王明成，劉道奇，劉超英，柴迎慧

（黃淮學院生物與食品工程學院，河南駐馬店 463000）

鞘氨醇單胞菌（Sphingononas sp.）是變形細菌中的α-4 亞類，屬于革蘭氏陰性細菌，是20 世紀末從假單胞菌中新分離的一類新屬[1]。該菌在環(huán)境修復、農(nóng)業(yè)發(fā)展、畜禽養(yǎng)殖中具有極大的應用潛力[2,3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，麻雞盲腸中分離的鞘氨醇單胞菌能有效降低養(yǎng)殖場氨氣含量[4]，并且能顯著提高雞的生長性能、雞肉和蛋的品質(zhì)[5]。因此，鞘氨醇單胞菌也被認為是重要的微生物菌劑之一。

目前，為提高微生物菌體濃度，通常采用分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、半連續(xù)發(fā)酵來提高菌體密度[6,7]。分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中會受到代謝產(chǎn)物的抑制，補料分批發(fā)酵是間歇或連續(xù)補料的分批培養(yǎng)方法，可以有效緩解有害代謝產(chǎn)物的積累，克服營養(yǎng)物質(zhì)的不足，延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時間，最終達到微生物高密度培養(yǎng)增大菌體密度的效果。段學輝等[8]研究發(fā)現(xiàn)，分批補料明顯加快了酒精酵母菌的生長并獲得了較高的細胞濃度。鞘氨醇單胞菌在以上培養(yǎng)條件下的細菌密度通常較低。

微膠囊是一類容許小分子物質(zhì)在膠囊內(nèi)自由出入以及代謝產(chǎn)物自由分泌，并可阻止外部生物大分子進入的材料[9]。液芯膠囊易于輸送物質(zhì)，細胞生長均勻，密度高，可用于乳酸菌、酵母菌的增殖和培養(yǎng)[9,10]。將菌液與無水氯化鈣、羧甲基纖維素鈉的混合物滴入海藻酸鈉溶液中，并用殼聚糖溶液成膜形成液芯微膠囊[7]，與補料分批培養(yǎng)方法相結合，來增加菌體密度。因此，本研究為增加鞘氨醇單胞菌的細胞密度首先對其發(fā)酵的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，然后使用最佳培養(yǎng)基進行微膠囊的高密度發(fā)酵，以提高鞘氨醇單胞菌的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

黃淮學院生物與食品工程學院微生物實驗室低溫保存的鞘氨醇單胞菌（Sphingononas sp.）。LB 培養(yǎng)基用于菌種活化、發(fā)酵種子液培養(yǎng)以及活菌數(shù)檢測。

羧甲基纖維素鈉購自鄭州派尼化學試劑廠；殼聚糖、乳糖、葡萄糖購自天津市大茂化學試劑廠；牛肉浸粉購自杭州百思生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

雙人單面超凈工作臺（SW-CJ-2FD）購自蘇州蘇潔凈化設備有限公司；電子分析天平（AR2140）購自梅特勒托利儀器（上海）有限公司；可見分光光度計（722）購自青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將實驗室保存的鞘氨醇單胞菌在超凈工作臺中接種到LB 液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min 培養(yǎng)活化。

1.3.2 生長曲線測定

將以上活化好的菌液以2%的接種量轉(zhuǎn)接至LB 培養(yǎng)基中，28℃、180r/min 培養(yǎng)48h。每2h取樣，檢測菌體吸光度（OD600），并繪制鞘氨醇單胞菌的生長曲線。

1.3.3 單因素優(yōu)化

首先進行單因素優(yōu)化：分別考察不同碳源種類及含量、不同氮源種類及含量、溫度、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、pH 值和菌液接種量對鞘氨醇單胞菌細胞密度的影響。

培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化：以LB 為基礎培養(yǎng)基，考察不同碳源（乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和果糖）、不同氮源、不同KH2PO4濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L）對鞘氨醇單胞菌細胞密度的影響，確定最適碳源、氮源以及最適的KH2PO4使用濃度。

培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化：分別設置溫度（25、28、30、35、37℃）、初始pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%），在28℃、180r/min 搖床培養(yǎng)48h，來確定最適溫度、初始pH 值和接種量。

然后，在單因素實驗的基礎上篩選出影響顯著的組分因子，以初始pH 值和溫度為考察因素，以菌體OD 值為考察指標，采用SPSS AU 正交試驗設計系統(tǒng)進行正交試驗設計。

1.3.4 微膠囊制備

將活化好的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在最適條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，25℃、2500r/min 離心15min，棄上清。在收集的菌體中加入5mL 生理鹽水將菌體重懸，隨后與45mL 4%（w/v）CaCl2和2%的羧甲基纖維素鈉混合溶液混合均勻。然后，用規(guī)格10mL 的一次性注射器或滴管滴入1.2%海藻酸鈉溶液，立即收集預膠囊并用無菌水沖洗，再放入0.1%的殼聚糖溶液中靜置30min，使微膠囊成膜[9]。最后用無菌水沖洗表面殘留的殼聚糖溶液，得到微膠囊[11]。

1.3.5 微膠囊后高密度培養(yǎng)

將制備好的鞘氨醇單胞菌的微膠囊，按照3%的接種量加入優(yōu)化后的培養(yǎng)基中于30℃、pH 6.0、180r/min 培養(yǎng)48h。然后，在無菌條件下將液芯微囊濾出，轉(zhuǎn)移到新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。采用以上方法連續(xù)培養(yǎng)5 次后，將液芯微囊濾出，用無菌水洗滌液芯微囊外殘留的菌體。然后，采取化學法將液芯微囊破碎，最后使用平板稀釋涂布法檢測每克液芯微囊內(nèi)的菌體數(shù)量。

1.3.6 活菌總數(shù)測定

囊內(nèi)活菌計數(shù)：取培養(yǎng)結束的完整膠囊，將微膠囊與破囊液按照1∶10 的比例混合，劇烈振蕩使其破碎完全。然后，將其稀釋進行平板涂布活菌計數(shù)，單位為CFU/g。

破囊液：0.06mol/L 的檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）和0.2mol/L 的碳酸氫鈉（NaHCO3）混合溶液。

培養(yǎng)基菌液活菌計數(shù)與制作微膠囊并進行高密度培養(yǎng)的過程各設置3 組平行試驗，計數(shù)取3組菌落數(shù)平均值作為最后菌落計數(shù)結果。

1.3.7 微膠囊的切面觀察

取培養(yǎng)完整的膠囊切片，放出囊內(nèi)菌液，在體視顯微鏡下觀察其囊壁及孔隙。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SAS V8 分析顯著性差異，正交設計助手Ⅱ設計正交試驗，GraphPad Prism 繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 鞘氨醇單胞菌的生長曲線

由圖1 可知，鞘氨醇單胞菌生長曲線，在0～6h 生長緩慢為延滯期，6～38h 快速增長進入對數(shù)生長期，38h 后菌體密度達到最高且不再增加，進入穩(wěn)定期，因此以38h 的菌液為最佳培養(yǎng)時間，進行下一步研究所用。

圖1 鞘氨醇單胞菌的生長曲線

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 碳源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖2 可知，以蔗糖為碳源時OD600最高，OD600為0.659，其次是葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖。因此，選擇蔗糖為最適碳源。

圖2 不同碳源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.2 不同蔗糖濃度對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖3 可知，當蔗糖濃度為10～40g/L 時，菌體的OD600呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當蔗糖濃度為25g/L 時，OD600最高（0.772），比20g/L蔗糖時的OD600（0.646）提高19.5%。繼續(xù)增加蔗糖濃度，OD600呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，可能是高濃度的蔗糖使鞘氨醇單胞菌細胞膜內(nèi)外的滲透壓不平衡，抑制了細胞的生長。因此，選擇25 g/L蔗糖濃度為鞘氨醇單胞菌為最適碳源含量。

圖3 不同蔗糖添加量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.3 氮源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖4 可知，鞘氨醇單胞菌對有機氮源（牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉）均有較高的利用率，其中酵母浸粉的促生長效果略微優(yōu)于其余2 種，菌體OD600達到0.772，但對無機氮源（尿素和硫酸銨）利用率較差。因此，選擇酵母浸粉為最適氮源。

圖4 不同氮源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.4 不同氮源濃度下鞘氨醇單胞菌的生長情況

由圖5 可知，酵母浸粉濃度對菌體OD600的影響，整體上表現(xiàn)為先升高后降低，在20～30g/L 添加量范圍內(nèi)，菌體OD600幾乎相當，最大OD600為0.715，當濃度繼續(xù)增加至30g/L 以上后，菌體OD600反而明顯降低，可能是過高的氮源濃度對菌的生長產(chǎn)生抑制作用?？紤]到實際中的應用成本，選擇20g/L 酵母浸粉濃度為鞘氨醇單胞菌為最適碳源含量。

圖5 不同酵母浸粉添加量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.5 不同濃度KH2PO4條件下鞘氨醇單胞菌的生長情況

由圖6 可知，KH2PO4濃度為0.5～3.5g/L 時，菌體OD600表現(xiàn)為先升高后降低。在0.5～2.0g/L時，菌體OD600顯著升高，最大OD600為0.92。當KH2PO4濃度繼續(xù)增加后，菌體OD600緩慢降低，可能是過高的KH2PO4濃度產(chǎn)生滲透脅迫作用，對菌的生長產(chǎn)生抑制作用。再結合實際中的生產(chǎn)應用，選擇2.0g/L KH2PO4進行下一步試驗。

圖6 不同KH2PO4 添加量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.6 不同接種量條件下鞘氨醇單胞菌的生長情況

以LB 為基礎培養(yǎng)基，接種量大小對鞘氨醇單胞菌生長的影響如圖7 所示。當接種量為1.0%～3.0%時，菌體OD600逐漸增加，當接種量達到3.0%時鞘氨醇單胞菌的OD600達到較大值，為0.673。隨著接種量的繼續(xù)增加，菌體OD600反而下降。接種量在3.0%～5.0%對鞘氨醇單胞菌生長的影響無差異，且考慮到菌種活性和代謝產(chǎn)物積累問題，接種量過大時生長條件受限，選取3%為實驗所用接種量。

圖7 不同接種量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.7 不同pH 值條件下鞘氨醇單胞菌的生長情況

初始pH 值對菌體生長的影響如圖8 所示。pH 值在3.0～5.0 范圍內(nèi)，鞘氨醇單胞菌生長情況較差，在pH 值為6.0 時OD600（0.783）達到最大。繼續(xù)增加pH 時，鞘氨醇單胞菌的生長明顯被抑制。因此，選用培養(yǎng)液初始pH 6.0 為最佳培養(yǎng)液pH 值。

圖8 不同初始pH 對鞘氨醇單胞菌的影響

2.2.8 不同溫度對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖9 可知，當溫度為25～37℃時，菌體的OD600呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當培養(yǎng)溫度為30℃時，鞘氨醇單胞菌的OD600達到最大，為1.011，且差異顯著。因此，選擇30℃為最適培養(yǎng)溫度。

圖9 不同培養(yǎng)溫度對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.3 正交試驗結果

利用統(tǒng)計學分析方法，根據(jù)單因素試驗結果確定對鞘氨醇單胞菌生長情況顯著影響的因素：溫度和培養(yǎng)液初始pH 值，結合SPSS AU 正交試驗設計系統(tǒng)，采用2 因素4 水平L16(42)正交設計方法，來確定最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，正交試驗設計表如表1 所示。

表1 正交試驗二因素四水平設計表L16 (42)

由表2 可知，對鞘氨醇單胞菌的生長有顯著影響的因素為：溫度和培養(yǎng)液pH，且最佳培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)液初始pH 為6.0。且由以上研究分析結果可知，鞘氨醇單胞菌的最適培養(yǎng)基是：蔗糖 20.0g，酵母浸粉 25.0g，NaCl 10.0g，KH2PO42.0g，接種量為3%，蒸餾水1000mL。

表2 正交試驗分析結果

2.4 微膠囊后高密度培養(yǎng)結果

2.4.1 鞘氨醇單胞菌微膠囊的切面觀察結果

取培養(yǎng)完整的膠囊切片，倒出囊內(nèi)菌液，在體視顯微鏡下觀察其囊壁及孔隙，如圖10 所示。膠囊囊壁較薄，孔隙較明顯，通透性良好，微膠囊高密度培養(yǎng)效果較好，說明液芯微包囊可以對菌體起到較好的保護作用。

圖10 微囊切面10×1.7

2.4.2 驗證試驗

基于以上優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，采用微囊化發(fā)酵鞘氨醇單胞菌，連續(xù)培養(yǎng)5次，其細胞密度的變化見圖11。鞘氨醇單胞菌微囊化后在第1～4 批的培養(yǎng)過程中細胞密度逐漸增加，達到5.17×109CFU/mL。當連續(xù)培養(yǎng)到第5代時細胞密度略有降低，可能是培養(yǎng)次數(shù)過多菌體老化所致，故確定培養(yǎng)代數(shù)為4 代。而游離條件下鞘氨醇單胞菌細胞密度只在1～2 培養(yǎng)批次時逐漸增加，達到最高的1.42×109CFU/mL，之后所有培養(yǎng)批次中均無變化。

圖11 鞘氨醇單胞菌微囊化后連續(xù)培養(yǎng)過程中囊內(nèi)細胞密度的變化

2.4.3 活菌計數(shù)結果

由表3 可知，鞘氨醇單胞菌在高密度液體培養(yǎng)條件下的活菌總數(shù)是原培養(yǎng)基正常培養(yǎng)下的8.07 倍，而微囊化高密度培養(yǎng)下的活菌總數(shù)是高密度液體培養(yǎng)下的3.64 倍，是原培養(yǎng)基正常培養(yǎng)條件下的29.4 倍。

表3 不同培養(yǎng)條件下活菌計數(shù)結果

3 結論

本研究通過單因素試驗探究碳源種類及含量、氮源種類及含量、溫度、pH 值和接種量七個因素對鞘氨醇單胞菌生長的影響，隨后采用正交試驗（2 因素4 水平）確定最佳培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)條件為：蔗糖20.0g/L，酵母浸粉25.0g/L，NaCl 10.0g/L，KH2PO42.0g/L，pH 6.0，培養(yǎng)溫度為30℃，pH 為6.0，接種量為2%。鞘氨醇單胞菌在高密度液體培養(yǎng)條件下得到的菌落總數(shù)達到1.42×109CFU/mL，是初始培養(yǎng)基正常培養(yǎng)條件下的8.07 倍。隨后，運用液芯微膠囊法包埋技術制備微囊化鞘氨醇單胞菌，將培養(yǎng)完整的膠囊制切片在體視顯微鏡下觀察可知，膠囊囊壁較薄，孔隙較明顯，通透性良好。微囊化鞘氨醇單胞菌在最適條件下培養(yǎng)5 代，菌落總數(shù)達到5.17×109CFU/mL，是高密度液體培養(yǎng)條件下活菌數(shù)量的3.64 倍，是原培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的29.4 倍。菌體密度得到大幅度提升，顯著提高了鞘氨醇單胞菌的產(chǎn)量。