徐淑娜 王磊 劉艷萍

肺炎克雷伯菌存在于腸道、皮膚和口腔,是醫(yī)院獲得性感染的常見原因[1]。肺炎克雷伯菌引起的肺炎由于其并發(fā)癥發(fā)生率高,在目前的抗菌治療下死亡率高達50%[2]。此外,感染肺炎克雷伯菌的患者通常合并有哮喘、過敏性氣道炎癥、慢性阻塞性肺疾病等,使其治療具有挑戰(zhàn)性[3-5]。因此,揭示克雷伯菌感染過程中的分子機制意義重大。微小RNA (microRNA,miRNA)是一類長約19～22個核苷酸的非編碼RNA,參與基因表達的轉錄后調控,在不同生物過程中都是必不可少的,如發(fā)育、分化、增殖、細胞死亡和疾病進程[6]。目前,miRNA差異表達已被報道是炎癥性疾病的重要調控因子[7,8]。miR-183-5p被報道在慢性心力衰竭伴肺部感染患者的外周血中高表達,與患者的肺部感染嚴重程度有關[9]。本研究通過建立克雷伯菌感染肺炎大鼠,探討miR-183-5p功能獲得和缺失對大鼠肺損傷的影響,并進一步分析其潛在的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采集2020年1月至2022年1月山東第一醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院收治的34例重癥肺炎患者的血液樣本(重癥肺炎患者組),另采集41例健康志愿者的血液作為健康組,部分血樣經離心后保存血清備用。重癥肺炎患者均符合相關診斷標準,且2組受試者的年齡、性別比等一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。樣本采集均獲得受試者的知情同意。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組:36只成年雄性SD大鼠(200～250 g)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。miR-183-5p mimics和miR-183-5p inhibitor由廣州銳博生物科技有限公司提供。肺炎克雷伯菌購自武漢淼靈生物科技有限公司。將大鼠隨機分為4組:對照組、模型組、過表達組和干擾組,每組9只。在造模前24 h,過表達組經氣管穿刺注入miR-183-5p mimics,干擾組注入miR-183-5p inhibitor,對照組和模型組注入等量0.9%氯化鈉溶液。然后,除對照組外,其他組根據參考文獻[10],經導管注射克雷伯菌液至大鼠氣管,構建肺炎大鼠模型。造模成功后24 h,采集4組大鼠主動脈血液樣本,小鼠安樂死,取肺組織樣本。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR):采用Trizol試劑提取血清和肺組織的總RNA,使用逆轉錄酶合成cDNA,然后SYBR Green法行qRT-PCR反應,結果分別以U6和GAPDH為內參對照,采用2-ΔΔct法計算miR-183-5p和SOCS6 mRNA的相對表達水平。引物序列如下:miR-183-5p正向5’-GTATGATATGGCACTGGTAGAATTC-3’,反向5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;SOCS6正向5’-CGCTAGCCAGTGACTTTGGA-3’,反向5’-TCTGTTTTGCAGAAAGCCGC-3’;U6正向5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3’,反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;GAPDH正向5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,反向5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA):嚴格根據試劑盒說明書,檢測血清樣本中炎性因子白細胞介素1β(IL-1β)、IL-4、IL-6和IL-10的水平。

1.2.4 流式細胞術檢測外周血Th17和Treg細胞比例:分別取受試者和大鼠的抗凝血,Ficoll法分離外周血單個核細胞,并將懸液等量分到測定流式管和對照流式管中。測定管中分別加入PERCP標記的CD4抗體和FITC標記的CD25抗體,然后加入稀釋的IL-17A進行破膜,最后分別加入IL-17抗體、Foxp3抗體,對照管加入IgG抗體,孵育后,上機檢測。

1.2.5 Western blot:使用RIPA裂解液提取大鼠肺組織的總蛋白。取適量蛋白樣品,高溫變性后,進行SDS-PAGE電泳分離,并轉移至PVDF膜。然后,將膜分別與抗SOCS6一抗和抗GAPDH一抗,4℃共孵育過夜;再與辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫下,孵育2 h。使膜在ECL發(fā)光液中顯色,曝光、拍照,使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗:本研究利用TargetScan在線數據庫預測到miR-183-5p與SOCS6的3’UTR具有互補結合位點。將含有miR-183-5p結合位點的SOCS6 3’UTR野生序列(WT-SOCS6)和突變序列(MUT-SOCS6)分別構建雙熒光素酶報告基因載體,然后分別與miRNA mimics (miR-con)、miR-183-5p mimics(miR-183-5p)、miRNA inhibitor (anti-miR-con)和miR-183-5p inhibitor (anti-miR-183-5p)共轉染293T細胞,轉染48 h后,檢測細胞中熒光素酶活性。

2 結果

2.1 2組血清中miR-183-5p、SOCS6 mRNA和炎性因子水平 與健康組比較,重癥肺炎患者血清樣本中miR-186-5p相對表達水平明顯升高(P<0.05),SOCS6 mRNA相對表達水平明顯降低(P<0.05),IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10水平均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清中miR-183-5p、SOCS6 mRNA和炎性因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平比較

2.2 2組外周血中Th17 和Treg表達比較 與健康組比較,重癥肺炎患者組外周血中Th17水平明顯升高(P<0.05),Treg水平明顯降低(P<0.05),Th17/Treg比例明顯升高(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 流式細胞術檢測Th17 和Treg 比例

表2 2組外周血中Th17 和Treg表達比較

2.3 4組大鼠肺組織miR-183-5p和SOCS6以及Holfbauer病理評分表達 與對照組比較,模型組miR-186-5p表達水平明顯升高(P<0.05),SOCS6 mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05);與模型組比較,過表達組miR-186-5p表達水平明顯升高(P<0.05),SOCS6 mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05),而干擾組miR-186-5p表達水平明顯降低(P<0.05),SOCS6 mRNA和蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。與對照組比較,模型組Holfbauer病理評分明顯升高(P<0.05);與模型組比較,過表達組Holfbauer病理評分明顯升高(P<0.05),而干擾組降低(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 SOCS6蛋白表達

表3 miR-183-5p和SOCS6在大鼠肺組織中的表達

2.4 4組大鼠血清炎性因子水平比較 與對照組比較,模型組IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10水平均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,過表達組IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10水平均明顯升高,而干擾組IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠血清中炎性因子水平比較

2.5 4組大鼠外周血中Th17 和Treg 比例比較 與對照組比較,模型組Th17水平明顯升高(P<0.05),Treg水平明顯降低(P<0.05),Th17/Treg比例升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,過表達組Th17水平明顯升高(P<0.05),Treg水平明顯降低(P<0.05),Th17/Treg比例升高(P<0.05),而干擾組Th17水平明顯降低(P<0.05),Treg水平明顯升高(P<0.05),Th17/Treg比例降低(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 流式細胞術檢測Th17 和Treg 比例

表5 4組肺炎大鼠外周血中Th17 和Treg表達比較

2.6 miR-183-5p靶向SOCS6調控其表達 TargetScan在線預測miR-183-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-183-5p與SOCS6的3’UTR具有互補結合位點,如圖4A所示。熒光素酶報告基因實驗結果顯示,與miR-con+WT-SOCS6組比較,miR-183-5p+WT-SOCS6組熒光素酶活性明顯降低(P<0.05);與anti-miR-con+WT-SOCS6組比較,anti-miR-183-5p+WT-SOCS6組熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)。此外,Western blot結果顯示,與miR-con組比較,miR-183-5p組SOCS6蛋白水平明顯降低(P<0.05);與anti-miR-con組比較,anti-miR-183-5p組SOCS6蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖4,表6。

圖4 miR-183-5p靶向SOCS6;A 結合位點;B 熒光素酶結果

表6 雙熒光素酶報告實驗

3 討論

肺炎是一種由細菌或病毒等感染肺部引起的炎癥性病變,尤多見于嬰幼兒[11]。重癥肺炎是肺炎的危重階段,常伴有呼吸衰竭和其他系統(tǒng)明顯受累,病情嚴重且進展迅速[12]。臨床上對重癥肺炎的準確診斷、及時救治,可有效降低患者的病死率。因此,深入研究重癥肺炎的發(fā)病機制具有重要臨床意義。

miRNA可通過與靶向mRNA的3’UTR區(qū)結合,抑制mRNA的翻譯或引起mRNA不穩(wěn)定,調節(jié)基因表達,從而參與調控各種生理或病理過程[13,14]。已有研究報道,miRNA差異表達與肺炎發(fā)生和進展密切相關[10,15];重癥肺炎患者肺泡灌洗液中miR-127-5p表達升高提示患者治療效果較好[16];此外,動物模型實驗顯示,miR-149-5p過表達可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通過,減輕克雷伯菌致重癥肺炎大鼠的炎性質反應[17];miR-34a在克雷伯菌感染的重癥肺炎大鼠中高表達,可通過調控SIRT1基因表達,影響大鼠肺功能[18]。本研究結果顯示,miR-183-5p在重癥肺炎患者血清中高表達,而SOCS6呈低表達。以上均提示miR-183-5p可能與重癥肺炎相關。

重癥肺炎發(fā)生時,機體可產生大量促炎細胞因子,激活機體過度的炎性反應,最終導致全身炎性反應綜合征[19]。本研究檢測健康者和重癥肺炎患者血清中炎性因子水平,證實重癥肺炎患者血清中具有較高水平的促炎因子IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10。研究表明,機體免疫功能失調是導致炎性反應的主要原因[20]。Th17是一個新的CD4+T細胞亞群,其分泌的IL-17是重要的促炎因子,可通過激活趨化因子,招募大量中性粒細胞和單核細胞,促進炎性細胞因子釋放,從而介導組織炎性反應[21]。已有研究表明,Th17分泌的IL-17和IL-23是克雷伯菌感染肺炎的早期促炎因子,參與重癥肺炎的發(fā)生[22]。此外,調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell,Treg)是與Th17具有相反作用的T細胞亞群[23];據報道Th17和Treg的平衡在維持機體免疫中非常重要,炎癥下,Treg可以轉換呈Th17,Th17/Treg失衡可促進炎癥性疾病進展[24]。本研究在重癥肺炎患者外周血中發(fā)現(xiàn)Th17細胞比例升高,Treg細胞比例降低,Th17/Treg比例升高,提示機體炎性反應可能與Th17/Treg失衡有關。

本研究證實了miR-183-5p是重癥肺炎中上調的miRNA。為進一步探討miR-183-5p的表達與重癥肺炎有關,本研究構建了miR-183-5p功能獲得和功能缺失的重癥肺炎大鼠模型,與上文結果一致,模型組大鼠肺組織中存在高表達的miR-183-5p,且大鼠血清中炎性因子水平、外周血Th17/Treg比例和Holfbauer病理評分均較高,提示模型構建成功。目前,已有多項研究證實,Th17/Treg失衡在重癥肺炎的發(fā)病和疾病進程中起關健作用,因此調控Th17/Treg平衡對緩解重癥肺炎非常重要[25,26]。本研究大鼠模型實驗結果顯示,miR-183-5p過表達明顯促進了重癥肺炎大鼠的炎性因子分泌和Th17/Tregh比例失衡,加重大鼠的肺損傷,而干擾miR-183-5p表達后則表現(xiàn)出相反的作用,提示miR-183-5p參與重癥肺炎的肺損傷過程。此外,本研究進一步探究了miR-183-5p的潛在調控基因,發(fā)現(xiàn)miR-183-5p與SOCS6的3’UTR具有互補結合位點。細胞因子信號轉導抑制因子6(suppressor of cytokine signaling 6,SOCS6)是一種抑癌相關的基因,已被大量報道參與調控癌癥進展[27]。最近有研究表明,靶向SOCS6可能改善牙周炎、膿毒癥肺損傷和視網膜上皮細胞炎性反應,提示SOCS6與炎癥性細胞損傷有關[28-30]。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-183-5p能夠與SOCS6靶向結合,并負調控SOCS6基因表達。這一結果提示SOCS6可能是miR-183-5p調控重癥肺炎的下游效應因子,但仍需進一步實驗驗證。

綜上所述,重癥肺炎患者血清和大鼠肺組織中miR-183-5p均呈高表達,過表達miR-183-5p可加重重癥肺炎大鼠的肺損傷,而miR-183-5p表達缺失則能改善重癥大鼠的肺損傷,其作用機制可能與調控SOCS6基因表達有關。