牛知音，姜 卓，龔商羽

(1.錦州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心(錦州市植物保護(hù)中心)，遼寧 錦州 121000；2.大連市金普新區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116199；3.錦州市動物疫病預(yù)防控制中心(錦州市動物衛(wèi)生監(jiān)督中心)，遼寧 錦州 121000)

最近發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒3 型(PCV3) 與其他三種豬圓環(huán)病毒PCV1、PCV2 和PCV4 一起屬于圓環(huán)病毒科的圓環(huán)病毒屬。據(jù)報道，PCV3 可以感染豬、野豬和其他幾種中間宿主，導(dǎo)致受影響動物的單個或多個感染。PCV3 感染可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、多系統(tǒng)炎癥和免疫反應(yīng)。到目前為止，PCV3 感染，以及由PCV3 引起的疾病，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)的許多養(yǎng)豬場中被報道，并且陽性率很高，這表明該病毒可能是養(yǎng)豬業(yè)中的另一種重要病原體。因此，了解遼寧地區(qū)豬PCV3 遺傳變異情況，為遼寧地區(qū)PCV3 的疫苗研究、免疫防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2019 年5 月至2020 年5 月，從遼寧省部分地區(qū)采集具有腹瀉、呼吸或繁殖障礙等臨床癥狀的仔豬、母豬或死胎中收集了435 份組織標(biāo)本，包括淋巴結(jié)，脾臟，腎臟和肺臟。所有樣品均送至昌圖縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心實驗室進(jìn)行病原檢測。

1.2 主要試劑配方

1.2.1 瓊脂糖凝膠電泳用溶液 50xTAE 電泳緩沖液: 分別稱量 Tris 堿24.2 g，EDTA 1.46 g，冰乙酸5.71 mL，蒸餾水定容至100 mL，常溫避光保存。

1.2.2 Top10 (上海唯地生物DL1010) 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化所需液體0.1 mol/L 氯化鈣溶液: 取0.2g 的無水CaCh，用蒸餾水定容至200 mL，再用濃HCL 調(diào)節(jié)pH ＝6.5 后，高壓滅菌。

氨芐青霉素(Amp) 貯存液(100 mg/mL):200 mL 滅菌去離子水完全溶解20 g Amp 粉劑，無菌處理后，-20 ℃條件下儲存。

LB 培養(yǎng)基: 分別稱量1g 的Tryptone，0.5g 的Yeast extract 和1g 的NaCb 溶于80 mL的去離子水中，用10 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 7.4，定容到100 mL，高壓滅菌，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

Amp/LB 培養(yǎng)基 (100 μg/mL): 按1 ∶1 000比例向高壓后的液體LB 培養(yǎng)基中加入Amp 貯存液，混勻后4 ℃保存。

1.3 熒光PCR 檢測

1.3.1 樣品前處理 每份組織樣品剪取2 ～3 g，放入2 mL 圓底離心管中，每個離心管中加入5 cm 直徑鋼珠一個，放入Thermo 組織勻漿機(jī)中5 min。將研磨好的組織勻漿反復(fù)凍融3 次，12 000 r/min，離心10 min，收集上清液裝入1.5 mL 離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病毒DNA 提取 使用磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒提取組織樣品中的DNA/RNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。提取的DNA 或RNA，用封口膜封好并保存于-20 ℃或-80 ℃。

1.3.3 熒光PCR 檢測 用TaqMan 的實時熒光PCR 檢測試劑盒(上海之江) 檢測PCV3 病毒DNA。此外，其他病原體包括豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV) 使用商業(yè)化的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 檢測試劑盒或逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT - PCR) 檢測試劑盒 (世紀(jì)元亨)檢測。

1.4 cap 基因序列分析

1.4.1 全基因引物設(shè)計與合成 基于Gen-Bank 中已發(fā)布的PCV3 分離株基因組進(jìn)行多序列比對，用DNA Star 與Primer6.0 軟件設(shè)計了1 對引物。引物 PCV3 - F (ATGAGACACAGAGCTATATTCAG)、PCV3 - R (TTCACTTAGAGAACGGACTTG) 用于擴(kuò)增PCV3 完整的cap 基因組序列。引物由上海生工合成。合成的引物室溫12 000 轉(zhuǎn)離心5 min 后，用RNase free ddH2O 溶解為10 gmol/L 使用液備用。

1.4.2 樣品總DNA 提取 對樣品重新進(jìn)行總DNA 提取，進(jìn)行PCR 檢測。

1.4.3 目的基因序列擴(kuò)增 以1.3.2 步驟中提取的總DNA 為模板，使用全基因序列引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)20 μL 體系如下: 模板2 μL，Taq Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，RNase-Free dd H2O 6 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)程序如下: 預(yù)反應(yīng)95 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)； 延伸72 ℃8 min。

1.4.4 全基因序列PCR 產(chǎn)物純化回收 操作步驟參照SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒(B518131) (上海生工)。

1.4.5 目的基因與克隆載體連接 將1.3.3中回收純化后的PCR 產(chǎn)物分別與pUC -18T 載體(TAKARA 6011) 連接。建立的連接體系(10 μL) 如下:

連接反應(yīng)體系:

16 ℃連接，前天17 點到第二天14 點。

1.4.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 ①100 L 感受態(tài)細(xì)胞(上海唯地生物DL1010)，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。②加入10L 連接液，輕輕混勻，冰上放置30 min。③42 ℃水浴熱激60 s。冰上放置10 ～15 min。④加400 L LB 培養(yǎng)基，37 ℃220 rpm 振蕩培養(yǎng)1 小時。⑤室溫下4 000 rpm 離心5 分鐘，用槍頭吸掉400 L 上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮。⑥將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20 L 100 mmoL IPTG 和100 L 20 mg/mL X-gal 涂布的含有氨芐抗生素的平板上，倒置培養(yǎng)過夜。對菌液進(jìn)行PCR檢測: 將PCR 檢測為陽性的菌液送往測序公司進(jìn)行序列測定。

1.4.7 PCV3cap 基因序列分析 將測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 比對，確定基因序列為正確序列后，將序列與從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載的參考序列進(jìn)行序列分析。使用MEGA6 程序中的最大似然法(10 000 次重復(fù))構(gòu)建PCV3 cap 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用DNAStar 中的Megaligement 進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV3 混合感染情況

對PCV3 混合感染情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)PCV3 與其他病原體存在2 種病感染和3 種病原混合感染。PCV3 與PCV2、PRV、PEDV、PPV、PRRSV 和TGEV 的兩種病原混合感染率分別為14.43% (14/97)、7.22% (7/97)、7.22% (7/97)、5.15% (5/97)、2.06%(2/97) 和2.06% (2/97)。3 種病原混合感染中，PCV3、PCV2 和PPV 的合并感染率較高，為10.31% (10/97)。樣本中PCV3 的單病原感染率為17.53% (17/97)。以上結(jié)果進(jìn)一步顯示了PCV3 對生豬養(yǎng)殖業(yè)的潛在威脅(表1)。

表1 不同臨床癥狀中不同病原混合感染情況

2.2 PCV3 cap 基因序列分析

從檢測為PCV3 陽性的病料中，選擇部分材料進(jìn)行PCV3 cap 基因擴(kuò)增和序列測定。經(jīng)過擴(kuò)增和測序比對，共獲得了3 條PCV3 cap基因序列。從GenBank 下載了17 條具有代表性的國內(nèi)外的PCV3 cap 基因組序列，借助MEGA 6 軟件中的最大似然法(10 000 次重復(fù)引導(dǎo)) 構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖1)。Cap 基因序列的比對結(jié)果顯示，本試驗獲得的3 條PCV3完整Cap 基因全長650bp，沒有發(fā)生堿基的缺失或插入。PCV3 -2 和PCV3 -3 為一個分支，PCV3 -1 作為一個獨(dú)立分支，他們?nèi)咧g親緣關(guān)系很近，說明近年遼寧地區(qū)PCV3 毒株存在一種新的進(jìn)化方向。

圖1 PCV3 cap 全基因序列進(jìn)化樹PCV1、PCV2、PCV3 表示本實驗獲得的毒株

2.3 PCV3 cap 基因同源性分析

對3 株P(guān)CV3 分離株及17 條下載的參考毒株用DNAStar 軟件中的MegAlignment 軟件進(jìn)行同源性分析(圖2)。發(fā)現(xiàn)3 株P(guān)CV3 核苷酸序列的同源性為98.84% ～99.5%，與GeneBank下載的17 個參考毒株的核苷酸同源性為90.9% ～99.8%。PCV3 -2、PCV3 -3 序列與參考序列MW089581 的同源性最低(90.9%)，PCV3 -2、PCV3 -3 序列與PCV3 -1 序列的同源性最高(99.8%) PCV3 的比對結(jié)果較PCV2來說同源性更高，說明變異程度較低，更加保守。

圖2 PCV3 cap 基因序列同源性比較

3 小結(jié)與展望

PCV3 感染可能與生殖障礙、呼吸系統(tǒng)疾病和多器官炎癥密切相關(guān)。與對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害的PCV2 相似，PCV3 感染發(fā)生在豬和野豬以及眾多中間宿主中，導(dǎo)致水平和垂直傳播。值得注意的是，據(jù)報道該病毒可以感染經(jīng)產(chǎn)母豬和活產(chǎn)仔豬，表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀或亞臨床癥狀，表明該病毒對養(yǎng)豬業(yè)也有潛在的危害。因此，我們應(yīng)該繼續(xù)密切監(jiān)測PCV3 的流行和與其他豬病原體的混合感染，以及疾病表現(xiàn)的共同因素。應(yīng)持續(xù)跟蹤PCV3 優(yōu)勢毒株的遺傳多樣性和分子流行病學(xué)的動態(tài)變化。此外，最近有研究證明了使用原代豬腎細(xì)胞成功分離PCV3。然而，有限的病毒培養(yǎng)細(xì)胞限制了病毒的體外繁殖和研究。因此，通過反向遺傳學(xué)可能為研究PCV3 的致病機(jī)制和防控該疾病提供有用的信息。