件對SA/HA組、SNWs-SA/HA組、PBA-SNWs/HA組和陰性對照組進(jìn)行p值分析。當(dāng)p<0.05時，說明數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異，而當(dāng)p值>0.05時，說明數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 SNWs和PBA-SNWs的結(jié)構(gòu)表征

利用SEM觀察制備得到的SNWs微觀形貌，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，SNWs的尺寸較為均勻，長度集中分布在500～1 000 nm，且分散性良好。納米尺度及良好的分散性有利于SNWs在作為摻雜物時彌補(bǔ)基體的機(jī)械性能缺陷，提高材料的力學(xué)強(qiáng)度；SNWs摻雜有利于微囊在復(fù)雜生理環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［18］；作為一種天然蛋白晶須，SNWs的兩端存在大量裸露的羧基和氨基，有利于后續(xù)PBA的接枝［19］。

利用EDC、NHS對4-羧基苯硼酸進(jìn)行活化，使4-羧基苯硼酸的羧基端與SNWs的氨基端發(fā)生酰胺化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)接枝［20］。為實(shí)現(xiàn)葡萄糖響應(yīng)，本文在SNWs上接枝PBA。利用FTIR對接枝后SNWs產(chǎn)物進(jìn)行紅外譜圖分析，結(jié)果如圖2所示。圖2表明：接枝PBA后的SNWs基本保留了SNWs的原有結(jié)構(gòu)，與SNWs相比，PBA-SNWs在3 296 cm-1處的峰減弱，3 296 cm-1是N—H鍵的伸縮振動吸收帶是由于4-羧基苯硼酸和SNWs的氨基端發(fā)生反應(yīng)，因此接枝后的SNWs在3 296 cm-1的峰幾乎消失［21］；在PBA-SNWs的FTIR譜圖上，2 975 cm-1對應(yīng)的是酰胺鍵的伸縮振動，1 517 cm-1和1 630 cm-1對應(yīng)的是苯環(huán)的骨架震動，1 385 cm-1對應(yīng)的是B—O鍵的伸縮振動，879cm-1處的峰說明苯環(huán)發(fā)生了單邊對位二取代，進(jìn)一步證明了PBA已經(jīng)通過酰胺化反應(yīng)成功接枝到SNWs上。

2.2 SA/HA微囊外觀形態(tài)

SA/HA微囊形態(tài)如圖3所示。從圖3可以看出，微囊呈現(xiàn)良好的分散性，直徑約為500 μm，圓整度、尺寸均勻性良好，具有典型的核殼結(jié)構(gòu)，說明利用同軸靜電紡絲技術(shù)可以方便地制備具有核殼結(jié)構(gòu)的微囊。

2.3 SNWs-SA/HA微囊的外觀形態(tài)

為了增加SA/HA微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，向微囊的囊材中添加SNWs實(shí)現(xiàn)微囊的增強(qiáng)增韌［22］，圖4為不同SNWs摻雜量的SNWs-SA/HA微囊的形貌圖。由圖4可知：隨著SNWs摻雜量的增加，SNWs-SA/HA微囊的顏色逐漸加深，微囊的直徑呈現(xiàn)先增大后略有減小的趨勢；當(dāng)SNWs的摻雜量 為1.0 mg/mL，微囊直徑達(dá)到最大，為600 μm；繼續(xù)增加SNWs的摻雜量，微囊的直徑略有減?。划?dāng)SNWs的摻雜量為1.6 mg/mL時，微囊的直徑縮小至約為530 μm，其原因是SNWs作為增強(qiáng)相，具有良好的強(qiáng)度，并與SA間有很好的親和性；SNWs在SA溶液里均勻的分散，可使溶質(zhì)之間相互作用力增加，溶液的黏度變大，液滴在同軸針頭聚集，導(dǎo)致制備得到的微囊直徑變大；當(dāng)SNWs摻雜太多時，溶液中的納米晶須會分散不均勻，晶須間甚至?xí)p繞連接，導(dǎo)致了微囊的體積收縮。

2.4 SNWs-SA/HA微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

人體內(nèi)存在滲透壓和pH值波動（pH值7.35～7.45），環(huán)境的變化會影響微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［23-24］，本文分析離子強(qiáng)度對不同晶須摻雜量的微囊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，微囊的破損率如圖5（a）所示。在0.9% NaCl溶液中浸泡72 h后，微囊出現(xiàn)了破損。隨著SA/HA微囊中SNWs摻雜量的提高，微囊破損率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；當(dāng)SNWs摻雜量達(dá)到1.0 mg/mL時，微囊破損率最低，為7%。隨著SNWs摻雜量的繼續(xù)增加，微囊破損率增加（見圖5（a））。在不同pH條件下微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性如圖5（b）—（d）所示。由圖6（b）—（d）可知：隨著時間的延長，所有微囊的破損率都呈現(xiàn)升高趨勢，其中未摻雜SNWs的SA/HA微囊的破損率受pH值的影響最大，隨著環(huán)境pH值由7.2增加到7.6，微囊破損率由43%上升至73%；SNWs的摻雜有助于提高微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；當(dāng)溶液pH值7.2時，隨著SNWs在微囊中的摻雜量提升，微囊的破損率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，當(dāng)SNWs的摻雜量為1.0 mg/mL時，微囊的破損率最低，為19%，對比沒有摻雜SNWs時43%的微囊破損率，微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有明顯提升。綜合微囊的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性測試可知，當(dāng)SNWs摻雜量為1.0 mg/mL時，SA/HA微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最佳。

2.5 SNWs-SA/HA微囊的藥物包封和緩釋

選取SA/HA微囊和SNWs摻雜量為1.0 mg/mL的SNWs-SA/HA微囊進(jìn)行藥物包封和緩釋測定，SA/HA微囊和SNWs-SA/HA微囊的藥物包封率分別為11.58%和32.56%，說明SNWs的添加有利于藥物的包封。本文進(jìn)一步分析SA/HA和SNWs-SA/HA微囊（SNWs摻雜量為1.0 mg/mL）的藥物釋放動力學(xué)，結(jié)果如圖6所示。由圖6表明：SA/HA微囊中，藥物釋放速度很快，在5 h內(nèi)藥物的累計(jì)釋放率已經(jīng)達(dá)到了90.7%，并在后續(xù)基本維持不變；由于滲透作用和SA/HA微囊溶脹破損共同引起的藥物快速釋放，相較于MH直接在人體內(nèi)使用時的釋放周期為0.9～2.6 h［4］，SA/HA微囊在一定程度上實(shí)現(xiàn)了MH緩釋，但釋放時間仍然較短；在SNWs-SA/HA微囊中，MH的釋放可以分為2個階段，分別為快速釋放階段和慢速釋放階段。前5 h為藥物的快速釋放階段，藥物的累計(jì)釋放率達(dá)到25.55%；隨后，微囊釋藥進(jìn)入慢速階段，到24 h時，藥物的累計(jì)釋放率達(dá)到43.15%，說明SNWs-SA/HA微囊具有很好的藥物控釋功能。以上結(jié)果顯示：微囊的藥物釋放速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SA/HA微囊的藥物釋放速率，是由于SNWs的補(bǔ)強(qiáng)增韌作用賦予了微囊較好的強(qiáng)度和藥物保護(hù)能力，SNWs中存在的大量氫鍵對藥物也有一定的吸附作用，阻止藥物提前外泄。因此，微囊的核殼結(jié)構(gòu)以及SNWs的添加有助于實(shí)現(xiàn)微囊的藥物緩釋。

2.6 PBA-SNWs-SA/HA微囊的葡萄糖響應(yīng)

為使SNWs-SA/HA微囊具有葡萄糖響應(yīng)性，在SNWs上接枝了PBA，當(dāng)葡萄糖濃度上升時，苯硼酸與葡萄糖結(jié)合，苯硼酸由疏水性轉(zhuǎn)為親水性，促使微囊膨脹，從而引發(fā)藥物釋放（見圖7）。

微囊直徑和藥物釋放在不同葡萄糖濃度中的變化情形如圖8所示。由圖8（a）可知，隨著在溶液中浸泡時間的延長，微囊直徑尺寸呈現(xiàn)單調(diào)增加趨勢，且隨著溶液中葡萄糖濃度的增加，膠囊尺寸增加的程度變大，可以證明微囊對葡萄糖的響應(yīng)性。微囊的藥物累計(jì)釋放趨勢與微囊的直徑變化趨勢相似，即隨著浸泡時間的延長以及浸泡液中葡萄糖濃度的增加，藥物釋放速度變快（見圖8（b）），其原因可能是PBA可以與溶液中的糖類物質(zhì)可逆結(jié)合，在可逆結(jié)合過程中，SNWs網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)的膨脹［25］，促使微囊的體積變大，微囊壁的通透性提升，進(jìn)而加速M(fèi)H的釋放。以上結(jié)果說明PBA-SNWs-SA/HA微囊具有對葡萄糖響應(yīng)性能，PBA-SNWs-SA/HA微囊在響應(yīng)性藥物載體方面具有較好的應(yīng)用潛能。

2.7 微囊的細(xì)胞毒性評價(jià)

以L929為細(xì)胞模型，利用浸出液法測試各微囊的浸出液對細(xì)胞生長和增殖的影響，結(jié)果如圖9所示。圖9顯示：SA/HA微囊浸出液的細(xì)胞活力高達(dá)98.27%，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，與SA/HA微囊相比，SNWs-SA/HA及PBA-SNWs-SA/HA微囊浸出液的細(xì)胞活性與SA/HA微囊差異不明顯，說明這兩種微囊均具有良好的細(xì)胞相容性。本文對樣品細(xì)胞毒性評價(jià)結(jié)果進(jìn)行了p值分析：SA/HA、SNWs-SA/HA、PBA-SNWs/HA微囊組與陰性對照組的p值分別為0.12、0.58、0.75，均大于0.05，說明數(shù)據(jù)之間不存在顯著性差異，即幾組微囊浸出液對細(xì)胞的生長和增殖不存在明顯毒性；而陽性對照組與陰性對照組的p值小于0.0001，具有顯著性差異，說明細(xì)胞基本被DMSO殺死。以上結(jié)果表明，PBA-SNWs-SA/HA微囊對細(xì)胞生長和增殖的影響很小，具有良好的生物相容性。

3 結(jié) 論

本文利用同軸靜電紡絲技術(shù)制備核殼結(jié)構(gòu)的SA/HA微囊，向SA/HA微囊中添加SNWs以增強(qiáng)微囊的強(qiáng)度，通過在SNWs上接枝PBA賦予微囊葡萄糖響應(yīng)性，探究了微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、載藥能力、藥物緩釋能力和葡萄糖響應(yīng)情況，并對微囊的細(xì)胞毒性進(jìn)行了體外評價(jià)，結(jié)論如下：

a） 利用同軸靜電紡絲技術(shù)可成功制備核殼結(jié)構(gòu)的SA/HA微囊，方法簡單，可操作性強(qiáng)；

b） 在SA/HA微囊殼層中添加SNWs可以有效提升微囊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和藥物包封率，其中，當(dāng)SNWs在殼層中添加比例為1.0 mg/mL時，增強(qiáng)效果最好，藥物負(fù)載量可達(dá)32.56%；

c） PBA-SNWs-SA/HA微囊具有較好的葡萄糖響應(yīng)性和藥物緩釋能力；

d） PBA-SNWs-SA/HA微囊具有較低生物毒性、較好應(yīng)用潛力的藥物遞送系統(tǒng)。

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（責(zé)任編輯：廖乾生）

收稿日期： 2022-03-02網(wǎng)絡(luò)出版日期： 網(wǎng)絡(luò)出版日期2022-10-08

基金項(xiàng)目： 浙江省國際科技合作項(xiàng)目-雙邊產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022C04027）

作者簡介： 林敏婕（1997- ），女，浙江溫州人，碩士研究生，主要從事生物醫(yī)用材料的研究。

通信作者： 蔡玉榮，E-mail：caiyr@zstu.edu.cn