杜露平 魯海燕 侯立婷 于曉明 程海衛(wèi) 張?jiān)i 陳 瑾 鄭其升 甘 芳

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程中心/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210014;3.獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,江蘇 泰州 225300)

機(jī)體在感染或者免疫后,生發(fā)中心(GC) B細(xì)胞在濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)的陽性選擇下,僅有高親和力的GC B細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞,中親和力GC B細(xì)胞進(jìn)入下一輪增殖循環(huán)以提高親和力,低親和力GC B細(xì)胞則面臨凋亡被巨噬細(xì)胞捕獲[1]。生發(fā)中心在生理結(jié)構(gòu)上分為明區(qū)和暗區(qū)2個區(qū)域。在暗區(qū),GC B細(xì)胞密集并可迅速分裂增殖,且依賴于表達(dá)的誘導(dǎo)活化的胞苷脫氨酶(AID)進(jìn)行體細(xì)胞高頻突變(SHM),親和力成熟[2-3]。在明區(qū),GC B細(xì)胞識別結(jié)合濾泡樹突狀細(xì)胞(FDC)攜帶的抗原抗體復(fù)合物,處理后經(jīng)由主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHCⅡ)遞呈至Tfh,Tfh通過結(jié)合的抗原量區(qū)分表達(dá)高/低親和力BCR的GC B細(xì)胞,由此篩選出高親和力GC B細(xì)胞,分化為漿母細(xì)胞[4-6],漿細(xì)胞隨著血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至骨髓,持續(xù)性分泌高親和力抗體。AID特異性表達(dá)在外周淋巴器官GC B細(xì)胞中[7],在胞漿中表達(dá)后,轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核,使免疫球蛋白基因發(fā)生類別轉(zhuǎn)換(CSR)和體細(xì)胞高頻突變(SHM)[8]。其中SHM主要發(fā)生于生發(fā)中心暗區(qū),AID使抗體可變區(qū)V(D)J發(fā)生點(diǎn)突變,使得BCR對抗原具有高的親和力[9-10]。AID基因(Aicda)包含4個不同區(qū)域(Ⅰ到Ⅳ),其中區(qū)域Ⅰ為啟動子區(qū)[11],研究發(fā)現(xiàn)TLR激動劑作用于GC B細(xì)胞,激活NF-κB通路,進(jìn)而誘導(dǎo)HoxC4表達(dá),通過增強(qiáng)AID啟動子活性促進(jìn)AID表達(dá)[12-13]。

免疫增強(qiáng)劑CVC1302由Toll樣受體與NOD樣受體激動劑復(fù)配組成。研究發(fā)現(xiàn),免疫增強(qiáng)劑CVC1302配伍NP-OVA模式抗原免疫小鼠,利用BSA上載有不同比例的NP(4-羥基-3-硝基苯乙?；?可檢測機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生的高親和力/總親和力NP抗體水平,檢測發(fā)現(xiàn)CVC1302可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著提升的高親和力NP特異性抗體水平[14-16]。

因此,本研究旨在驗(yàn)證CVC1302促進(jìn) AID表達(dá)提高GC B細(xì)胞的親和力進(jìn)而使得大部分GC B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞,從而誘導(dǎo)持續(xù)久、親和力高的抗體以為機(jī)體提供體液免疫保護(hù),為后續(xù)新型免疫增強(qiáng)劑的研制提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6周齡BALB/c雌性小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心;NP-OVA、NP1-BSA和NP15-BSA購自美國Bioscience Technologies公司;免疫增強(qiáng)劑CVC1302組分(單磷酰脂質(zhì)A(MPLA)購自北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司;胞壁酰二肽(MDP)購自上海瀚泓科技有限公司;β-葡聚糖購自河北克隆多生物科技有限公司);MontanideTM-ISA206購自上海Seppic賽彼科特殊化學(xué)品有限公司;Trizol試劑和qPCR mix購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司;熒光抗體anti-B220 FITC、anti-GL-7 PE-vio770、anti-AID和rabbit anti rat IgG-APC均購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;rabbit anti rat IgG-HRP購自武漢博士德生物科技有限公司;ECL發(fā)光試劑盒購自諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1免疫抗原制備

按照參照文獻(xiàn)[14]制備方法分別制備疫苗,首先將MPLA、MDP和β-葡聚糖按照一定比例溶于蒸餾水中,制備免疫增強(qiáng)劑CVC1302,再與NP-OVA(4-羥基-3-硝基苯乙?；盥?lián)雞卵白蛋白)按照體積比1∶50混合后得到水相,最后與ISA206按照體積比1∶1進(jìn)行乳化,制備獲得疫苗NP-CVC1302-ISA206,最終每100 μL免疫抗原中含有50 μg NP-OVA和1 μL CVC1302。

1.2.2小鼠免疫試驗(yàn)

將6周齡BALB/c雌性小鼠15只隨機(jī)均分為3組,分別于后腿肌肉接種NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL。利用NP1-BSA或NP15-BSA(NP載量不同)包被的ELISA板分別檢測小鼠免疫后28 d血清中高親和力NP(NP1)及總NP(NP15)特異性抗體水平。

將6周齡BALB/c雌性小鼠21只隨機(jī)分為3組,分別于后腿肌肉接種NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL。免疫后14 d,分離小鼠腹股溝淋巴結(jié)制備單個淋巴細(xì)胞,流式分選儀分選獲得GC B細(xì)胞,使用Trizol試劑提取RNA,利用real-time PCR分析GC B細(xì)胞中AID和HoxC4基因轉(zhuǎn)錄水平。

將6周齡BALB/c雌性小鼠9只隨機(jī)分為3組,分別于后腿肌肉接種NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL。免疫后14 d,分離小鼠腹股溝淋巴結(jié)制備單個淋巴細(xì)胞,流式檢測NP特異性GC B細(xì)胞占B細(xì)胞比例和GC B細(xì)胞AID表達(dá)水平。

1.2.3ELISA檢測小鼠NP特異性抗體水平

利用NP1-BSA或NP15-BSA包被的ELISA板分別檢測小鼠免疫后28 d血清中高親和力NP(NP1)及總NP(NP15)特異性抗體水平。檢測方法參照文獻(xiàn)[17-18]:NP1-BSA或NP15-BSA(每孔0.5 μg)包被96孔酶標(biāo)板,4 ℃孵育過夜,PBST洗滌后每孔加入100 μL待檢小鼠血清(1∶200稀釋),37 ℃孵育60 min;PBST洗滌后每孔加入100 μL羊抗鼠HRP-IgG (1∶10 000稀釋),37 ℃孵育60 min;PBST洗滌后每孔加入100 μL TMB底物顯色液,37 ℃避光孵育10 min;最后每孔加入100 μL 1 mol/L H2SO4終止液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測定OD450值。

1.3 流式檢測NP特異性GC B細(xì)胞水平

1.3.1小鼠腹股溝淋巴結(jié)單個淋巴細(xì)胞制備

免疫后14 d分別收集小鼠腹股溝淋巴結(jié),參照文獻(xiàn)[19],含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的預(yù)冷PBS緩沖液沖洗4～6次,用眼科剪將其剪成約1 mm3的碎塊,隨后利用Medimachine系統(tǒng)(美國BD公司)制備單個淋巴細(xì)胞。

1.3.2流式檢測NP特異性GC B細(xì)胞數(shù)目

取1×106制備的小鼠腹股溝淋巴結(jié)單個淋巴細(xì)胞于1.5 mL離心管中,利用核內(nèi)細(xì)胞因子染色試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行破膜固定,然后用anti-B220 APC、anti-GL-7 PE-vio770、NP-Biotion 和Streptavidin-FITC進(jìn)行染色,再用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測NP特異性GC B細(xì)胞,比較各組間NP特異性GC B 細(xì)胞比例,分析GC B細(xì)胞增殖水平。

1.3.3流式檢測GC B細(xì)胞AID表達(dá)

取1×106制備的小鼠腹股溝淋巴結(jié)單個淋巴細(xì)胞于1.5 mL離心管中,利用核內(nèi)細(xì)胞因子染色試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行破膜固定,然后用anti-B220 FITC、anti-GL-7 PE-vio770、anti-AID和rabbit anti rat IgG-APC進(jìn)行染色,再用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測GC B細(xì)胞AID表達(dá)水平,比較GC B細(xì)胞中AID平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

1.4 Real-time PCR檢測GC B細(xì)胞AID和HoxC4轉(zhuǎn)錄水平

取相同數(shù)目分選的GC B細(xì)胞用Trizol提取RNA,real-time PCR檢測AID和HoxC4轉(zhuǎn)錄水平,以β-actin作為內(nèi)參基因,其中β-actin、AID和HoxC4相對應(yīng)引物見表1。

表1 本研究用引物對序列Table 1 Sequences of primers used in the study

1.5 統(tǒng)計分析

本研究中所用數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Graph Prism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,各組之間的差異性通過ANOVA分析,兩組之間的差異利用t檢測評估。其中P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,P<0.01、P<0.001和P<0.000 1表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CVC1302對小鼠抗體親和力的影響

免疫后28 d采集分離制備小鼠血清,利用NP1-BSA 或NP15-BSA包被的ELISA板分別檢測小鼠高NP特異性抗體水平和總親和力NP特異性抗體水平。由圖1可知,NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206組小鼠血清總NP(NP15)及高親和力NP(NP1)特異性抗體水平差異均極顯著(P<0.0001,圖1(a)),通過比較NP-CVC1302-ISA206和NP-ISA206兩組間NP1/NP15比值,發(fā)現(xiàn)血清在同一稀釋度下,NP-CVC1302-ISA206組中高親和力NP(NP1)特異性抗體所占比例顯著高于NP-ISA206組(P<0.01,圖1(b))。結(jié)果表明,CVC1302可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高親和力的抗體,且高親和力抗體比例顯著升高。

(a)NP特異性抗體水平;(b)NP1OD450/NP15OD450。(a) Levels of NP-specific antibodies; (b) Ratio of OD450 between NP1 and NP15. *代表組間差異顯著(P<0.05);**、***、****,代表組間差異極顯著(P<0.01、P<0.001、P<0.000 1)。下同。* represent significant differences between groups (P<0.05), and **, ***, **** represent extremely significant differences between groups (P<0.01, P<0.001, P<0.000 1). The same as below.圖1 CVC1302誘導(dǎo)高親和力NP特異性抗體Fig.1 Induction of induced high-affinity NP-specific antibodies for CVC1302

2.2 CVC1302對GC B細(xì)胞增殖的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結(jié),制備單個淋巴細(xì)胞,利用流式檢測分析NP特異性GC B 細(xì)胞占B細(xì)胞比例。由圖2可見,NP-CVC1302-ISA206組小鼠NP特異性GC B細(xì)胞占B細(xì)胞比例高達(dá)17.77%,與NP-ISA206組小鼠(14.2%)相比,差異顯著(P<0.01)。結(jié)果表明,CVC1302可顯著促進(jìn)GC B細(xì)胞的增殖。

圖2 CVC1302增加抗原特異性GC B細(xì)胞比例Fig.2 The enhancement of the percentage of antigen-specific GC B cells for CVC1302

2.3 CVC1302對GC B細(xì)胞中AID基因轉(zhuǎn)錄的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結(jié),制備單個淋巴細(xì)胞,流式分選獲得GC B細(xì)胞,取1×106個細(xì)胞利用Trizol提取RNA,real-time PCR檢測各組GC B細(xì)胞AIDmRNA轉(zhuǎn)錄水平。由圖3可見, NP-CVC1302-ISA206組GC B細(xì)胞AID基因相對轉(zhuǎn)錄水平為7.02,NP-ISA206組AID基因相對轉(zhuǎn)錄水平為3.23,2組之間差異均顯著(P<0.01)。結(jié)果表明,CVC1302可顯著提高GC B細(xì)胞中AID基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖3 CVC1302促進(jìn)GC B細(xì)胞AID基因轉(zhuǎn)錄Fig.3 The enhancement of the transcriptional levels of AID in GC B cells for CVC1302

2.4 CVC1302對GC B細(xì)胞中AID表達(dá)的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結(jié),制備單個淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析GC B細(xì)胞AID表達(dá)水平。由圖4可知,NP-CVC1302-ISA206組GC B細(xì)胞AID平均熒光強(qiáng)度顯著高于NP-ISA206組(P<0.05),CVC1302可顯著提高GC B細(xì)胞中AID的表達(dá)水平。

(a) GC B細(xì)胞AID MFI流式圖;(b)GC B細(xì)胞AID MFI柱式圖。(a) The flow diagram of MFI of AID in GC B cells; (b) The bar chart of MFI of AID in GCB cells.圖4 CVC1302促進(jìn)GC B細(xì)胞中AID的表達(dá)Fig.4 The enhancement of the mean fluorescence intensity of AID in GC B cells for CVC1302

2.5 CVC1302對GC B細(xì)胞中HoxC4轉(zhuǎn)錄的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結(jié),制備單個淋巴細(xì)胞,流式分選獲得GC B細(xì)胞,取1×106個細(xì)胞利用Trizol提取RNA,real-time PCR檢測各組GC B細(xì)胞HoxC4mRNA轉(zhuǎn)錄水平。由圖5可見,NP-CVC1302-ISA206組GC B細(xì)胞HoxC4基因相對轉(zhuǎn)錄水平為4.03,NP-ISA206組HoxC4基因相對轉(zhuǎn)錄水平為1.53,2組之間差異極顯著(P<0.001)。結(jié)果表明,CVC1302可顯著提高GC B細(xì)胞中HoxC4基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖5 CVC1302促進(jìn)GC B細(xì)胞HoxC4基因轉(zhuǎn)錄Fig.5 The enhancement of the transcriptional levels of HoxC4 in GC B cells for CVC1302

3 討論與結(jié)論

抗體作為體液免疫應(yīng)答的重要組成,特異性識別進(jìn)而中和病原體[20]。研究發(fā)現(xiàn),抗體親和力即抗原與抗體結(jié)合能力,與其抑制病原體感染的能力顯著相關(guān)[21]。抗體親和力成熟依賴于AID介導(dǎo)的SHM。生發(fā)中心暗區(qū),活化的抗原特異性B細(xì)胞在增殖過程中,SHM介導(dǎo)B細(xì)胞抗體基因的V區(qū)發(fā)生點(diǎn)突變,誘導(dǎo)B細(xì)胞抗體親和力成熟,隨后遷移至明區(qū),高親和力B細(xì)胞在Tfh的陽性選擇下,分化為漿細(xì)胞,轉(zhuǎn)運(yùn)至骨髓分化為LLPC分泌高親和力抗體。AID表達(dá)依賴于其基因轉(zhuǎn)錄過程。AID由4個順式調(diào)控區(qū)介導(dǎo)其于活化B細(xì)胞中的表達(dá),其中區(qū)域1含有可與NF-κB和 STAT6的結(jié)合位點(diǎn),其被TLR激動劑激活后,增強(qiáng)HoxC4的表達(dá),促進(jìn)AID增強(qiáng)子活性,正向調(diào)控AID表達(dá)[12-13]。

研究發(fā)現(xiàn),CVC1302可提高抗體親和力[16]。鑒于此,本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),NP-CVC1302-ISA206組小鼠顯著促進(jìn)NP特異性GC B細(xì)胞占B細(xì)胞的比例,比值為17.77%,顯著高于NP-ISA206組小鼠,表明CVC1302可促進(jìn)GC B細(xì)胞的增殖;與此同時,real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),CVC1302可促進(jìn)GC B細(xì)胞中AID基因的轉(zhuǎn)錄水平,流式細(xì)胞術(shù)同時分析得出AID的表達(dá)水平也顯著提升,NP-CVC1302-ISA206組小鼠其GC B細(xì)胞AID的MFI為147 539,而NP-ISA206組小鼠GC B細(xì)胞AID的MFI為126 005,兩者差異顯著。鑒于HoxC4基因于AID轉(zhuǎn)錄水平起到正向調(diào)控的作用,本研究利用real-time PCR對HoxC4基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示,以β-actin基因作為內(nèi)參,NP-CVC1302-ISA206組小鼠其HoxC4基因相對轉(zhuǎn)錄水平為4.03,而NP-ISA206組小鼠HoxC4基因相對轉(zhuǎn)錄水平僅為1.53,兩者差異極顯著。綜上, CVC1302依賴于促進(jìn)HoxC正向調(diào)控AID表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高親和力抗體。

獸醫(yī)領(lǐng)域中,免疫增強(qiáng)劑的研制多依賴于經(jīng)驗(yàn),對其作用機(jī)制的研究甚少,人醫(yī)領(lǐng)域中,研究發(fā)現(xiàn)TLR4激動劑協(xié)同CD40信號可依賴于NF-κB信號通路上調(diào)AID基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)AID表達(dá),誘導(dǎo)高親和力抗體[22]。TLR1/2激動劑協(xié)同BCR依賴于AKT信號通路促進(jìn)USP10核移位,進(jìn)而抑制AID降解,誘導(dǎo)高親和力抗體[23]。本研究發(fā)現(xiàn)免疫增強(qiáng)劑CVC1302依賴于HoxC4的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)AID的表達(dá),然而其相關(guān)信號通路仍需進(jìn)一步研究分析;且多項(xiàng)研究檢測抗體親和力多為使用NP-OVA作為模式抗原,利用包被NP1-BSA或NP15-BSA(NP載量不同)的ELISA板,檢測小鼠的總NP(NP15)或高親和力(NP1)抗體水平,因此本研究僅使用模擬抗原檢測總親和力和高親和力抗體水平,后續(xù)應(yīng)對GC B細(xì)胞免疫球蛋白可變區(qū)VH186.2和JH等基因片段進(jìn)行測序,分析其基因突變頻率。本研究僅利用模式抗原NP-OVA探究CVC1302可誘導(dǎo)產(chǎn)生高親和力抗體,后續(xù)將推廣至不同病原體,檢測其誘導(dǎo)高親和力抗體這一效力的普遍性,擴(kuò)大CVC1302應(yīng)用前景。

本研究利用NP-OVA作為模式抗原,闡明CVC1302依賴于HoxC4正向調(diào)控AID誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高親和力抗體,為后續(xù)新型免疫增強(qiáng)劑的研制提供研究思路和方向。