閆曉紅 方美花 王偉 張軍

骨肉瘤也稱(chēng)為骨癌,在青少年中發(fā)病率最高,復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者生存率低,靶向治療骨肉瘤藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用已經(jīng)取得一定療效,仍需從基因?qū)用鎸ふ揖珳?zhǔn)的靶向治療藥物[1,2]。研究表明miRNA在骨肉瘤的診斷、治療和預(yù)后中起著重要作用[3]。有研究報(bào)道,miR-330-3p在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)降低,miR-330-3p過(guò)表達(dá)顯著抑制MG-63和U2OS骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。circ_0032463通過(guò)調(diào)節(jié)miR-330-3p/PNN軸促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展[5]。生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circ_0003221與miR-330-3p有結(jié)合位點(diǎn)。有研究報(bào)道circ_0003221(circPTK2)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移[6]。circPTK2在胃癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá),下調(diào)circPTK2抑制胃癌腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。然而筆者發(fā)現(xiàn)circ_0003221對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響尚不清楚。本試驗(yàn)旨在研究circ_0003221是否通過(guò)調(diào)控miR-330-3p影響骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2021年1月我院收治的37例骨肉瘤患者,通過(guò)手術(shù)取其瘤組織、瘤旁組織,患者均知情且同意。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 U2-OS細(xì)胞(美國(guó)ATCC);RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT試劑盒(美國(guó)Sigma公司);Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物);Transwell小室(美國(guó)康寧公司);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)AAT Bioquest)。

1.3 細(xì)胞處理與分組 U2-OS細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,將si-NC、si-circ_0003221、miR-NC、miR-330-3p mimic分別轉(zhuǎn)染至U2-OS細(xì)胞,記為si-NC組、si-circ_0003221組、miR-NC組、miR-330-3p mimic組;將si-circ_0003221分別與anti-miR-NC、miR-330-3p Inhibitor共轉(zhuǎn)染至U2-OS細(xì)胞,記為si-circ_0003221+anti-miR-NC組、si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0003221和miR-330-3p的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染結(jié)束后提取組織及各組細(xì)胞的總RNA,合成cDNA后進(jìn)行PCR檢測(cè),相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。以β-actin和U6為內(nèi)參。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將circ_0003221野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC和miR-330-3p共轉(zhuǎn)染至U2-OS細(xì)胞,并且按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h,加入20 μl MTT溶液培養(yǎng)4 h,加入150 μl二甲基亞砜,反應(yīng)15 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(OD),計(jì)算增殖抑制率。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成數(shù) 各組細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)2周,經(jīng)甲醇固定和結(jié)晶紫染色,低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.8 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移數(shù) 將100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮的細(xì)胞添加到Transwell上室,培養(yǎng)48 h,用棉簽除去膜頂表面上未遷移的細(xì)胞;甲醇固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min,用PBS輕輕清洗2次,倒置顯微鏡拍攝并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞劃痕愈合率 將各組細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中培養(yǎng),細(xì)胞鋪滿(mǎn)板底后用槍頭直線劃痕,用PBS沖洗劃下的細(xì)胞,換液后繼續(xù)培養(yǎng),在培養(yǎng)0 h和48 h后拍照觀察,用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算劃痕愈合率。

2 結(jié)果

2.1 circ_0003221和miR-330-3p在骨肉瘤組織中的表達(dá) 骨肉瘤組織中circ_0003221表達(dá)水平高于瘤旁組織,而miR-330-3p表達(dá)水平低于瘤旁組織(P<0.05)。見(jiàn)表1,圖1。

表1 circ_0003221和miR-330-3p在骨肉瘤組織中的表達(dá) n=37,

2.2 circ_0003221和miR-330-3p相關(guān)性分析 Pearson分析結(jié)果顯示,circ_0003221和miR-330-3p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9271,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 circ_0003221和miR-330-3p呈負(fù)相關(guān)

2.3 circ_0003221和miR-330-3p對(duì)U2-OS增殖的影響 與si-NC組相比,si-circ_0003221組circ_0003221表達(dá)水平降低(P<0.05),U2-OS細(xì)胞增殖抑制率升高,克隆形成數(shù)減少(P<0.05);與miR-NC組相比,miR-330-3p mimic組U2-OS細(xì)胞增殖抑制率升高,克隆形成數(shù)減少(P<0.05);與si-circ_0003221+anti-miR-NC組相比,si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor組U2-OS細(xì)胞增殖抑制率降低,克隆形成數(shù)增加(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 circ_0003221和miR-330-3p對(duì)U2-OS增殖

2.4 circ_0003221靶向調(diào)控miR-330-3p Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0003221和miR-330-3p有結(jié)合位點(diǎn);miR-330-3p與wt-circ_0003221共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與si-NC組相比,si-circ_0003221組miR-330-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3、4,圖3。

圖3 circ_0003221靶向調(diào)控miR-330-3p和miR-330-3p互補(bǔ)序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n=9,

表4 circ_0003221調(diào)控miR-330-3p的表達(dá) n=9,

2.5 circ_0003221和miR-330-3p對(duì)U2-OS遷移的影響 與si-NC組相比,si-circ_0003221組U2-OS細(xì)胞遷移數(shù)減少,劃痕愈合率降低(P<0.05);與miR-NC組相比,miR-330-3p mimic組U2-OS細(xì)胞遷移數(shù)減少,劃痕愈合率降低(P<0.05);與si-circ_0003221+anti-miR-NC組相比,si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor組U2-OS細(xì)胞遷移數(shù)增加,劃痕愈合率升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 circ_0003221和miR-330-3p對(duì)U2-OS遷移能力

3 討論

作為兒童和青少年中普遍存在的骨腫瘤,骨肉瘤的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制仍未完全明確。盡管骨肉瘤治療方法(如輔助化療和手術(shù)切除)取得了進(jìn)展,但患者生存率仍不令人滿(mǎn)意；且尚缺乏骨肉瘤的特異性診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。分子靶向治療是骨肉瘤的治療方式之一,其具有更強(qiáng)的精準(zhǔn)性及特異性,已成為獲得更佳治療效果的新希望[8,9]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究骨肉瘤的分子機(jī)制以尋找可靠的分子靶點(diǎn)。

已發(fā)現(xiàn)circRNA表達(dá)異常與各種癌癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān),并對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移、凋亡和增殖產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用。此外,鑒于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、進(jìn)化保守性、豐度和器官特異性,circRNA被認(rèn)為具有很高的診斷和治療潛力。circ_0003221(也稱(chēng)為circPTK2,chr8:141856358-141900868)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種circRNA,據(jù)報(bào)道circ_0003221在宮頸癌組織和細(xì)胞中上調(diào);敲除circ_0003221可抑制宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[10]。circPTK2通過(guò)調(diào)控miR-92a抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移[11]。敲低circPTK2可抑制胃癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)凋亡[12]。以上研究表明circ_0003221(circPTK2)可參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,有望作為腫瘤的可靠分子靶點(diǎn)。但筆者未找到關(guān)于circ_0003221對(duì)骨肉瘤影響的相關(guān)研究結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了骨肉瘤組織中circ_0003221的表達(dá),結(jié)果顯示,骨肉瘤組織中circ_0003221表達(dá)水平升高,提示circ_0003221可能在骨肉瘤中起促癌作用。進(jìn)一步干擾circ_0003221后,U2-OS細(xì)胞增殖抑制率升高,克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少,劃痕愈合率降低;表明干擾circ_0003221可抑制骨肉瘤U2-OS細(xì)胞增殖和遷移。提示,circ_0003221或可成為骨肉瘤的分子治療靶點(diǎn)。

circRNA可以通過(guò)與miRNA反應(yīng)元件競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA(ceRNA),也稱(chēng)為miRNA海綿,調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)?；谶@種調(diào)控,circRNA可以作為miRNA海綿來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá),形成調(diào)控circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。miR-330-3p在多種癌癥中充當(dāng)抑癌基因,研究報(bào)道m(xù)iR-330-3p通過(guò)下調(diào)CELF1的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移[13]。miR-330-3p通過(guò)靶向RIPK4抑制卵巢癌的進(jìn)展[14]。在三陰性乳腺癌中,Circ-PGAP3可通過(guò)下調(diào)miR-330-3p表達(dá)促進(jìn)三陰性乳腺癌的惡性進(jìn)展[15]。此外,已有研究證實(shí)miR-330-3p過(guò)表達(dá)能抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,骨肉瘤組織中miR-330-3p表達(dá)水平降低,過(guò)表達(dá)miR-330-3p可抑制骨肉瘤U2-OS增殖和遷移;與前人研究結(jié)果相符,表明miR-330-3p在骨肉瘤中起抑癌作用。且本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circ_0003221與miR-330-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示,circ_0003221與miR-330-3p存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶證實(shí),circ_0003221與miR-330-3p存在相互作用,且RT-qPCR結(jié)果顯示敲低circ_0003221可上調(diào)miR-330-3p表達(dá),表明circ_0003221可靶向負(fù)調(diào)控miR-330-3p;推測(cè)miR-330-3p可能是circ_0003221參與骨肉瘤進(jìn)展的下游靶基因。為了驗(yàn)證此推測(cè),本研究在干擾circ_0003221的基礎(chǔ)上采用miR-330-3p inhibitor轉(zhuǎn)染來(lái)下調(diào)miR-330-3p表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-330-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0003221對(duì)U2-OS細(xì)胞增殖和遷移的影響。提示干擾circ_0003221可能通過(guò)靶向上調(diào)miR-330-3p表達(dá)抑制骨肉瘤U2-OS細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述,circ_0003221在骨肉瘤組織中高表達(dá),干擾circ_0003221可通過(guò)上調(diào)miR-330-3p抑制骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖、遷移;circ_0003221、miR-330-3p均可能作為骨肉瘤分子治療的靶點(diǎn)。