唐鑫華 曲自成 李世偉 劉玉霖 石 瑛*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.國家大豆工程技術(shù)研究中心,哈爾濱150028)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大糧食作物之一,其塊莖營養(yǎng)豐富、含有人體必需的全部七大類營養(yǎng)物質(zhì)[1]。中國是世界第一大馬鈴薯生產(chǎn)國,產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的1/4[2]。我國已于2015年啟動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略,馬鈴薯將逐漸成為我國第四大主糧作物[3]。但常規(guī)栽培四倍體馬鈴薯由于種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)相對狹窄及育種年限較長等原因,導(dǎo)致品種資源更新較慢,目前我國馬鈴薯平均單位面積產(chǎn)量低于世界平均水平[1,4]。因此,豐富馬鈴薯育種材料對于豐富其種質(zhì)資源具有重要的意義。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)是與目的基因啟動子或增強(qiáng)子的區(qū)域相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)的一類蛋白質(zhì)[5]。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,最早在矮牽牛屬植物發(fā)現(xiàn)[6],NAC蛋白結(jié)構(gòu)由高度保守的N端和可變的C端(TR)組成[7-8],該轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控植物生長發(fā)育進(jìn)程、響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫方面具有重要作用[9-12]。在植株生長發(fā)育方面,研究表明轉(zhuǎn)錄因子AtNAC2基因在擬南芥中過表達(dá)可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根生長[13];轉(zhuǎn)CarNAC1基因棉花的凈光合速率、抗氧化酶酶活、單鈴重均顯著高于野生型[14];番茄轉(zhuǎn)錄因子SlNAC1和SlNAC4基因通過影響乙烯合成和類胡蘿卜素積累可調(diào)控番茄的成熟[15-16];將紫花苜蓿MsNAC2基因轉(zhuǎn)入煙草,在非生物逆境脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的株高、根長、鮮重和干重等生長指標(biāo)均高于野生型[17];轉(zhuǎn)錄因子ANAC071和ANAC096基因能夠促進(jìn)擬南芥莖段愈傷組織細(xì)胞形成[18]。在植株抵御非生物抗性方面,研究表明水稻的ONAC045基因[19]、玉米的ZmNAC111基因[20]、棉花的CarNAC1基因[14]過量表達(dá)可以提高植株耐干旱脅迫能力,BraNAC基因上調(diào)表達(dá)能提高白菜型冬油菜耐低溫能力[21],細(xì)葉百合LpNAC6基因可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[22],而抑制水稻OsNAC2基因的表達(dá)能提高水稻抗旱性[23]、在轉(zhuǎn)基因擬南芥中BcNAC036表達(dá)與耐高溫性呈顯著負(fù)相關(guān)[24];馬鈴薯StNAC2基因參與Cd的脅迫響應(yīng)過程[25],將梭梭HaNAC1基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯、將馬鈴薯StNAC053基因轉(zhuǎn)入擬南芥后均可提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性[26-27]。可見NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長和抗逆等方面具有重要作用,但目前對四倍體馬鈴薯NAC轉(zhuǎn)錄因子在生理功能方面的研究報道卻較少。本研究克隆了馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子基因StNAC043,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入馬鈴薯‘東農(nóng) 310’,獲得StNAC043基因過量表達(dá)植株,并對轉(zhuǎn)基因株系的根和莖的生長指標(biāo)、葉綠素相對含量(SPAD)以及熒光參數(shù)(Fv/Fm、ETRmax)進(jìn)行測定,以轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合qRT-PCR驗證分析其下游調(diào)控基因,旨在探究馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子StNAC043基因的功能,以期為豐富馬鈴薯種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯‘東農(nóng) 312’的脫毒組培苗和馬鈴薯‘東農(nóng) 310’原原種,由黑龍江省哈爾濱市國家級農(nóng)作物品種區(qū)域試驗站提供。

1.2 試驗方法

1.2.1目的基因的克隆和載體構(gòu)建

基于曲自成等[28]對‘東農(nóng)312’轉(zhuǎn)錄組測序和NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果,獲得馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子StNAC043(LOC102584189)的CDS序列,根據(jù)該基因序列(去除終止密碼子)添加BamH I和XbaI限制性內(nèi)切酶位點設(shè)計特異性引物(表1)。提取‘東農(nóng)312’葉片總RNA、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;利用特異引物StNAC043-CLO-F、StNAC043-CLO-R擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子StNAC043基因;PCR程序為:98 ℃預(yù)變性2 min; 98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸15 s,35個循環(huán); 72 ℃延伸10 min。用1%凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物、回收純化目的片段;將上述片段與pEASY?-Blunt克隆載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,涂布在含有50 mg/L卡那霉素(Kan)的LB固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)。挑單菌落,以StNAC-CDS-F和StNAC-CDS-R特異引物PCR檢驗,反應(yīng)體系:2xTaq MasterMix(Dye) 10 μL、引物各1 μL、菌液2 μL,加水至20 μL;反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。選擇與目的片段大小一致的陽性克隆單菌落測序。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences in the study

提取測序正確的大腸桿菌單菌落質(zhì)粒;使用BamH I和XbaI雙酶切上述質(zhì)粒及pCAMBIA1302-GFP載體,凝膠電泳分離檢測目的基因和線性化載體,并用試劑盒回收;使用T4連接酶連接目的基因與線性化載體,構(gòu)建植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302-GFP-StNAC043,凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞,搖菌后提取質(zhì)粒;并用PCR擴(kuò)增和BamH I、XbaI雙酶切上述載體檢測目的基因。

1.2.2目的基因遺傳轉(zhuǎn)化

將含有pCAMBIA1302-GFP-StNAC043質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含有50 mg/L Kan和20 mg/L利福平(Rif)的LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5。5 000 r/min離心10 min,棄上清液后加入50 mL MS液體培養(yǎng)基,重懸菌液,加入乙酰基丁香酮(AS)至50 μmol/L。將表面消毒并去除種皮的‘東農(nóng) 310’原原種切成約1 cm×1 cm×2 mm薄片,浸泡在菌液中10 min,每隔2 min搖勻1次。吸干殘留菌液,平鋪于含4 mg/L 玉米素(ZT)+1 mg/L 生長素(IAA)+50 μmol/L AS的MS固體培養(yǎng)基上,23 ℃暗培養(yǎng)48 h。清洗后浸泡于含200 mg/L頭孢霉素(Cef)無菌水中30 s,沖洗、晾干后移至分化培養(yǎng)基(MS+4 mg/L ZT+1 mg/L IAA+500 mg/L Cef+6 mg/L潮霉素(Hyg),置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25 ℃,16 h光照/8 h黑暗),每10 d繼代1次。待分化芽長到2～3 cm時,扦插至生根培養(yǎng)基中(MS+200 mg/L Cef+6 mg/L Hyg),并對經(jīng)檢測的抗性植株進(jìn)行無性系擴(kuò)繁,備用。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株檢測

用植物基因組DNA提取試劑盒提取在生根培養(yǎng)基培育20 d的植株葉片基因組DNA,以其為模板,用載體基因GFP特異引物GFP-F和GFP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測,1%凝膠檢驗擴(kuò)增條帶。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株qRT-PCR檢測和分析

擴(kuò)繁轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?培育20 d,用試劑盒提取植株根、莖、葉的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用Primer 5.0軟件根據(jù)StNAC043基因序列設(shè)計定量引物,用UltraSYBR一步法熒光定量PCR試劑盒,以馬鈴薯Elfα基因為內(nèi)參基因,反應(yīng)體系總體積20 μL,其中cDNA 2 μL、引物各0.5 μL、2×UltraSYBR Mixture 10 μL、ddH2O 7 μL;應(yīng)用實時熒光定量PCR儀(Line Gene 9620,杭州博日科技股份有限公司)進(jìn)行qRT-PCR檢測,反應(yīng)程序為:預(yù)變性95 ℃ 10 min;95 ℃變性20 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸32 s,40個循環(huán)。每個株系進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt算法,對基因相對表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算。

1.2.5植株表型指標(biāo)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

取長勢均一的轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株無性系擴(kuò)繁,去除頂芽、切成1.5 cm莖段于MS培養(yǎng)基,光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)25 d。用葉綠素儀SPAD-502(日本柯尼卡美能達(dá)公司)測定植株上部3片葉的葉綠素相對含量(SPAD);應(yīng)用葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2500 (德國Heinz Walz GmbH公司)測定葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)(PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm、最大電子傳遞速率ETRmax);應(yīng)用LA-S型植物根系分析儀系統(tǒng)(LA-S,杭州萬深檢測科技有限公司)測定植株根系表型(總根長、根表面積、根直徑、根體積),測定根系鮮重、株高和節(jié)間距;每個株系測定9株。

1.2.6轉(zhuǎn)錄組測序分析

為明確馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子StNAC043調(diào)控的下游基因,對轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株無性系擴(kuò)繁培育20 d,每個株系取3株,分別提取總RNA,由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。應(yīng)用百邁克在線數(shù)據(jù)分析平臺(www.biocloud.net)分析得出差異表達(dá)基因。結(jié)合表型數(shù)據(jù)和熒光參數(shù)差異選取部分差異表達(dá)基因qRT-PCR驗證,3 次生物學(xué)重復(fù),分析轉(zhuǎn)錄因子StNAC043調(diào)控的下游基因。

1.2.7數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2012記錄數(shù)據(jù)和做圖,應(yīng)用SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子StNAC043基因的克隆及序列分析

由圖1可知,以馬鈴薯‘東農(nóng) 312’葉片cDNA為模板,利用特異性引物,擴(kuò)增出的條帶大小為955 bp(圖1)。經(jīng)測序分析,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段序列與StNAC043基因一致(不含終止密碼子),StNAC043基因開放閱讀框(ORF)942 bp,編碼氨基酸313個(圖2)。

M,分子量標(biāo)記5 000;1、2,StNAC043基因PCR產(chǎn)物。M, Marker 5 000; 1 and 2, PCR Product of StNAC043 gene.圖1 StNAC043基因電泳圖Fig.1 StNAC043 gene electrophoresis map

圖2 StNAC043基因核苷酸序列及所編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of StNAC043 gene and the encoded amino acid sequence

2.2 轉(zhuǎn)基因植株檢測及qRT-PCR分析

由圖3可知,對6個抗性植株中長勢良好的3個植株(ST1、ST2和ST3)提取基因組DNA并經(jīng)PCR檢測,ST1、ST2和ST3為轉(zhuǎn)基因植株。

M,分子標(biāo)記2000;1,陽性對照;2,ddH2O;3,非轉(zhuǎn)基因植株;ST1、ST2、ST3抗性植株。M,DNA marker 2000; 1,positive control; 2,ddH2O; 3,non-transgenic plants; ST1, ST2, ST3 are resistant plants, respectively.圖3 植株P(guān)CR檢測電泳圖Fig.3 Plant PCR detection electrophoresis map

由圖4可知,經(jīng)qRT-PCR檢測,ST1、ST2和ST3的StNAC043在植株的葉、莖和根部相對表達(dá)量均顯著高于CK,其中StNAC043基因在葉、莖和根的相對表達(dá)量分別比CK高 2.13～2.37、2.76～6.98和2.28～6.25倍,因此,ST1、ST2和ST3為StNAC043基因的過量表達(dá)植株。轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系(CK)的莖和根中StNAC043相對表達(dá)量均高于葉片中的相對表達(dá)量,說明StNAC043基因在不同器官的表達(dá)存在顯著差異。

CK為非轉(zhuǎn)基因株系,ST1、ST2和ST3為轉(zhuǎn)基因株系。*表示轉(zhuǎn)基因株系和CK之間差異顯著(P<0.05)。下同。CK is non-transgenic control, ST1, ST2 and ST3 are transgenic lines. * indicates the significant difference between transgenic lines and CK (P<0.05). The same below.圖4 StNAC043基因在不同部位相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of StNAC043gene in different parts

2.3 植株表型指標(biāo)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析

由圖5可知,3個轉(zhuǎn)基因株系長勢均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。由?可知,轉(zhuǎn)基因株系根的總長、表面積、體積、鮮重以及株高和節(jié)間距均顯著高于CK,其中轉(zhuǎn)基因株系總根長、根表面積、根體積、根鮮重、株高、節(jié)間距分別比CK高26.14%～37.20%、16.82%～26.03%、22.32%～37.50%、47.30%～83.78%、12.94%～25.53%、37.50%～46.88%。說明StNAC043基因過量表達(dá)可以促進(jìn)馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株根系和莖的生長。

圖5 ‘東農(nóng) 310’及轉(zhuǎn)基因植株的幼苗Fig.5 Seedling of ‘Dongnong 310’ and transgenic lines

表2 轉(zhuǎn)基因植株的表型指標(biāo)Table 2 Phenotypic indicators of transgenic plant

由表3可知,轉(zhuǎn)基因株系葉片的SPAD、Fv/Fm、ETRmax均顯著高于CK,其中轉(zhuǎn)基因株系葉片的SPAD 比CK高4.37%～16.67%、Fv/Fm比CK高10.93%～15.63%、ETRmax比CK高21.65%～36.91%。表明StNAC043基因的過量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株葉片的SPAD、Fv/Fm和ETRmax。

表3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)Table 3 Chlorophyll fluorescence parameters

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析及qRT-PCR驗證

由圖6可知,轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甏嬖?15個差異表達(dá)基因,其中432個基因表達(dá)量上調(diào),183個基因下調(diào)表達(dá)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分類,發(fā)現(xiàn)光合作用-捕光蛋白(Photosynthesis-antenna proteins)通路的P<0.01且富集因子最高,表明StNAC043基因過量表達(dá)所調(diào)控的下游基因在此通路高度富集。經(jīng)qRT-PCR檢測表明轉(zhuǎn)基因株系在此通路中的StCAB1和StCAB2基因相對表達(dá)量分別比CK高3.84～8.83和4.02～10.93倍(圖7),說明轉(zhuǎn)錄因子StNAC043基因可以調(diào)控StCAB1和StCAB2基因表達(dá)。

圖6 差異表達(dá)基因功能的KEGG分類Fig.6 KEGG classification of differentially expressed gene function

圖7 StCAB1和StCAB2基因相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of StCAB1 and StCAB2

3 討 論

NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育進(jìn)程、響應(yīng)生物和非生物逆境脅迫方面具有重要作用[9-12]。本研究將克隆的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中的StNAC043基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯‘東農(nóng)310’,使其過量表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株的根系生長指標(biāo)均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?這與在煙草和擬南芥等模式植物中開展的研究結(jié)果一致[13,17,29]。Xie等[29]研究表明擬南芥NAC1基因在根尖和側(cè)根生長原基表達(dá),可通過調(diào)控生長素應(yīng)答因子AIR3(auxin-induced in rootcultures3) 和DBP(DNA-binding protein)基因表達(dá)促進(jìn)根系的發(fā)育,推測StNAC043基因正向調(diào)控與根系生長相關(guān)的基因,因此StNAC043過表達(dá)馬鈴薯植株根系生長優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。Huang等[30]在轉(zhuǎn)基因水稻中研究表明轉(zhuǎn)錄因子NAC29和NAC31能調(diào)控纖維素合成酶基因CESA的表達(dá),CESA基因與植物次生細(xì)胞壁形成有關(guān),通過正向調(diào)控CESA基因表達(dá)可以促進(jìn)水稻莖稈生長。在本研究中轉(zhuǎn)基因植株的株高和節(jié)間距均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?推測在馬鈴薯過表達(dá)植株中StNAC043基因促進(jìn)馬鈴薯植株次生細(xì)胞壁合成。發(fā)達(dá)的根系和莖對于植物吸收水、養(yǎng)分及促進(jìn)植株生長具有重要的作用[31],可以促進(jìn)植株蒸騰作用、進(jìn)而提高凈光合速率,本研究中轉(zhuǎn)基因株系的ETRmax高于非轉(zhuǎn)基因植株,因此在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中StNAC034基因可通過促進(jìn)根系和莖的生長進(jìn)而促進(jìn)植株水分和養(yǎng)分的吸收,從而影響植株光合作用。

本研究中對轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)錄組測序以及qRT-PCR驗證表明轉(zhuǎn)錄因子StNAC043可以正向調(diào)控StCAB1、StCAB2基因表達(dá),StCAB1、StCAB2基因均編碼捕光色素結(jié)合蛋白,該類蛋白主要功能是收集光能并傳遞給光反應(yīng)中心,在光反應(yīng)的光能吸收階段對光能捕獲過程具有重要作用[32],StNAC043基因的過表達(dá)可能通過增加捕光色素結(jié)合蛋白StCAB1、StCAB2含量的方式促進(jìn)葉片的葉綠素含量升高,本研究中轉(zhuǎn)基因株系的Fv/Fm和SPAD均顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暌才c此推測吻合,轉(zhuǎn)錄因子StNAC043還可通過調(diào)控參與光反應(yīng)的捕光色素結(jié)合蛋白基因的表達(dá)進(jìn)而影響植株光合作用。

本研究中轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢o性系扦插擴(kuò)繁培養(yǎng)的環(huán)境條件相同,但非轉(zhuǎn)基因植株葉片F(xiàn)v/Fm顯著低于轉(zhuǎn)基因株系,Fv/Fm反映PSⅡ光能轉(zhuǎn)換效率且非脅迫條件下該參數(shù)的變化極小、不受物種和生長條件的影響,而在脅迫條件下該參數(shù)顯著下降[33],在組培條件下植株生長消耗MS固體培養(yǎng)基中的養(yǎng)分和水分,隨著培養(yǎng)基中養(yǎng)分減少、pH和滲透壓變化等對植株造成了一定非生物逆境脅迫,而轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出所受脅迫影響較小,說明StNAC043基因的過量表達(dá)可能提高植株抗逆性、降低由于環(huán)境因素造成的非生物逆境脅迫對植株的影響,與申玉華等[17]、Zheng等[19]、劉彬等[22]在煙草等模式植物中的研究結(jié)果相似。StNAC043基因在馬鈴薯中提高非生物逆境脅迫抗性的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子StNAC043基因在馬鈴薯‘東農(nóng)310’中過量表達(dá)可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株幼苗根系和莖的生長,顯著提高葉片SPAD、Fv/Fm和ETRmax;轉(zhuǎn)錄組測序表明轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系的差異表達(dá)基因在光合作用-捕光蛋白通路高度富集;轉(zhuǎn)錄因子StNAC043可以調(diào)控捕光色素結(jié)合蛋白基因StCAB1和StCAB2的表達(dá)。