金四華 稅 斐 徐 媛 賈羽晴 夏晶晶 王 鑫 賈富民 耿照玉

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院, 合肥 230036)

伴隨著家禽業(yè)的快速發(fā)展,家禽養(yǎng)殖密度不斷提高,腿部疾病問題日益突出,嚴(yán)重影響家禽生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖效益。家禽的股骨、脛骨和跖骨等均由軟骨內(nèi)成骨形成[1]。雞骨骼發(fā)育涉及Notch、刺猬(Hedgehog, HH)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)等信號通路[2],其中,以印度刺猬因子(Indian hedgehog,IHH)基因?yàn)榇淼腍H信號通路,在人[3]、小鼠[4]、牦牛[5]和雞[6]等物種的骨骼發(fā)育、疾病與生產(chǎn)性能中發(fā)揮很大作用,近年來受到廣泛關(guān)注。

IHH作為HH家族一員[7],主要在軟骨組織中表達(dá),是骨骼發(fā)育的中樞調(diào)控因子,影響軟骨的生長分化和成骨形成等過程,對胚胎和出生后機(jī)體骨骼發(fā)育均具有重要的調(diào)控作用[8-13]。St-Jacques等[4]通過靶向替換IHH的第一個外顯子和1 kb序列,使其產(chǎn)生一個等位基因,進(jìn)而導(dǎo)致小鼠骨骼極度縮短,關(guān)節(jié)融合,最終導(dǎo)致早期死亡。Yang等[3]通過全外顯子組測序發(fā)現(xiàn),IHH基因c.299A>G位點(diǎn)突變導(dǎo)致人類短指A1型綜合征(BDA-1)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),IHH基因突變是造成雞匍匐性狀的關(guān)鍵因素[14],IHH缺失導(dǎo)致雞匍匐表型[6],匍匐型雞雜合子軟骨細(xì)胞成熟延遲,提示IHH丟失可導(dǎo)致雞軟骨營養(yǎng)不良[15]。此外,在雞脛骨軟骨發(fā)育不良[16]和細(xì)菌性軟骨壞死伴骨髓炎[17]等骨骼相關(guān)疾病研究中,均發(fā)現(xiàn)IHH是影響雞軟骨發(fā)育的關(guān)鍵基因[18],該基因的表達(dá)失調(diào)是造成骨骼疾病的關(guān)鍵因素。綜上可知,IHH是影響雞軟骨發(fā)育的重要基因。

目前,關(guān)于IHH基因的研究多集中在嚙齒類動物,而雞IHH基因的生物信息學(xué)及其在不同組織中的表達(dá)規(guī)律研究較少。因此,本研究借助現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)分析IHH基因開放閱讀框、內(nèi)切酶、啟動子和CpG島,比較多物種IHH蛋白氨基酸相似性,解析物種間遺傳距離,并分析雞IHH蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和蛋白結(jié)構(gòu)等生物信息特征。另外,采集心、肝、脾、肺、腎、軟骨、下丘腦、胸肌、十二指腸和胸腺組織,并比較不同組織的差異表達(dá)規(guī)律,該研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究雞IHH基因功能奠定了基礎(chǔ),并為深入解析雞骨骼發(fā)育潛在分子機(jī)制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動物及樣品采集

本研究材料由安徽省淮南麻黃雞省級保種場提供。從淮南麻黃雞省級保種場隨機(jī)選取體重相近且健康強(qiáng)健的1日齡公雞6只,采集心、肝、脾、肺、腎、軟骨、下丘腦、胸肌、十二指腸和胸腺共10個組織,放入加有RNA保存液的2 mL離心管,4 ℃過夜后置于-80 ℃保存。

1.1.2主要試劑和儀器

Hifair?II 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix均購自翌圣生物科技(上海)有限公司;引物合成和測序工作均由南京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 生物信息學(xué)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載雞IHH基因mRNA序列(NM_204957.3),利用在線軟件分析下載的雞IHH基因序列,預(yù)測其開放閱讀框大小、基因結(jié)構(gòu)和內(nèi)切酶等。同時,利用BDGP在線軟件預(yù)測雞IHH基因5′端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp區(qū)間核心啟動子,采用Cpgplot在線分析基因CpG島。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中9種動物IHH蛋白氨基酸序列(表1),借助MegAlign和ClustalX 1.81軟件對獲得的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析。

表1 雞IHH蛋白氨基酸序列大小及參考序列Table 1 Amino acid sequence size of chicken IHH protein and reference sequence

通過在線軟件預(yù)測雞IHH蛋白的疏水性、理化特性和蛋白結(jié)構(gòu)等生物信息。上述生物信息在線分析軟件網(wǎng)址見表2。

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

Trizol法提取總RNA并檢測RNA完整性。借助NanoDrop 2 000分光光度計(jì)(ThermoFisher Scientific,美國)檢測RNA濃度,通過OD值比值判斷RNA純度,其中OD260/OD280為1.8～2.1,OD260/OD230比值應(yīng)大于2,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品完整性。

以總RNA為模板,按照Hifair?II 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(翌圣生物科技(上海)有限公司)合成cDNA第1鏈,具體過程如下:1)去除DNA污染:體系10 μL,包括5×gDNA digester Buffer 2 μL,gDNA digester 1 μL,Total RNA 1 μg,RNase-free ddH2O補(bǔ)足,反應(yīng)體系在42 ℃孵育2 min;2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及程序:在上述體系中再加入2×Hifair?II SuperMix Plus 10 μL,混勻后25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min,溫度降至4 ℃,終止反應(yīng),產(chǎn)物置于-20 ℃保存待用。

1.4 雞各組織IHH mRNA的相對表達(dá)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載IHH(登錄號:NM_204957.3)和內(nèi)參基因GAPDH(登錄號:NM_204305.2)的mRNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表3)用于實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測。qRT-PCR體系10 μL,Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 5.0 μL,上下游引物各0.2 μL,模板DNA 1.0 μg,補(bǔ)水至10.0 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。每組試驗(yàn)3個重復(fù),每組用RNase-free ddH2O代替模板作陰性對照。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量。

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2019對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因Ct值,采用2-ΔΔCt法[19]計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。采用SPSS 22.0(IBM, Armonk, NY, USA)軟件中One-way ANOVA程序進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),Duncan法進(jìn)行不同組織間差異表達(dá)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞IHH基因結(jié)構(gòu)分析和內(nèi)切酶分析

開放閱讀框(Open reading frame,ORF)分析表明,閱讀框大小為1 227 bp,可編碼408個氨基酸。經(jīng)FGENESH程序分析,該基因有3個外顯子,分別位于397～699 bp、4 366～4 627 bp和7 003～7 664 bp(圖1),NEBcutter軟件分析IHH基因內(nèi)切酶位點(diǎn),可見該基因存在多個酶切位點(diǎn)(圖2),其中有十多個酶切位點(diǎn)受CpG甲基化的影響,為后續(xù)進(jìn)一步研究基因多態(tài)性位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

CDSf:起始外顯子;CDSi:中間外顯子;CDSl:末端外顯子;CDSo:唯一外顯子;PolA:末端polyA尾區(qū);TSS:轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。CDSf: First-starting with start codon; CDSi: Internal exon; CDSl: Last coding segment; CDSo: Only exon; PolA: Last polyA; TSS: Transcription start site.圖1 雞IHH基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Analysis of IHH gene structure in chicken

2.2 雞IHH基因啟動子CpG島分析

啟動子是調(diào)控基因表達(dá)的重要因素。使用BDGP軟件預(yù)測雞IHH基因5′端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp區(qū)間核心啟動子(表4),可見存在4個核心啟動子區(qū),經(jīng)Cpgplot分析,預(yù)測該2 000 bp區(qū)間內(nèi)GC含量高(>50%),存在1個CpG島(1 666～1 944 bp)(圖3)。

(a) CpG的出現(xiàn)率(觀測值/期望值);(b) GC含量百分比;(c)閾值,圖中兩豎線分別位于CpG島的起始和終止位置。(a) The occurrence rate of CpG dinucleotides (Observed/Expected); (b) GC content percentage; (c)Threshold.In the figure, the two vertical lines are located at the starting and ending positions of the CpG island, respectively.圖3 IHH基因啟動子區(qū)域CpG島預(yù)測Fig.3 CpG island prediction of IHH gene promoter region

表4 雞IHH基因啟動子預(yù)測Table 4 Chicken IHH gene promoter prediction

2.3 IHH基因在不同組織中差異表達(dá)分析

qRT-PCR檢測IHH基因在不同組織中的表達(dá)情況,IHH基因和GAPDH基因的擴(kuò)增曲線具有明顯的指數(shù)增長期,融解曲線均為單一主峰,排除引物二聚體和非特異性擴(kuò)增對熒光定量結(jié)果的影響,說明設(shè)計(jì)的引物特異性較好,PCR反應(yīng)條件合適。qRT-PCR分析表明(圖4),IHHmRNA在采集的所有組織中均有表達(dá),在軟骨組織中的表達(dá)量最高,與其他組織差異顯著(P<0.05),其次為十二指腸、肺和肝臟,在胸肌中的表達(dá)量最低。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The difference between the lowercase letters showed significant difference (P<0.05).圖4 IHH在雞各組織中mRNA表達(dá)量Fig.4 IHH mRNA expression in different chicken tissues

2.4 雞IHH氨基酸相似性分析

相似性分析表明,雞IHH氨基酸序列與環(huán)頸雉、鴨和黑天鵝的相似性較高,均在95%以上,與其他物種相似性較低,在76.4%～78.4%。氨基酸遺傳距離分析顯示,禽類(環(huán)頸雉、鴨和黑天鵝)與人、小鼠、豬、長臂猿和駱駝等的遺傳距離介于0.010～0.276,禽類中鴨與黑天鵝的遺傳距離最短為0.010 7。雞與其他禽類的遺傳距離在0.017～0.040,與人、鼠和豬等哺乳類動物的遺傳距離介于0.238～0.270。NJ分析結(jié)果表明,哺乳動物和禽類形成了明顯的2個分枝,結(jié)合相似性和遺傳距離的分析可知,IHH基因在禽類中具有較高的保守性(圖5)。

面對靜寧縣農(nóng)村飲水困難問題突出、供水工程建設(shè)任務(wù)繁重的形勢，要積極謀劃，發(fā)揮公共財(cái)政對水利的主導(dǎo)作用，在爭取公共財(cái)政投資和金融支持建設(shè)主體工程的同時，多渠道籌集資金，鼓勵農(nóng)民自愿投資投勞建設(shè)供水入戶工程，吸引社會資金投入提高供水入戶標(biāo)準(zhǔn)。建立以公共財(cái)政投入和金融支持、農(nóng)民投資投勞、社會資本參與為主要支撐的農(nóng)村供水工程投資穩(wěn)定增長機(jī)制。力爭到“十三五”末徹底解決靜寧縣農(nóng)村供水問題，全面提升飲水安全標(biāo)準(zhǔn)，為改善民生、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會又好又快發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

圖5 9個物種IHH氨基酸序列構(gòu)建NJ樹Fig.5 IHH amino acid sequences of 9 species constructed the NJ trees

2.5 雞IHH蛋白基本理化性質(zhì)分析

IHH蛋白大小為44.829 36 ku,理論等電點(diǎn)為9.38;相對分子質(zhì)量為44 778,分子式為C1998H3142N586O563S14。在組成IHH蛋白的20種氨基酸里,亮氨酸(Leu)的占比最高(11.5%),色氨酸(Trp)的占比最低(1.5%)。IHH蛋白的脂肪系數(shù)為83.73,不穩(wěn)定指數(shù)為33.38(小于40),預(yù)測為熱穩(wěn)定性蛋白。另外,疏水性預(yù)測也發(fā)現(xiàn),IHH蛋白只有7個位點(diǎn)具有疏水性,其中Ile疏水性最強(qiáng)(4.500),總平均疏水性參數(shù)為-0.254(圖6)。綜合推測,IHH蛋白為親水性蛋白。

圖6 IHH蛋白親疏水性預(yù)測Fig.6 The hydrophilic and hydrophobic prediction of IHH protein

2.6 雞IHH蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測

信號肽預(yù)測表明,C值為0.475,Y值為0.656,mean-S-score值為0.906(大于0.5),最可能的剪切位點(diǎn)在23～24(圖7(a))?？缒^(qū)分析表明,IHH蛋白位于細(xì)胞膜表面,在6～23氨基酸位點(diǎn)有一段跨膜端(圖7(b))。IHH蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,IHH蛋白主要定位在胞外(Extracellular)和高爾基體(Golgi apparatus)上。綜上可知,IHH蛋白為分泌蛋白。

圖7 IHH蛋白信號肽預(yù)測(a)和跨膜區(qū)域分析(b)Fig.7 IHH protein signal peptide prediction (a) and transmembrane region analysis (b)

2.7 雞IHH蛋白其他修飾位點(diǎn)預(yù)測

修飾位點(diǎn)預(yù)測提示,IHH蛋白具有11個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、14個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和5個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖8(a))。同時,雞IHH蛋白第278氨基酸殘基處有1處N型糖基化位點(diǎn)(圖8(b)),另有6處O型糖基化位點(diǎn)。

圖8 蛋白磷酸化位點(diǎn)(a)和N型糖基化(b)預(yù)測Fig.8 Prediction of protein phosphorylation site (a) and N-type glycosylation (b)

2.8 雞IHH蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

IHH蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析顯示(圖9(a)),α-螺旋比例為25.00%,延伸鏈比例為22.30%,β-轉(zhuǎn)角比例為8.58%,無規(guī)則卷曲占比最高(44.12%)。同序列構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)模型(圖9(b)),QMEAN為-0.14,接近于0,與模板蛋白相似度較高。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測在IHH蛋白的24～185氨基酸處存在HH-Signal功能域(圖9(c)),可能與胚胎細(xì)胞分化所需的分泌信號傳導(dǎo)有關(guān)。

(a)IHH蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。藍(lán)色,α-螺旋;紫色,無規(guī)則卷曲;紅色,延伸鏈;綠色,β-轉(zhuǎn)角;(b)IHH蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;(c)IHH蛋白結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測。(a) Secondary structure forecast of IHH protein. Blue, alpha helix; Purple, random coil; Red, extended strand; Green, beta turn; (b) Tertiary structure forecast of IHH protein; (c) IHH protein structure function domain prediction results.圖9 雞IHH蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 The structure forecast of IHH protein in chicken

3 討 論

家禽生產(chǎn)性能的高低與長骨的變化呈強(qiáng)正相關(guān),而家禽長骨形成的方式是軟骨內(nèi)成骨[20]。IHH基因已被證明在雞軟骨內(nèi)成骨的多個方面都起著重要作用[21-22],作為雞軟骨形成標(biāo)記基因被廣泛應(yīng)用于骨骼相關(guān)研究中[23-26]。Vortkamp等[21]發(fā)現(xiàn)雞IHH基因的錯誤表達(dá)會極大地影響軟骨分化過程。利用環(huán)巴胺抑制IHH后,雞軟骨細(xì)胞的增殖降低[10]。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒降低雞后肢發(fā)育過程中IHH的表達(dá),會導(dǎo)致長骨長度減少6%[27],而給予IHH蛋白可誘導(dǎo)雞骨生長[28]。金四華[14]發(fā)現(xiàn)雞IHH基因的缺失與匍匐性狀緊密相關(guān)。Ye等[29]推測IHH基因參與BMP6對雞軟骨細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控。上述研究表明,IHH基因的表達(dá)對家禽生產(chǎn)性能和疾病發(fā)生具有重要影響,因此對雞IHH基因的深入研究尤為重要。

基因結(jié)構(gòu)可為進(jìn)一步探究基因介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制提供重要參考。本研究利用生物信息學(xué)軟件對序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)雞IHH基因有3個外顯子,數(shù)目與牦牛[5]和人[30]的相同,編碼蛋白的大小與人IHH蛋白相近[30]。氨基酸相似性分析表明,IHH蛋白在家禽中較為保守,系統(tǒng)進(jìn)化樹在不同物種間出現(xiàn)明顯分支,這與前期在牛上的研究結(jié)果相似[31]。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能。本研究分析表明,IHH蛋白是有跨膜端的分泌蛋白,表明該蛋白可能在胞外進(jìn)行表達(dá)并參與生物活動,這與其生物學(xué)功能相契合。此外,雞IHH蛋白有較多的絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn),而絲氨酸和蘇氨酸在激活蛋白質(zhì)的過程中具有重要作用,這提示其可能具有較強(qiáng)的酶活力[32]。同時,結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn),雞與人IHH蛋白均具有3個結(jié)構(gòu)域,其突變致病位點(diǎn)大都位于N端結(jié)構(gòu)域[3,15],其中HH-Signal功能域內(nèi)含大部分的磷酸化位點(diǎn),與信號傳導(dǎo)和代謝等功能有關(guān)。

組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),IHHmRNA在雞軟骨、心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、胸肌、十二指腸和胸腺組織中均有表達(dá),其中在軟骨組織中顯著高表達(dá),其次為十二指腸、肺和肝臟,其在胸肌中表達(dá)相對最低,與人[33]和小鼠[34]中的研究結(jié)果基本一致。這進(jìn)一步說明軟骨組織是IHH基因發(fā)揮作用的重要靶器官,為深入研究IHH基因?qū)浌前l(fā)育的調(diào)控作用提供重要依據(jù)。

4 結(jié) 論

雞IHH基因具有多個啟動子區(qū)和1個CpG島,在禽類中保守性較高。雞IHH蛋白是一種具有偏堿性、強(qiáng)熱穩(wěn)性和低親水性等特點(diǎn)的分泌型蛋白。IHH基因具有組織表達(dá)特異性,在軟骨中顯著高表達(dá)。本研究可為進(jìn)一步從分子和細(xì)胞水平研究雞IHH基因?qū)浌前l(fā)育的調(diào)控作用提供重要參考。