程 艷，郭建偉，朱 斌，伊敏敏

（1.陜西省人民醫(yī)院麻醉科，陜西 西安710068；2.陜西省人民醫(yī)院手術(shù)一部，陜西 西安710068）

母體妊娠期精神壓力暴露不僅可能造成不良妊娠結(jié)局，更可能對(duì)子代神經(jīng)發(fā)育及認(rèn)知功能產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。大量的實(shí)驗(yàn)證明，妊娠期壓力暴露可導(dǎo)致不同程度的子代海馬結(jié)構(gòu)和功能損傷，包括海馬區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)目減少、錐體神經(jīng)元頂端樹(shù)突萎縮、線粒體呼吸酶活性降低及線粒體膜電位降低等［1-7］。腦白質(zhì)（white matter，WM）主要由成束的有髓鞘或無(wú)髓鞘軸突和產(chǎn)生髓鞘的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，WM 占人類(lèi)總腦容量的近50%，WM 對(duì)于跨越不同腦區(qū)的電信號(hào)傳輸至關(guān)重要，因此WM 損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)行為和認(rèn)知障礙［8，9］。近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能與腦白質(zhì)的發(fā)育及其完整性的維持有密切聯(lián)系，白質(zhì)的發(fā)育及占據(jù)白質(zhì)大部分的有髓神經(jīng)纖維髓鞘化過(guò)程發(fā)生于生命早期，恰與認(rèn)知技能和能力的出現(xiàn)相吻合。因此，有髓神經(jīng)纖維的形成和完善及WM 完整性的保持在生命早期認(rèn)知能力的發(fā)展中起到重要作用。

本研究擬通過(guò)壓力束縛SD 大鼠母體妊娠期壓力暴露模型，通過(guò)對(duì)子代鼠行為學(xué)及腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)測(cè)定，探究母體妊娠期精神壓力暴露是否損害子代鼠認(rèn)知功能及腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，并探究認(rèn)知功能改變與腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)改變之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步臨床干預(yù)及治療策略提供理論依據(jù)，具有重要的理論研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及其分組

親代鼠（KM SD 大鼠，購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）分為壓力束縛暴露組（PE 組）和對(duì)照組（C 組）兩組，每組15 只雌性和5 只雄性SD 大鼠，將處女雌性SD 大鼠與雄性SD 大鼠（3∶1）放置過(guò)夜進(jìn)行交配，次日晨檢查雌性SD 大鼠陰道涂片，確定涂片為陽(yáng)性的日期即為胚胎第0 天，然后將懷孕的雌性SD 大鼠分開(kāi)飼養(yǎng)。壓力束縛暴露：妊娠第14～20 天每天3 次暴露與束縛壓力下，持續(xù)45 min～1 h/次。1 月齡子代鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試（Morris 水迷宮和Y 迷宮測(cè)試）。行為學(xué)測(cè)試完成后，子代鼠進(jìn)行4%水合氯醛（300～350 mg/kg，實(shí)驗(yàn)室配置）腹腔注射麻醉后，行心臟灌注（生理鹽水+4%甲醛，西安赫特生物科技有限公司）固定腦標(biāo)本，待灌注良好后，取腦置入之前配制好的混合固定液（2%多聚甲醛+2.5%戊二醛，實(shí)驗(yàn)室配置）中進(jìn)行標(biāo)本固定。將固定好的標(biāo)本進(jìn)行電鏡包埋，制作電鏡切片，使用現(xiàn)代體視學(xué)方法計(jì)算腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度及總體積和髓鞘總長(zhǎng)度及總體積，以及對(duì)髓鞘的內(nèi)外直徑及內(nèi)外周長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算和分析。

1.2 母體妊娠期壓力束縛動(dòng)物模型

約束裝置（實(shí)驗(yàn)室自制）是一個(gè)直徑約6.8 cm的透明塑料管帶有呼吸孔和封閉端，長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)以適應(yīng)動(dòng)物的大小。妊娠SD 大鼠在妊娠第14～20天每天3 次暴露于束縛壓力下，持續(xù)45 min～1 h，每次壓力暴露的時(shí)間在時(shí)間段內(nèi)（08：00 am～11：00 am，11：00 am～02：00 pm 和04：00 pm～07：00 pm）隨機(jī)限制時(shí)間［10］。

1.3 子代鼠行為學(xué)測(cè)試

1.3.1 Morris 水迷宮 實(shí)驗(yàn)所用水迷宮儀器（Morris 水迷宮分析系統(tǒng)Smart 軟件，中國(guó)成都泰盟），水池直徑約120 cm，平臺(tái)直徑約8 cm、高約15 cm，平臺(tái)有效區(qū)域直徑約10 cm，計(jì)算機(jī)可根據(jù)水池正中心上方的攝像頭自動(dòng)追蹤并記錄小鼠的游泳過(guò)程。實(shí)驗(yàn)前將圓形水池劃分成4 個(gè)象限，然后在每個(gè)象限確定一個(gè)入水點(diǎn)。在隨機(jī)一個(gè)象限正中放入平臺(tái)，控制水溫在（20.0±2.0）℃。在水中加入二氧化鈦染成乳白色且使水面沒(méi)過(guò)平臺(tái)1 cm 左右以免讓動(dòng)物看清水下平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)小鼠的頭部均用苦味酸染色以便攝像機(jī)捕捉、記錄。測(cè)試共5 d，分為定位航行試驗(yàn)（前4 d）和空間探索試驗(yàn)（最后一天）兩部分。記錄定位航行試驗(yàn)中小鼠每次試驗(yàn)的潛伏期（即從小鼠進(jìn)水到其四肢全部站上平臺(tái)的時(shí)間），若小鼠超過(guò)90 s 還沒(méi)有站上平臺(tái)，其潛伏期則記為90 s。計(jì)算小鼠每天4 次試驗(yàn)的平均潛伏期。記錄空間探索試驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)有效區(qū)域的次數(shù)以及其在平臺(tái)原本所處象限的滯留時(shí)間百分比。［11］

1.3.2 Y 迷宮測(cè)試 實(shí)驗(yàn)所用Y 型迷宮（Y 迷宮分析系統(tǒng)Smart 軟件，中國(guó)成都泰盟）由灰色有機(jī)塑料制成，由3 個(gè)臂組成，相鄰臂之間的角度為120°，每個(gè)臂為8 cm×30 cm×15 cm（寬×長(zhǎng)×高），計(jì)算機(jī)可根據(jù)迷宮正中心上方的攝像頭自動(dòng)追蹤并記錄小鼠的探索過(guò)程；隨機(jī)指定3 個(gè)相同的臂：（1）起始臂，小鼠開(kāi)始探索（始終打開(kāi)）；（2）新穎臂，在第一次試驗(yàn)期間被阻塞，但在第二次試驗(yàn)期間打開(kāi)；（3）其他臂（始終打開(kāi)）；關(guān)閉新穎臂，將小鼠背向迷宮中心置入起始臂中，允許其在起始臂和其他臂中定向探索15 min；定向探索結(jié)束1 h 后，打開(kāi)新穎臂，將小鼠背向迷宮中心置入起始臂中，允許小鼠在3 個(gè)臂中自由探索10 min；通過(guò)使用安裝迷宮正中上方的相機(jī)，所有試驗(yàn)都記錄在錄像機(jī)上；隨后分析視頻記錄，并分析新穎臂中的探索距離、探索次數(shù)和探索時(shí)間。［12-14］

1.4 現(xiàn)代體視學(xué)方法測(cè)定腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)

（1）計(jì)算子代鼠大腦半球白質(zhì)的總體積：隨機(jī)選擇沿冠狀面的子代鼠腦切片數(shù)個(gè)，將等距點(diǎn)陣圖與切片隨機(jī)疊加，如圖1A 所示，在解剖顯微鏡（立體顯微鏡，日本尼康）下計(jì)數(shù)所有與白質(zhì)重疊的點(diǎn)∑PWM，計(jì)算白質(zhì)的總體積VWM（公式：VWM=t×a（p）×∑PWM，其中t 為連續(xù)切片的厚度，a（p）為與每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)相關(guān)的面積）［13，15-17］；（2）獲得電鏡照片：從選定的腦切片上獲得包含腦白質(zhì)的組織塊，進(jìn)行電鏡包埋，使用透射電鏡（H-7650 透射電子顯微鏡，日本Hitachi）觀察電鏡切片，每張切片上系統(tǒng)抽樣抽取5 個(gè)8 000×及10 個(gè)15 000×的視野［13］；（3）計(jì)算白質(zhì)中有髓纖維的長(zhǎng)度密度和總長(zhǎng)度：如圖1B 所示，將無(wú)偏計(jì)數(shù)框與8 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，計(jì)算白質(zhì)中有髓纖維的長(zhǎng)度密度LV（mf/wm）（公 式：LV（mf/wm）=2×∑Q（mf）/［a（frame）×∑frame］，其中∑Q（mf）是通過(guò)無(wú)偏計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)得出的電鏡照片中有髓纖維的總個(gè)數(shù)，a（frame）為單個(gè)無(wú)偏計(jì)數(shù)框的面積，∑frame 為計(jì)數(shù)框的總個(gè)數(shù)。）和總長(zhǎng)度L（mf，wm）（公式：L（mf，wm）=LV（mf/wm）×VWM）［13，15，18］；（4）計(jì)算白質(zhì)中有髓纖維的體積密度和總體積及髓鞘的體積密度和總體積：如圖1C 所示，將等距點(diǎn)陣圖與8 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，計(jì)數(shù)所有落在白質(zhì)上的點(diǎn)數(shù)∑P（wm）、落在有髓纖維的點(diǎn)數(shù)∑P（mf）及落在髓鞘的點(diǎn)數(shù)∑P（ms），計(jì)算有髓纖維的體積密度VV（mf/wm）（公式：Vv（mf/wm）=∑P（mf）/∑P（wm））、髓鞘的體積密度VV（ms/wm）（公式：Vv（ms/wm）=∑P（ms）/∑P（wm））、有髓纖維的總體積V（mf，wm）（公式：V（mf，wm）=Vv（mf/wm）×VWM）及髓鞘的總體積V（ms，wm）（公式：V（ms，wm）=Vv（ms/wm）×VWM）［13］；（5）計(jì)算有髓纖維內(nèi)直徑與外直徑：如圖1D 所示，將無(wú)偏計(jì)數(shù)框與15 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，確定落在無(wú)偏計(jì)數(shù)框內(nèi)的神經(jīng)纖維斷面。通過(guò)測(cè)量垂直于有髓纖維最長(zhǎng)軸的最長(zhǎng)輪廓直徑來(lái)估算有髓纖維的外直徑，通過(guò)測(cè)量垂直于軸突最長(zhǎng)軸的最長(zhǎng)輪廓直徑來(lái)估算有髓纖維的內(nèi)直徑，測(cè)量?jī)?nèi)、外直徑及計(jì)算內(nèi)、外直徑的比值和差值［13，17，19］；（6）計(jì)算有髓纖維內(nèi)周長(zhǎng)及外周長(zhǎng)：如圖1E 所示，將無(wú)偏計(jì)數(shù)框及等距平行線與15 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，確定落在無(wú)偏計(jì)數(shù)框內(nèi)的神經(jīng)纖維斷面，計(jì)算斷面內(nèi)有髓纖維的內(nèi)周長(zhǎng)或外周長(zhǎng)b（ms）（公式：b（ms）=π/2×d×∑I，其中d 為等距平行線間的垂直距離，∑I 為等距平行線與落在無(wú)偏計(jì)數(shù)框內(nèi)的髓鞘內(nèi)緣界線或外緣界線交叉的總點(diǎn)數(shù)。），進(jìn)而計(jì)算內(nèi)、外周長(zhǎng)的比值和差值［13，16，19］。

圖1 腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)的體視學(xué)研究Fig 1 White matter and its ultrastructure calculation

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若滿(mǎn)足正態(tài)性則用參數(shù)檢驗(yàn)，若不滿(mǎn)足正態(tài)性則用非參數(shù)檢驗(yàn)（秩次檢驗(yàn)）；參數(shù)檢驗(yàn)使用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)。P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)期間親代鼠及子代鼠體重分析

親代鼠選取妊娠第0 天、14 天、20 天，子代鼠選取出生第0 天、15 天、30 天，進(jìn)行體重統(tǒng)計(jì)分析。如圖2A 所示，親代鼠妊娠第0 天、14 天、20 天體重：C組 分 別 為 （223.67±10.54）g，（245.87±13.72）g，（251.60±8.86）g，PE 組分別為（226.33±13.14）g，（242.93±10.16）g，（254.2±13.88）g，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖2B 所示，子代鼠出生第0 天、15 天、30 天 體 重：C 組 分 別 為（6.04±0.82）g，（34.88±2.84）g，（73.39±4.62）g，PE 組 分 別 為（6.05±0.76）g，（39.78±2.78）g，（75.19±3.59）g，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 兩組親代鼠與子代鼠實(shí)驗(yàn)期間體重比較Fig 2 Weight comparison between the two groups of parent mice and offspring mice during the experiment

2.2 母體妊娠期精神壓力暴露損害子代鼠認(rèn)知功能

如圖3 所示，在Morris 水迷宮定位航行試驗(yàn)中，C 組 小 鼠4 天 潛 伏 期 分 別 為（57.24±12.84）s，（61.09±12.24）s，（34.48±4.78）s，（23.65±5.53）s，PE 組 小 鼠 潛 伏 期 分 別 為（63.60±8.30）s，（53.55±12.56）s，（65.36±6.59）s，（65.79±6.02）s。第3 天（F=9.72，t=-25.32，P＜0.05）與第4 天（F=0.86，t=-34.23，P＜0.05），與C 組小鼠相比，PE 組小鼠潛伏期顯著性延長(zhǎng)。如圖4 所示，在Morris 水迷宮空間探索試驗(yàn)中，C 組與PE 組小鼠穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)分別為3.39±1.26 次，0.90±0.82次，平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比分別為（26.48±4.19）%，（20.33±2.98）%。與C 組小鼠相比，PE 組小鼠穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)（F=21.95，t=10.88，P＜0.05）和平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比顯著性減少（F=7.60，t=7.87，P＜0.05）。如圖5 所示，C 組與PE 組小鼠Y 迷宮新穎臂探索距離分別為（43.59±4.52）cm，（111.86±18.92）cm，探索次數(shù)分別為24.78±3.85 次，77.69±9.91 次，探索時(shí)間分別為（123.89±14.59）s，（198.07±11.75）s。與C 組小鼠相比，PE 組小鼠Y 迷宮新穎臂探索距離（F=86.79，t=-23.76，P＜0.05）、探索次數(shù)（F=54.80，t= - 33.57，P＜0.05）及 探 索 時(shí) 間（F=4.09，t=-26.11，P＜0.05）明顯增加。

圖3 兩組子代鼠Morris 水迷宮定位航行試驗(yàn)潛伏期比較Fig 3 Comparison of the time latencies of the Morris water maze positioning navigation test of offspring mice between two groups

圖4 兩組子代鼠Morris 水迷宮空間探索試驗(yàn)平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)比較Fig 4 Comparison of the target zone frequency and percentage of time in target zone of the Morris water space exploration test of offspring mice between two groups

圖5 兩組子代鼠Y 迷宮探索結(jié)果Fig 5 Y-maze exploration results between two groups

2.3 母體妊娠期精神壓力暴露損害子代鼠腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)

如圖6 所示，C 組與PE 組小鼠腦白質(zhì)總體積分別 為（283.2±19.83）mm3，（180.69±6.11）mm3；有髓神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度分別為（10 466.87±831.92）mm，（6 091.29±181.08）mm；有髓神經(jīng)纖維總體積分 別 為（32 079.50±1 091.68）mm3，（30 411.31±965.28）mm3，髓 鞘 總 體 積 分 別 為（8 045.91±153.91）mm3，（6 813.07±58.86）mm3。與C 組小鼠相比，PE 組小鼠腦白質(zhì)總體積（F=51.40，t=32.13，P＜0.05）、有髓神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度（F=75.19，t=33.36，P＜0.05）、有髓神經(jīng)纖維總體積（F=0.27，t=7.56，P＜0.05））、髓 鞘 總 體 積（F=37.07，t=48.74，P＜0.05）明顯下降。為了進(jìn)一步探究有髓神經(jīng)纖維髓鞘具體變化，對(duì)髓鞘內(nèi)外直徑及內(nèi)外周長(zhǎng)進(jìn)行分析，如表1 所示，與C 組小鼠相比，PE 組小鼠髓鞘內(nèi)直徑（F=21.54，t=17.60，P＜0.05）、外直徑（F=11.20，t=23.22，P＜0.05）明顯下降，內(nèi)周長(zhǎng)（F=.39，t=5.62，P＜0.05）、外 周 長(zhǎng)（F=13.02，t=- 8.12，P＜0.05）及 內(nèi) 外 周 長(zhǎng) 差（F=2.87，t=-9.15，P＜0.05）明顯增加。

表1 兩組小鼠大腦半球白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維髓鞘的體視學(xué)分析結(jié)果（）Tab 1 Results of stereoscopic analysis of myelin nerve fiber myelin sheath in the white matter of the brain hemispheres between two groups（）

表1 兩組小鼠大腦半球白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維髓鞘的體視學(xué)分析結(jié)果（）Tab 1 Results of stereoscopic analysis of myelin nerve fiber myelin sheath in the white matter of the brain hemispheres between two groups（）

注：與C 組相比，*P＜0.05。

項(xiàng)目外直徑（μm）內(nèi)直徑（μm）內(nèi)外直徑差（μm）內(nèi)外直徑比外周長(zhǎng)（μm）內(nèi)周長(zhǎng)（μm）內(nèi)外周長(zhǎng)差（μm）內(nèi)外周長(zhǎng)比PE 組1.18±0.01*1.08±0.01*0.05±0.01 0.92±0.01 21 241.82±177.47*18 353.87±220.57*2 887.95±298.40*0.86±0.01 C 組1.25±0.02 1.15±0.02 0.05±0.01 0.91±0.02 20 977.23±125.77 18 602.64±194.72 2374.60±225.59 0.89±0.01

圖6 不同實(shí)驗(yàn)組大腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)結(jié)果比較Fig 6 Comparison of brain white matter and its ultrastructure between two groups

2.4 腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)與子代鼠行為學(xué)損害負(fù)相關(guān)

如圖7 所示，腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積與第3 天及第4 天Morris 水迷宮定位航行試驗(yàn)潛伏期、Y 迷宮新穎臂探索距離、探索次數(shù)和探索時(shí)間與負(fù)相關(guān)，與Morris 水迷宮空間探索試驗(yàn)平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)正相關(guān)。

圖7 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果與腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)改變相關(guān)分析Fig 7 Correlation analysis of behavioral test results & white matter and its ultrastructural changes

3 討論

壓力暴露與大腦損傷及認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)［4，20］，Sapolsky 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，壓力暴露參與神經(jīng)系統(tǒng)，特別是邊緣系統(tǒng)的可塑性，其提出，嚴(yán)重和/或長(zhǎng)期壓力削弱海馬依賴(lài)性顯式學(xué)習(xí)的能力及其基礎(chǔ)的可塑性。在動(dòng)物和人類(lèi)中均已記錄到母體妊娠期壓力暴露對(duì)胎兒神經(jīng)發(fā)育的負(fù)面影響以及長(zhǎng)期的情緒和行為障礙［1］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)遭受妊娠期壓力暴露的子代小鼠杏仁核發(fā)育出現(xiàn)差異，表明該暴露可能是子代小鼠出現(xiàn)恐懼相關(guān)行為（如焦慮癥狀）的誘發(fā)因素［2］；而在恒河猴的懷孕早期和晚期，暴露于產(chǎn)前壓力可以抑制胎盤(pán)早熟，且在海馬齒狀回中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生和海馬體積的減少［22］；Yang 等［3］發(fā)現(xiàn)，妊娠期壓力暴露可能會(huì)導(dǎo)致子代鼠海馬CA1 區(qū)長(zhǎng)期增強(qiáng)功能受損并長(zhǎng)期處于抑制狀態(tài)，而這種突觸可塑性的改變可能與子代鼠空間學(xué)習(xí)和記憶受損有關(guān)。本研究將親代鼠分為PE 組和C 組，PE 組親代雌鼠妊娠第14～20 天暴露于束縛壓力（3 次/d），持續(xù)45 min～1 h/次，對(duì)1 月齡子代鼠進(jìn)行Morris 水迷宮和Y 迷宮測(cè)試，Morris 水迷宮檢測(cè)的被認(rèn)為是動(dòng)物的空間參考記憶最為經(jīng)典的行為學(xué)檢測(cè)方法，Y 迷宮任務(wù)是用于測(cè)量空間識(shí)別記憶的雙試驗(yàn)識(shí)別測(cè)試，研究發(fā)現(xiàn)，與C 組相比，PE 組小鼠第3、4 天Morris 水迷宮定位航行試驗(yàn)潛伏期顯著延長(zhǎng)、空間探索試驗(yàn)平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)顯著減少，Y迷宮新穎臂探索距離、探索次數(shù)及探索時(shí)間明顯增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示母體妊娠期精神壓力暴露損害子代鼠認(rèn)知功能，研究結(jié)果與以往的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)一致。

人體研究發(fā)現(xiàn)，母親的妊娠期壓力暴露與孩子的運(yùn)動(dòng)和智力發(fā)育延遲以及語(yǔ)言能力較弱之間存在關(guān)聯(lián)。Huizink 等［23］利用Bayley 嬰兒發(fā)育量表發(fā)現(xiàn)，母親較高的每日煩惱（壓力）和焦慮水平都是導(dǎo)致孩子智力低下的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且妊娠中期壓力暴露可能是8 個(gè)月大嬰兒運(yùn)動(dòng)和智力發(fā)育延遲的決定因素之一，并且可能是以后出現(xiàn)發(fā)育問(wèn)題的危險(xiǎn)因素［23］；在一項(xiàng)針對(duì)加拿大魁北克在嚴(yán)重冰暴中懷孕的婦女的研究發(fā)現(xiàn)，母親經(jīng)歷的客觀壓力（包括傷害，損失和變化）與Bayley 量表的較低得分以及其2 歲幼兒的語(yǔ)言能力較低有關(guān)［24］。在使用動(dòng)物進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，目前引入的妊娠期精神壓力暴露應(yīng)激因子，包括約束、慢性音譯、固定化、隔離、社會(huì)壓力以及急性感覺(jué)或情緒緊張等，其中壓力限制（及約束）模型應(yīng)用最為廣泛［10］。因此，本研究應(yīng)用母體妊娠期壓力束縛動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，母體妊娠期精神壓力暴露可明顯損害子代鼠認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力，研究結(jié)果與以往的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)一致。如果孕鼠在妊娠期間暴露于重度壓力，可能會(huì)對(duì)胎兒產(chǎn)生負(fù)面影響。研究表明，重度壓力可以影響孕鼠的生理和行為狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)胎兒的發(fā)育產(chǎn)生不良影響，如胎兒發(fā)育受限，原因肯能是重度壓力可能導(dǎo)致孕鼠體內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激激素，如皮質(zhì)醇，高水平的皮質(zhì)醇可能穿過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，影響其發(fā)育，這可能導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限，出生時(shí)體重較輕［25］。孕鼠妊娠期重度壓力暴露是指孕鼠在妊娠期間暴露于高強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)激刺激。這種應(yīng)激刺激可以包括各種實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)孕鼠施加的壓力或應(yīng)激性刺激，如電擊、噪音、冷水浸泡等，這些刺激可能導(dǎo)致孕鼠產(chǎn)生生理和行為上的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)孕鼠和胎兒的生理狀態(tài)和發(fā)育產(chǎn)生影響［25，26］。本研究?jī)山M間子代鼠出生后體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與暴露強(qiáng)度和暴露時(shí)間有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)孕期精神束縛壓力暴露程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于重度壓力暴露。

在受孕后，胎兒的大腦開(kāi)始形成，隨著孕期的進(jìn)展，胎兒的WM 也逐漸發(fā)生變化。WM 是大腦中的一種組織類(lèi)型，由神經(jīng)纖維束組成，主要負(fù)責(zé)傳遞神經(jīng)信號(hào)。在受孕后的第3 周，神經(jīng)管開(kāi)始形成，神經(jīng)管是胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前體，最終發(fā)展成腦和脊髓，WM 的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)開(kāi)始形成；在受孕后的第6～12 周，神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始從胎兒的腦室區(qū)域遷移到其他區(qū)域，這個(gè)過(guò)程是大腦皮層形成的關(guān)鍵步驟，也是WM 發(fā)展的關(guān)鍵階段；在受孕后的第12 周后，神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始形成髓鞘，這是一種覆蓋神經(jīng)纖維的脂質(zhì)層，髓鞘對(duì)于神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)非常重要，它增強(qiáng)了神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞速度，這個(gè)過(guò)程對(duì)WM 的發(fā)展至關(guān)重要；在胎兒發(fā)育的后期階段，神經(jīng)細(xì)胞的連接增加，并且神經(jīng)元進(jìn)一步分化，這些神經(jīng)元之間的連接形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，支持各種認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能［27，28］。當(dāng)脂質(zhì)髓鞘形成在神經(jīng)元軸突周?chē)鷷r(shí)，其作用是增加電脈沖的傳導(dǎo)速度，從而改善大腦的連通性，髓鞘化在整個(gè)兒童早期（生命的前5年）迅速發(fā)展。這種個(gè)體發(fā)生模式受到神經(jīng)活動(dòng)的嚴(yán)格調(diào)控，并且與認(rèn)知技能和能力的出現(xiàn)相吻合，有髓神經(jīng)纖維的形成和完善及WM 完整性的保持在嬰幼兒認(rèn)知能力的發(fā)展中起到重要作用［9，29］。本研究發(fā)現(xiàn)，與C 組相比，PE 組小鼠腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度及總體積、髓鞘總體積明顯下降，對(duì)有髓神經(jīng)纖維的內(nèi)外直徑及內(nèi)外周長(zhǎng)的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PE 組子代小鼠髓鞘內(nèi)外直徑明顯下降，內(nèi)周長(zhǎng)明顯下降而外周長(zhǎng)明顯增加，提示生命早期腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)受損可能與認(rèn)知功能損害有關(guān)，與以往研究一致。本研究對(duì)子代鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果與腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)改變相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積與第3 天及第4 天Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)潛伏期、Y 迷宮新穎臂探索距離、探索次數(shù)和探索時(shí)間與負(fù)相關(guān)，與Morris 水迷宮空間探索試驗(yàn)平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)正相關(guān)。因此，母體妊娠期精神壓力暴露，可能通過(guò)損害生命早期腦白質(zhì)的發(fā)展、形成及髓鞘化過(guò)程，而損害子代鼠腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)而降低子代鼠認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)能力。以往研究雖然提出腦白質(zhì)的形成、發(fā)展及其髓鞘化過(guò)程對(duì)認(rèn)知功能可能有重要影響，但未從腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)角度進(jìn)行相關(guān)研究，本研究利用現(xiàn)代體視學(xué)三維定量測(cè)量方法，揭示生命早期腦白質(zhì)損害與認(rèn)知功能下降之間的關(guān)系，具有創(chuàng)新性和研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，母體妊娠期精神壓力暴露可損害子代鼠認(rèn)知功能及腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)，且認(rèn)知功能與腦白質(zhì)間存在相關(guān)關(guān)系。白質(zhì)中固有的抗氧化性能可能相對(duì)較低［30，31］，而富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的髓鞘可以為過(guò)氧化反應(yīng)提供豐富的底物而導(dǎo)致大量ROS 的產(chǎn)生。氧化應(yīng)激本身可能導(dǎo)致膜完整性破壞，如脂質(zhì)過(guò)氧化可能與滑膜膜中磷脂不對(duì)稱(chēng)性的喪失有關(guān)［32］。有髓神經(jīng)纖維髓鞘主要由OLs 構(gòu)成，有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)OLs 和OPC 的細(xì)胞死亡［33］，或抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的分化即其破壞OLs 的成熟［34］，因此氧化應(yīng)激可能通過(guò)破壞髓鞘結(jié)構(gòu)而影響WM 的傳導(dǎo)功能，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙。氧化應(yīng)激在腦白質(zhì)損害影響認(rèn)知功能中有重要作用，但本研究未測(cè)定腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平，后續(xù)可進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

程艷：參與研究設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)設(shè)置、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析和解釋以及撰寫(xiě)本文；郭建偉：在解釋數(shù)據(jù)、修改手稿和構(gòu)思想法方面做出了貢獻(xiàn)；朱斌：參與完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水迷宮和Y 迷宮測(cè)試；伊敏敏：參與子代鼠腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)的計(jì)算過(guò)程。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。