張筠昊 白皓天 梁霄 文武龍 張煒燁 李婭蘭 孫鑫 肖展 楊婧 王銳

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性關節(jié)疾病,主要特征是持續(xù)性滑膜炎、全身性炎癥和自身抗體的生成,同時會導致軟骨損傷、關節(jié)殘疾以及心血管和肺部等疾病。其發(fā)病原因復雜[1-3],但與線粒體密切相關,線粒體功能障礙會誘導關節(jié)炎癥,導致RA的產生?，F(xiàn)階段治療RA方法包括藥物治療、手術治療和基因治療等,目前非甾體抗炎藥是治療RA的一線藥物,雖然可以在短時間內緩解疼痛,但療效短暫無法無法抑制RA的病程發(fā)展,同時存在著胃腸道反應等不良反應,因此,中藥以其治療RA毒副作用較小,干預基因和線粒體等多靶點多途徑等優(yōu)點,在RA治療領域扮演者越來越重要的角色。自噬 (autophagosome)指細胞將本身待降解物通過雙層膜包裹形成自噬體,運輸到溶酶體形成自噬溶酶體降解包容物,并完成細胞的本身代謝和衰老死亡細胞器的更新的過程[4]。根據底物的不同分為微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperonemediated autophagy,CMA)。自噬參與到蛋白質的代謝、清除破損線粒體和細胞重建的過程中,并通過更新受損的線粒體維持細胞、組織和機體的穩(wěn)態(tài)平衡,且該過程廣泛地存在于細胞的病理生理過程中。隨著自噬研究的不斷深入,自噬在RA中作用引起國內外學者的廣泛關注,其在RA疾病發(fā)展中扮演著越來越重要的角色,因此撥開RA與自噬之間的層層迷霧,可為RA的治療提供一定的啟發(fā)。Beclin-1是自噬的重要標志物,作為自噬的起始因子并參與到細胞中的自噬和凋亡,也是合成自噬體的必需基因,并引導自噬蛋白定位自噬泡進而達到調控自噬體的生成[5,6],同時可通過調控Beclin-1激發(fā)自噬活性抑制RA、神經退行性疾病和腫瘤等疾病。Beclin-1在上述疾病中扮演重要的角色,深入研究中藥調節(jié)Beclin-1管控細胞自噬治療RA的作用機制具有重要意義。本文對中藥調控Beclin-1通過自噬治療RA的機制的研究進展進行綜述性總結。

1 自噬與線粒體

自噬是細胞維持穩(wěn)態(tài)的保護機制,通過更新清除功能失調的細胞器來運轉維持整個機體[7]。而線粒體是細胞內重要的樞紐,對維持細胞及細胞器的平衡有著重要的作用,細胞器調控包括自噬在內的多種生理活動。自噬的激活降低線粒體障礙的風險,同時抑制自噬會導致明顯的線粒體功能障礙,自噬防止軟骨細胞中線粒體功能的失調,而線粒體功能的障礙也會導致體內自噬反應的降低[8]。同時高活性氧(ROS)條件下,線粒體會出現(xiàn)功能障礙,體內自噬的激活降低,從而導致線粒體的功能和屏障完整性消失[9,10],并且ROS升高導致膝關節(jié)軟骨細胞的合成降低,炎性反應的增加導致線粒體功能障礙,而線粒體的功能障礙會誘發(fā)RA等退行性疾病。

2 自噬與RA

自噬與RA在內的多種風濕疾病密切相關[11],自噬促進自我耐受,但異常的自我耐受會導致RA等風濕免疫疾病,全基因組關聯(lián)研究(GWAS)將自噬與風濕免疫性疾病相關聯(lián),證明自噬在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮功能性作用。自噬與類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞(RASFs)相關,自噬的抑制促進RASFs的凋亡,即表明其參與RASFs細胞凋亡過程[12]。自噬和凋亡之間平衡機制的改變被認為是RA的致病原因,由自噬過程介導的凋亡導致了進行性的骨和軟骨的破壞[13],研究表明,破骨細胞的形成和自噬途徑之間存在著聯(lián)系,在實驗性關節(jié)炎小鼠模型中,經過自噬抑制劑的治療,骨侵蝕明顯減少[14]。自噬不但在破骨細胞生成中發(fā)揮作用,而且也導致促炎因子的分泌、產生、增殖。自噬對細胞有雙重作用,正常條件下,自噬對細胞具有保護作用,誘導條件下,則會導致細胞的死亡。自噬相關的炎癥和組織增生會導致關節(jié)的破壞,而破骨細胞內自噬蛋白增加會進一步導致骨吸收發(fā)生,并促進骨和軟骨的關節(jié)破壞[15]?？构习彼岬鞍卓贵w(ACPAs)可以導致滑膜炎和軟骨破壞,自噬促進瓜氨酸多肽表達和ACPAs的產生,而增加的自噬導致RA成纖維細胞樣滑膜細胞產生瓜氨酸蛋白,同時成纖維樣滑膜細胞(FLS)與ACPAs呈現(xiàn)出正相關[16],表明自噬參與到瓜氨酸酸化過程當中。

3 自噬與Beclin-1基因

Beclin-1在自噬體形成起到關鍵性作用,是自噬與凋亡途徑的重要匯聚點[17,18]。Beclin-1可以通過與抗凋亡家族基因Bcl-2結合來抑制自噬體的形成,在沒有刺激的條件下,Beclin-1與Bcl-2等形成復合物,但在內外部刺激下,Beclin-1在復合物中被釋放從而激活自噬體的形成。此外,多種自噬基因表達受Beclin-1的統(tǒng)籌調控,Beclin-1調節(jié)自噬的正相關因子Protein-1和AMBRA1,而miR-30a與Beclin-1的含量呈負相關,Beclin-1調節(jié)miR-30a表達來介導自噬[19],Beclin-1激活會增強TNF-α的表達。Beclin-1在RASFs自噬誘導的復雜網絡中代表著決定性節(jié)點,并在自噬調節(jié)中起到不可或缺的作用。研究表明,在RA發(fā)展過程中,Beclin-1在成纖維細胞中表達降低,并通過Beclin-1表達水平的波動監(jiān)測RA滑膜細胞變化[20]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),Beclin-1、自噬和線粒體的相關性,在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。見圖1。

圖1 Becling-1基因調控細胞自噬及線粒體自噬的過程

4 單味中藥干預Beclin-1調節(jié)自噬抗類風濕性關節(jié)炎

單味中藥與成分復雜的復方相比,藥效較為明確,而從單味中藥中提取的中藥單體是現(xiàn)代醫(yī)學和傳統(tǒng)中醫(yī)藥相結合的產物,其結構簡單、成分單一便于進行質量安全性評價。當前發(fā)現(xiàn)的通過調控Beclin-1治療RA的單體有白藜蘆醇、大黃素、烏頭堿和雷公藤甲素等。

4.1 虎杖 虎杖根部富含白藜蘆醇(Resveratrol,Res),Res具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、改善微循環(huán)等藥理作用。Res的作用機制是通過靶向下調Beclin-1的表達水平以降低FLS的自噬水平,自噬水平的降低導致活性氧類的積累、線粒體功能障礙,并誘導FLS凋亡和線粒體形態(tài)的改變,進一步促進FLS中線粒體膜電位的崩解丟失和ATPL能力的改變,Zhang等[21]實驗論證Res改變線粒體膜電位從而靶向逆轉降低自噬蛋白Beclin-1在FLS中的表達,抑制大鼠的氧化應激,增加mtROS的產生,從而促進FLS的凋亡,Res干預細胞的信號通路調節(jié)線粒體通透性,損傷線粒體膜電位[22,23],破壞電子呼吸鏈[24],增加線粒體超氧陰離子的產生。Res通過細胞途徑誘導FLS凋亡,致使線粒體膜中的結構和自噬基因發(fā)生改變。同時細胞內ATPL的產生與Res濃度呈負相關[25]。Res增強大鼠體內的自噬通量來調節(jié)滑膜增生,在此過程減少NF-κB通路控制滑膜炎癥[26],口服Res增強自噬通量并調節(jié)炎癥的串擾存在而對RA具有保護作用。此外,關節(jié)內注射Res誘導自噬來延緩軟骨退化[27-30],明顯阻止線粒體功能障礙引起的血管生成反應從而調節(jié)血管生成來抑制滑膜的異常增殖。

4.2 大黃素 大黃素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗癌抗腫瘤等多種藥理作用。中性粒細胞(neutrophilie granulocyte,NE)在治療RA中發(fā)揮積極作用[31],NE浸潤炎癥組織后,分泌大量的炎性因子,加重滑膜組織的炎性反應[32],并且在遷移到RA關節(jié)后會延遲自發(fā)凋亡,同時誘導宿主組織損傷的能力得到增強。Zhu等[33]研究證明大黃素顯著降低白細胞和NE的聚集,抑制體外NE的遷移和激活,顯著性下調炎性因子水平、減少炎癥細胞浸潤,緩解骨侵襲,同時大黃素特異性下調Beclin-1水平顯著抑制NE自噬,并調節(jié)NE體內過程以減低關節(jié)炎癥反應,因此,大黃素靶向調控Beclin-1調節(jié)體內NE活性干預自噬治療RA,使關節(jié)功能正常化。潘書涵等[34]在模型組給藥后,大黃素下調大鼠體內自噬基因的表達,抑制細胞自噬和凋亡,減低炎性反應,降低軟骨和骨的損傷,抑制新生血管形成。

4.3 烏頭 烏頭具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調節(jié)免疫、抗腫瘤等功效,在中醫(yī)古籍中有烏頭“主癱瘓頑疾”之記載。研究證明,烏頭通過上調Beclin-1的表達水平,降低P62蛋白的表達進而誘導細胞自噬[35],烏頭中的有效成分顯著增加Beclin-1的表達,Beclin-1在保護性自噬的調節(jié)中激活ERK1/2、p38信號通路和p53基因[36],并以時間依賴性方式增強p53表達水平,激活的p53、ERK1/2和p38誘導自噬,且P53抑制與自噬相關的mTOR,在自噬相關靶基因的轉錄調控中起重要作用[37]。邵鑫等[38]以不同濃度的烏頭堿對RA-FLS細胞處理后發(fā)現(xiàn),烏頭堿通過促進自噬體的產生,進而導致RA-FLS細胞的凋亡。因此,烏頭靶向調控Bclin-1的表達干預自噬,從而實現(xiàn)干預疾病的的過程。

4.4 雷公藤 雷公藤是治療RA的傳統(tǒng)中藥,雷公藤具有抗炎、免疫抑制等藥理作用,雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是雷公藤主要活性成分,王明霞等[39]分別給與RA-FLSs不同濃度的TPL處理后,觀測Beclin-1自噬因子的表達水平和TPL干預自噬的機制,表明TPL呈濃度依賴性有效抑制RA-FLSs增殖活力,并顯著下調RA-FLSs的Beclin-1蛋白水平減弱自噬作用,達到抑制RA-FLSs增殖及促進凋亡的目的。研究證明,Beclin-1是細胞自噬啟動過程中的關鍵調節(jié)因子[40],Xie等[41]研究發(fā)現(xiàn),TPL下調Beclin-1抑制MH7A細胞的自噬水平,并呈濃度依賴性,而自噬抑制MH7A細胞的活動并維持機體的氧化還原平衡,同時該實驗機制研究顯示TPL激活MH7A細胞的PI3K/AKT信號通路減少Beclin-1的表達來抑制自噬,可見,TPL靶向調節(jié)Beclin-1干預自噬機制發(fā)揮其對RA的治療作用。

5 中藥復方調控Beclin-1干預自噬抗類風濕性關節(jié)炎

中藥復方是中醫(yī)用藥的傳統(tǒng)方式,將兩種或兩種以上的中藥按照不同比例配伍使用,并根據中醫(yī)望聞問切、辨證論治的結果,對復方進行加減使用,多味中藥復合使用,可以到達相輔相成,增效減毒的目的。目前,通過調控Beclin-1治療RA的復方有當歸拈痛湯、當歸四逆湯和金烏健骨湯等。

5.1 當歸拈痛湯 當歸拈痛湯首見于清代醫(yī)家張元素的《醫(yī)學啟源》,具有疏風止痛、利熱清濕,組方正邪兼顧、內外同治、氣血并調、上下分消的功效的功效,是治療風濕熱痹癥的經典名方[42,43],現(xiàn)代臨床主要用于RA、下肢關節(jié)痛等濕熱相博病癥,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)當歸拈痛湯具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)等作用。陸麒瑾等[44]通過分組給藥的方式對RA-FLS細胞進行干預,發(fā)現(xiàn)當歸拈痛湯通過靶向下調Beclin-1的表達干預自噬,同時提高RA-FLS細胞的凋亡水平,自噬的調節(jié)有效抑制RA-FLS細胞的遷移和侵襲,同時自噬的降低會明顯抑制成纖維細胞的增殖。在風濕熱痹型佐劑型關節(jié)炎大鼠體外實驗中,探究Beclin-1在RA中的作用發(fā)現(xiàn),當歸拈痛湯減輕RA急性期炎癥,滑膜細胞增生和炎性細胞浸潤得到有效改善,精確靶向下調Beclin-1的表達調節(jié)自噬水平來實現(xiàn)使關節(jié)炎病情的有效緩解[45]。

5.2 當歸四逆湯 當歸四逆湯源于古代醫(yī)圣張仲景的《傷寒雜病論》,以當歸、桂枝、芍藥等入藥,具有溫經散寒,養(yǎng)血通脈之功效,主治血虛寒厥證[46,47]。其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解除痙攣等藥理作用,現(xiàn)代臨床應用于RA、心腦血管疾病等。研究證明,TLR/Beclin-1信號通路可激活誘導組織釋放炎性因子,同時提高成纖維細胞生長因子活性,介導T淋巴細胞進一步增殖,刺激人體免疫反應[48]。TLR蛋白介導多種活化因子傳遞進細胞內,誘導細胞因子的產生,而Beclin-1可特異性參與到機體的自噬中,范衛(wèi)闖等[49]發(fā)現(xiàn),當歸四逆湯可下調RA關節(jié)組織TLR/Beclin-1信號通路中Beclin-1的表達,進而抑制負反饋蛋白的表達,從而干預炎癥信號通路的傳導,并抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的表達,調節(jié)機體的自噬過程進而控制免疫應答達,使RA病情改善。

5.3 金烏健骨方 苗藥金烏健骨方是治療RA的有效經典驗方,由金毛狗脊、烏梢蛇、千年健、黑骨藤、小花青風藤等藥物組成,具有活血化瘀、祛風除濕、強健筋骨的功效[50,51]。Beclin-1在細胞自噬過程中發(fā)揮關鍵作用,RA-FLS高度的自噬活性可形成自噬體并引發(fā)內質網應激反應從而上調Beclin-1的表達[52];馬武開等[53]給與RA-FLS金烏健骨方提取物高、中、低濃度治療24 h后,檢測到苗藥金烏健骨方抑制RA滑膜細胞自噬基因Beclin-1的表達,即證明金烏健骨方準確下調Beclin-1的表達,來抑制RA滑膜細胞的增生,達到通過自噬調控RA病情的作用。

5.4 程氏蠲痹湯 程氏蠲痹湯出自清代醫(yī)家程國彭的《醫(yī)學心悟》,具有祛風除濕、散寒活血、通絡止痛的功效,臨床用于治療風濕疾病[54]。研究證明,程氏蠲痹湯對治療RA具有明確的療效,可以明顯改善關節(jié)組織的炎癥,抑制滑膜增生,調節(jié)機體免疫作用[55]。吳亞蘭[56]研究發(fā)現(xiàn),程氏蠲痹湯分組給藥后,藥物劑量與RA大鼠的治療效果成正比,并通過提高滑膜細胞中Beclin-1的表達,增強滑膜細胞自噬水平,上調血清中IL-4的表達、抑制IL-17的表達,并調節(jié)細胞因子失衡,從而降低大鼠足趾腫脹度,緩解RA病情。

5.5 五味溫通除痹膠囊 五味溫通除弊膠囊,是由姜黃、桂枝、淫羊藿、茯苓等藥物組成的方劑,具有健脾化濕,溫陽通絡之功效[57]。佐劑型類風濕性關節(jié)炎(AA)大鼠模型實驗中,觀察大鼠體內自噬小體和Beclin-1指標變化,發(fā)現(xiàn)滑膜組織和肺部自噬小體合成和Beclin-1蛋白水平下降,證實AA大鼠體內自噬水平不足[58]。在體實驗中,大鼠給藥28 d后,五味溫通除痹膠囊對AA大鼠具有治療作用,其機制促進細胞自噬,抑制滑膜細胞的過度增殖,減少AA所導致的滑膜組織的損傷,同時在體外實驗中,滑膜組織中的Becclin-1基因表達水平增加,五味溫通除弊膠囊顯著促進Beclin-1的表達水平,減輕RA造成的膝關節(jié)和滑膜損傷[59]。見表1。

表1 中藥及方劑調控Beclin-1干預自噬的機制

RA在中老年人中多發(fā),具有較高的致殘率,為家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。因此控制病程發(fā)展,減輕RA所致的關節(jié)殘疾,是全世界都亟待解決的難題。本文系統(tǒng)性闡述中藥及復方精準調控Beclin-1基因干預自噬,并為治療RA提供新的研究方向。而對于中藥調控Beclin-1干預自噬治療RA的機制仍需更深層次的研究中,而對于中藥介導的自噬通路和精確分子仍在進一步的補充驗證中,同時這些中藥仍有待在臨床廣發(fā)應用中,因此后續(xù)工作仍需驗證中藥調控Beclin-1干預自噬治療RA的全面機制,并通過體內體外的實驗明確中藥治療RA的機制,為中藥及復方進一步應用于臨床提供科學依據。