鐘睦琪 李凱遠(yuǎn) 王 雪 劉甜甜,3 楊 明,3 郝智慧*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院,山東 青島 266109;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,北京 100193;3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,烏魯木齊 830099)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬,單股正鏈RNA病毒,全長約28 ku[1]。編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、E、M、N)、16種非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1-nsp16)和1個輔助蛋白ORF3[2]。PEDV通過糞口傳播并在小腸絨毛細(xì)胞中感染和復(fù)制[3],引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和發(fā)燒等癥狀[4]。自上世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)以來,PEDV以極高的傳播速度迅速席卷全球,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。2010年發(fā)現(xiàn)的PEDV變異株可引發(fā)新生仔豬100%的發(fā)病率及80%～100%的死亡率[6-7],并且極易與其他冠狀病毒(如豬傳染性胃腸炎病毒)混合感染[8],口服及注射疫苗效果甚微[9],因此,迫切需要開發(fā)新藥物來抵御PEDV的傳播。

中藥在抗病毒方面具有良好的功效。大量研究證明中藥提取物可通過多種途徑抑制病毒感染。Tang等[10]發(fā)現(xiàn)紫蘇葉提取物通過滅活病毒粒子抑制SARS-CoV-2復(fù)制,與抗病毒藥瑞德西韋聯(lián)合使用表現(xiàn)加成增效作用。Cho等[11]發(fā)現(xiàn)淫羊藿水提取物在體內(nèi)體外均具有良好的抗PEDV作用。Cao等[12]證明油茶葉水提取物可通過抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來抑制PEDV復(fù)制,油茶葉水提物在濃度≥500 μg/mL時可抑制PEDV的復(fù)制?？傊?中藥提取物具有良好的抗病毒功效,可通過多種途徑抑制病毒感染,因此在抗PEDV方面具有廣闊的研究前景。

澤漆(EuphorbiahelioscopiaL.)是大戟科一年生草本植物,廣泛分布于我國除新疆、西藏以外的地區(qū),有清熱、祛痰、利尿和消腫之效[13]。以澤漆為主要成分配伍而成的澤漆湯具有清熱解咳的功效,在我國被廣泛使用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),澤漆還具有抗腫瘤[14]、抗菌[15]、抗氧化[16]、殺蟲[17]、抗炎等多種作用[18]。同時,研究發(fā)現(xiàn)澤漆還具有抗病毒活性。周廣生[19]研究發(fā)現(xiàn)澤漆注射液具有抗新城疫病毒的作用,可顯著降低感染新城疫病毒的雞胚死亡率,抗病毒效果優(yōu)于金剛烷胺。另外,澤漆水煎劑具有體外抗單純皰疹病毒的作用[20],但是澤漆對于抗PEDV的作用尚未有相關(guān)研究,而且提取物使用的劑量越大在生產(chǎn)中投入的成本越高,在臨床上的生物安全性越難評估。而澤漆水提物價格低廉,細(xì)胞毒性相對較高,在抗病毒研究中使用的劑量更低。因此,本研究探究了不同濃度的澤漆提取物體外抑制PEDV的作用和對PEDV復(fù)制的影響,以期挖掘澤漆在抗PEDV方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗毒株與細(xì)胞系

豬流行性腹瀉病毒(CV777株,GenBank AF353511)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero CCL-81)由本研究室保存,用含1%雙抗、10% FBS的高糖 DMEM 培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗試劑

澤漆干燥全草由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心提供。鼠源PEDV-N蛋白單克隆抗體購于Medgene Labs公司;鼠源GAPDH單克隆抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;山羊抗鼠/兔 IgG-HRP購于艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、ECL發(fā)光液購于美國MCE公司;利巴韋林(Ribavirin,Rib)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1澤漆水提取物制備

準(zhǔn)確稱量澤漆藥材20 g,粉碎后過60目篩,澤漆細(xì)粉與蒸餾水按照料液1∶9混合,浸泡30 min。加熱回流3次,每次2 h,濃縮為50 mL提取液(0.400 g/mL)。經(jīng)冷凍干燥,獲得5.283 g水提物凍干粉末。精確稱量20 mg凍干粉末用10 mL蒸餾水溶解配置為2 000 μg/mL的母液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后于-20 ℃保存。

1.3.2澤漆水提取物對細(xì)胞的毒性測定

Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,密度為5×104個/mL。細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后加入不同濃度(125、250、500、1 000和2 000 μg/mL)的澤漆水提物,分別在12、24和36 h時添加CCK-8試劑,繼續(xù)孵育1 h后測定450 nm處的吸光度并計算各組細(xì)胞存活率,并依據(jù)GB/T 16886—5中細(xì)胞毒性的判定標(biāo)準(zhǔn)(細(xì)胞活力<空白組70%),判定澤漆水提物有無細(xì)胞毒性。

1.3.3RT-qPCR法檢測澤漆水提物對PEDV-NmRNA表達(dá)量的影響

Vero細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,密度為2.5×105個/mL。將不同濃度的澤漆水提物(62.5、125、250和500 μg/mL)與PEDV(MOI=0.01)在37 ℃下共同孵育2 h,棄去病毒藥物混合液,加入澤漆水提取物繼續(xù)孵育至24 h。使用Trizol試劑提取Vero細(xì)胞中的RNA,并用Nanodrop檢測其質(zhì)量濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

反應(yīng)條件:2×Taq Pro Universal SYBER qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,DEPC水補(bǔ)齊總體系為20 μL。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃持續(xù)變性10 s,60 ℃退火延伸 30 s,共40個循環(huán)。

1.3.4澤漆水提物對PEDV病毒滴度的影響

Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,密度為5×104個/mL。藥物與病毒處理方法同1.3.3,24 h后收集細(xì)胞上清液。將細(xì)胞上清液依次10倍稀釋為10-1～10-88個梯度后加入96孔板內(nèi)(每孔100 μL),37 ℃孵育72 h后通過間接免疫熒光觀察PEDV感染情況,病毒滴度由Reed-Muench法計算得出。

1.3.5Western Blot檢測澤漆水提物對PEDV-N蛋白表達(dá)的影響

Vero細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,密度為2.5×105個/mL。藥物與病毒處理方法同1.3.3,細(xì)胞使用Western IP裂解液裂解30 min后于12 000 r/min離心15 min。上清液與Protein Loading Buffer混勻,在95 ℃金屬浴變性10 min后獲得蛋白樣品。蛋白質(zhì)用10% SDS-PAGE分離,將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白濕轉(zhuǎn)于PVDF膜上,使用5% 脫脂牛奶在37 ℃下孵育1.5 h。TBST清洗3次后,分別與鼠源PEDV-N蛋白單克隆抗體(1∶1 000)、鼠源GAPDH單克隆抗體(1∶8 000)4 ℃過夜孵育。TBST清洗3次,再加入IgG-HRP(1∶5 000)常溫孵育1 h。使用ECL發(fā)光液檢測蛋白免疫印跡反應(yīng)并通過Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3.6間接免疫熒光法檢測澤漆水提物對PEDV病毒感染的影響

Vero細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,密度為1.5×105個/mL。藥物與病毒處理方法同1.3.3,細(xì)胞于4%多聚甲醛溶液中固定15 min,PBS清洗3次。使用0.3% Triton X-100對細(xì)胞處理10 min,并于3%牛血清白蛋白溶液中常溫封閉1 h。細(xì)胞在2%明膠稀釋的1∶1 000的鼠源PEDV-N蛋白單克隆抗體中4 ℃孵育過夜,PBST清洗3次后與山羊抗鼠IgG-FITC在37 ℃孵育1 h。在PBST中洗滌3次后,使用DAPI染色5 min后于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7澤漆水提物預(yù)防給藥對PEDV-N表達(dá)的影響

將不同濃度的澤漆水提物(125、250和500 μg/mL)和陽性藥物Ribavirin(80 μg/mL)在37 ℃條件下與Vero細(xì)胞共孵育2 h,棄掉藥液。Vero細(xì)胞接種PEDV(MOI=0.01)37 ℃孵育2 h,棄掉病毒液,補(bǔ)充病毒維持液37 ℃下孵育至24 h,收集蛋白進(jìn)行Western Blot檢測。

1.3.8澤漆水提物對PEDV復(fù)制周期各個階段PEDV-N表達(dá)的影響

1.3.8.1澤漆水提物對PEDV吸附階段PEDV-N表達(dá)的影響

將不同濃度的澤漆水提物(125、250和500 μg/mL)和陽性藥物Ribavirin(80 μg/mL)分別與PEDV(MOI=0.01)混合后感染細(xì)胞,在4 ℃孵育1 h,棄掉病毒藥物混合液,補(bǔ)充病毒維持液37 ℃孵育24 h,收集蛋白進(jìn)行Western Blot檢測。

1.3.8.2澤漆水提物對PEDV入侵階段PEDV-N表達(dá)的影響

Vero細(xì)胞接種PEDV(MOI=0.01)在4 ℃孵育2 h,2 h后棄掉病毒液,預(yù)冷PBS清洗3次。Vero細(xì)胞與澤漆水提物、陽性藥物Ribavirin(80 μg/mL)37 ℃孵育2 h,2 h后棄掉藥液,補(bǔ)充病毒維持液在37 ℃條件下孵育至24 h,收集蛋白進(jìn)行Western Blot檢測。

1.3.8.3澤漆水提物對PEDV復(fù)制增殖階段PEDV-N表達(dá)的影響

Vero細(xì)胞接種PEDV(MOI=0.01)在37 ℃孵育2 h,2 h后棄掉病毒液,PBS清洗3次。Vero細(xì)胞與澤漆水提物、陽性藥物Ribavirin(80 μg/mL)在37 ℃條件下孵育至24 h,收集蛋白進(jìn)行Western Blot檢測。

1.4 統(tǒng)計方法

試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差”方式表示。使用Excel 2021、GraphPad Prism 8.0進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計分析。通過One-way ANOVA分析顯著性差異,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 澤漆水提取物對細(xì)胞毒性分析

如圖1所示,當(dāng)澤漆水提取物與Vero細(xì)胞共孵育12和24 h時,濃度≤1 000 μg/mL,Vero細(xì)胞的存活率均大于85%,濃度為2 000 μg/mL會顯著降低Vero細(xì)胞的存活率(P<0.001);澤漆水提物與Vero細(xì)胞共孵育36 h時,濃度≤500 μg/mL,Vero細(xì)胞的存活率>90%,濃度≥1 000 μg/mL會顯著降低Vero細(xì)胞的存活率(P<0.01)。結(jié)果表明,澤漆水提物的濃度≤500 μg/mL時,無細(xì)胞毒性。

**和***分別代表與濃度為0 μg/mL的空白組相比差異顯著和極顯著(P<0.01,P<0.001)。** and *** represent significant differences and extremly significant differences compared to the blank group, respectively (P<0.01, P<0.001).圖1 澤漆水提物在12、24和36 h對細(xì)胞毒性的影響Fig.1 Cytotoxicity of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. to Vero at 12, 24 and 36 h

2.2 澤漆水提取物對PEDV-N mRNA轉(zhuǎn)錄水平及病毒滴度的影響

RT-qPCR檢測表明澤漆水提物對PEDV-NmRNA的轉(zhuǎn)錄具有顯著抑制作用(圖2(a))(P<0.001),當(dāng)澤漆水提物濃度為62.5 μg/mL時,其抑制率達(dá)96.17%。病毒滴度檢測進(jìn)一步證明了澤漆水提物以劑量依賴的方式抑制PEDV感染(圖2(b)),當(dāng)澤漆水提物濃度為500 μg/mL時,可將病毒滴度降低3～4個數(shù)量級。結(jié)果表明,澤漆水提取物以劑量依賴的方式抑制PEDV感染。

圖2 澤漆水提物對PEDV-N mRNA轉(zhuǎn)錄水平(a)及病毒滴度(b)的影響Fig.2 Effects of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. onPEDV-N mRNA transcription level (a) and virus titer (b)

2.3 澤漆水提取物在PEDV感染12、24和36 h時對PEDV-N表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡(圖3)及間接免疫熒光(圖4)結(jié)果表明,在12、24和36 h時,不同濃度的澤漆水提物均能顯著抑制PEDV-N蛋白的表達(dá)(P<0.05)。當(dāng)澤漆水提物濃度≤250 μg/mL時,對PEDV-N蛋白的抑制隨時間的增加而降低。當(dāng)澤漆水提物濃度為500 μg/mL時,36 h內(nèi)均能有效抑制PEDV-N蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,澤漆水提物可長效抑制PEDV感染。

(a)PEDV-N蛋白在12、24和36 h的表達(dá);(b)12、24和36 h PEDV-N蛋白定量分析。(a) PEDV-N protein expression at 12, 24 and 36 h; (b) Quantitative analysis of PEDV-N protein at 12, 24 and 36 h.圖3 Western Blot檢測不同濃度澤漆水提物對PEDV-N蛋白表達(dá)影響Fig.3 Effects of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. with different concentrations on PEDV-N protein expression were determined by Western Blot

圖4 間接免疫熒光檢測不同濃度澤漆水提物在12、24 和36 h對PEDV-N蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effects of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. at 12, 24 and 36 h with different concentrations on PEDV-N protein expression were determined by IFA

2.4 澤漆水提取物預(yù)防給藥對PEDV-N表達(dá)的影響

由圖5可知,澤漆水提物預(yù)處理不能抑制PEDV-N蛋白的表達(dá)(P>0.05),因此澤漆水提物無預(yù)防PEDV感染的作用。

圖5 Western Blot檢測澤漆水提物預(yù)防給藥對PEDV-N蛋白表達(dá)影響(a)及其定量分析(b)Fig.5 Effects of preventive administration of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. on PEDV-N protein expression was determined by Western Blot (a) and its quantitative analysis (b)

2.5 澤漆水提取物在PEDV復(fù)制周期的各個階段對PEDV-N表達(dá)的影響

由圖6(a)可知,在病毒吸附階段,澤漆水提取物可顯著抑制PEDV-N蛋白表達(dá)(P<0.001),而陽性藥物Ribavirin對PEDV-N蛋白的表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。在病毒復(fù)制增殖階段,澤漆水提物和Ribavirin均可有效抑制PEDV-N蛋白表達(dá)(P<0.001)(圖6(c))。在病毒的入侵階段,澤漆水提物和Ribavirin對 PEDV均無顯著抑制作用(P>0.05)(圖6(b))。因此,澤漆水提物影響PEDV生命周期中的吸附和復(fù)制增殖階段。

3 討論與結(jié)論

豬流行性腹瀉病毒引發(fā)的大量仔豬死亡已在全球形成了巨大的防疫危機(jī)和經(jīng)濟(jì)損失,然而目前仍不能很好地防御PEDV對養(yǎng)殖業(yè)的侵襲。澤漆是我國的傳統(tǒng)草藥,其提取物中富含蘆丁、槲皮素等多種生物活性成分。蘆丁是雙黃連、連花清瘟等抗病毒中藥復(fù)方的主要成分[21],槲皮素可通過結(jié)合PEDV 3CLpro蛋白酶來抑制PEDV復(fù)制[22]?；跐善嶂刑J丁、槲皮素等化合物的抗病毒作用,推測澤漆水提物具有抗PEDV的潛力。本研究首先通過CCK-8法證明了澤漆水提物在濃度≤500 μg/mL時無細(xì)胞毒性,之后通過RT-qPCR和病毒滴度檢測證明了澤漆水提物以劑量依賴的方式顯著降低PEDV-NmRNA的轉(zhuǎn)錄水平,同時降低了病毒滴度。然后探究了澤漆水提物抗PEDV的時間依賴關(guān)系,證明澤漆水提物在12、24和36 h均能顯著抑制PEDV-N蛋白的表達(dá)。隨感染時間的延長,澤漆水提物抑制PEDV的能力略有減弱,在12 h內(nèi)抑制效果最佳。高濃度(500 μg/mL)的澤漆水提物在病毒感染36 h時仍能有效抑制PEDV-N蛋白的表達(dá),說明澤漆水提物具有長效抗PEDV感染的作用。上述研究結(jié)果表明澤漆水提物具備抗PEDV的能力。近年來,傳統(tǒng)中藥在抗PEDV的活性被廣泛挖掘,王亭亭[23]的研究表明,黃芪多糖提取物在最高濃度400 μg/mL時能使PEDV病毒滴度下降1～2個數(shù)量級,而澤漆水提物在濃度為250 μg/mL時即可使病毒滴度下降1～2個數(shù)量級,在最高濃度500 μg/mL時令PEDV病毒滴度削減3～4個數(shù)量級。Liu等[24]研究表明,馬齒莧提取物在濃度為25 mg/mL時顯著降低PEDV 總RNA水平,抑制率達(dá)92.73%,而澤漆水提物在最低濃度為62.5 μg/mL時抑制率為96.17%,具有更高抑制活性。因此,澤漆水提物具有較好的抗病毒活性。

PEDV的生命周期是從病毒表面的S蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合開始的[25-26]。病毒通過膜融合或受體細(xì)胞的吞噬進(jìn)入細(xì)胞并釋放其基因組,之后以“不連續(xù)轉(zhuǎn)錄”的機(jī)制參與PEDV基因組復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白mRNA的合成,不連續(xù)基因組被翻譯為PEDV的4個結(jié)構(gòu)蛋白和1個輔助蛋白[27-28]。最后,PEDV在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成裝配,經(jīng)高爾基體釋放出胞外。因此,抗病毒藥物的開發(fā)可聚焦于如何阻斷PEDV正常生命周期的進(jìn)程。已有大量研究表明中藥提取物可作用PEDV生命周期的一個或多個階段來降低病毒蛋白的表達(dá),抑制病毒感染。如Lee等[29]通過乙醇提取法獲取的銀杏外種皮多糖可通過抑制病毒吸附和入侵這2個途徑來抑制PEDV感染,Xu等[30]通過水提法獲取的蘆薈水提取物則可以通過抑制病毒復(fù)制這一途徑來抑制PEDV感染。本研究以RNA聚合酶抑制劑Ribavirin為陽性對照藥物,探究澤漆水提物對PEDV生命周期的影響。Western Blot結(jié)果表明,在PEDV感染前,使用澤漆水提物預(yù)處理Vero細(xì)胞不能降低PEDV-N蛋白的表達(dá)量,說明澤漆水提物無預(yù)防PEDV感染的作用。在PEDV生命周期的吸附和復(fù)制增殖階段,澤漆水提物顯著降低了PEDV-N蛋白的表達(dá)水平,這表明澤漆水提物是通過阻斷PEDV對Vero細(xì)胞的吸附和病毒自身基因組的復(fù)制增殖發(fā)揮了抗病毒效果,其在PEDV入侵階段無效。澤漆水提物抗PEDV的機(jī)制可能是阻斷了病毒粒子與Vero細(xì)胞表面某種受體的結(jié)合從而使病毒無法正常吸附到細(xì)胞表面。同時,澤漆水提物對PEDV基因組復(fù)制也有一定抑制作用,但具體影響了哪種復(fù)制酶的活性或哪條通路尚未探究,這也成為后期研究的重點。澤漆水提物復(fù)雜的化合物組成為抗PEDV提供了多條途徑,有效增強(qiáng)了抗PEDV的效果。其復(fù)雜的化學(xué)組成也增加了提取有效成分的難度,澤漆水提物中抑制PEDV有效成分的分離將是接下來面臨的挑戰(zhàn)。

綜上所述,澤漆水提物對PEDV具有良好的體外抑制作用,主要通過抑制病毒吸附和復(fù)制增殖2個階段實現(xiàn)抗病毒作用,因而具備抗PEDV的潛在應(yīng)用價值。澤漆作為民間常見的中草藥,價格低廉,深入挖掘其抗病毒活性在實際生產(chǎn)生活中具有深遠(yuǎn)意義。本研究對澤漆水提物的抗病毒作用進(jìn)行了機(jī)理分析,為進(jìn)一步探究澤漆水提物抗病毒機(jī)制奠定了基礎(chǔ),但具體何種化學(xué)成分主導(dǎo)了抗病毒效果尚不明確,這將是今后研究的方向。