李凱旋，王 欽，鄭佳彬，滕 峰，賈立群

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100010；2.中日友好醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，北京 100010；3.中日友好醫(yī)院放射腫瘤科，北京 100010）

放射性食管炎（radiation esophagitis，RE）是頸胸部腫瘤放療常見不良反應(yīng)，是限制治療，影響生活質(zhì)量的嚴(yán)重并發(fā)癥。放射性食管炎治療缺少有循證依據(jù)的治療手段，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)防治放射性食管炎的措施主要包括抗生素、糖皮質(zhì)激素、局麻藥、黏膜保護劑、質(zhì)子泵抑制劑、維生素等藥物聯(lián)合使用對癥治療，但這樣的藥物組合存在預(yù)防作用弱、副作用多、停藥后恢復(fù)等問題［1］。中日友好醫(yī)院中藥制劑潰瘍液治療放射性食管炎優(yōu)勢潛力漸露［2］，但受限黏附性不足等問題，中藥制劑尚待優(yōu)化。近年來，納米化載體與中藥結(jié)合治療放射性食管炎露出曙光，北京化工大學(xué)化學(xué)學(xué)院開發(fā)的納米水滑石（nano-LDH）合成方式簡單且成本相對低廉，載藥效率高且藥物細(xì)胞膜透過率高［3］。目前，nano-LDH作為一種新型藥物載體在抗菌，抗腫瘤和生物成像等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。nano-LDH 生物相容性好，容易被細(xì)胞攝取，且在酸性條件下易降解。因此，本研究選擇nano-LDH 作為載體制備納米潰瘍液并設(shè)計本研究，探究納米潰瘍液治療Wistar 大鼠放射性食管炎療效及對各類疼痛因子和炎癥相關(guān)因子的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與實驗環(huán)境

健康清潔級雄性wistar 大鼠36 只，體重（215.71±4.71）g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SYXK（京）2016-0043，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院動物SPF 級實驗室，許可證號：SYXK（京）-2016-0043。實驗室環(huán)境保持溫度為（22±2）℃，相對濕度為（55±10）%，光照12 h，晝夜循環(huán)。所有動物實驗均在中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心生物醫(yī)學(xué)倫理委員會的許可下執(zhí)行（動物實驗倫理號zryhyy21-20-09-5）。

1.2 實驗藥物

潰瘍液：中藥水煎劑潰瘍液源自中日友好醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科經(jīng)驗方“潰瘍油”，由生大黃、紫草、紅花、當(dāng)歸、白芷五種藥物組成，中藥飲片購于中日友好醫(yī)院門診中藥房。將潰瘍油復(fù)方（生大黃75 g、紫草50 g、紅花50 g、當(dāng)歸50 g、白芷50 g）加蒸餾水，煎煮3 次，第1 次1 h，第2、3 次每次煎煮0.5 h，合并濾液，再次濾過藥渣后濃縮藥液至1 000 mL，生藥有效成分含量 0.275 g/mL；滅菌后密封保存于4 ℃環(huán)境。

康復(fù)新液：購于四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：100 mL 瓶裝；生產(chǎn)批號：國藥準(zhǔn)字Z51021834。密封后置于陰涼處保存。

納米水滑石基質(zhì)：制備方法：稱取0.1 mol 的鎂鹽（硝酸鎂）以及0.05 mol 的鋁鹽（硝酸鋁），確保Mg：Al 元素比例為2∶1，用500 mL 去離子水溶解得到鹽溶液。同時制備0.3 mol 的NaOH，溶解于500 mL 的去離子水中，通過膠體磨方法將兩種溶液混合，并在80 ℃烘箱中水熱24 h 制備得到納米級別MgAl 水滑石，用去離子水離心洗三遍。納米水滑石濃度：將納米水滑石進行定量得到濃度為：0.020 2 g/mL。

納米潰瘍液：將濃度為0.101 g/mL 的納米水滑石基質(zhì)溶液100 mL 與潰瘍液水煎劑100 mL 混合，中藥和納米水滑石均勻混合后，在磁力攪拌器上1 500 rpm/min 攪拌負(fù)載24 h，使納米水滑石充分負(fù)載中藥有效成分后得到納米潰瘍液，納米水滑石濃度為0.050 5 g/mL，中藥生藥有效成分含量 0.137 5 g/mL。

1.3 主要試劑

異氟烷，戊巴比妥鈉，蘇木素染色液，伊紅染色液，二甲苯，10%中性福爾馬林溶液，NF-κB Recombinant antibody，大鼠前列腺素E2 抗體，大鼠P 物質(zhì)抗體，大鼠降鈣素基因相關(guān)肽抗體等。

1.4 主要儀器

直線加速器；玻璃組織研磨器；低溫高速離心機；化學(xué)發(fā)光儀；熒光掃描儀；酶標(biāo)儀；垂直電泳槽等。

1.5 動物分組、造模、給藥、取材

36 只wistar 大鼠稱量體重后，采用隨機數(shù)表法隨機挑選，分為6 組：正常對照組（CONTROL）、模型對照組（MODEL）、康復(fù)新液組（KFXY）、中藥潰瘍液組（KYY）、納米水滑石基質(zhì)組（NANO）、納米潰瘍液組（NANO-KYY）。每組6 只。

參考沈莉等［4］構(gòu)建的動物模型，結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果造模。應(yīng)用wistar 大鼠造模。所有動物實驗均在中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心生物醫(yī)學(xué)倫理委員會的許可下執(zhí)行（動物實驗倫理號zryhyy21-20-09-5）。適應(yīng)性飼養(yǎng)后，在清醒狀態(tài)下使用7%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉wistar 大鼠，麻醉后的wistars 大鼠四肢展開腹面朝上固定于特制鼠板上，牙齒掛線使大鼠身體保持中立位，頭后仰，開放氣道同時限制頭部活動，在CT 下進行食管定位，以大鼠身體中線為中心軸線，照射野上界在食管起始處，下界位于胸骨劍突下，照射野為wistar 大鼠食管全段，照射野范圍約為6.6 cm*2.1 cm，其余部位用光柵屏蔽。皮源距離為99 cm，使用6-mV 射線照射，照射劑量率為250 cGy/min，一次性照射，總劑量為30 Gy，建立放射性食管炎大鼠模型。

將照射造模的日期設(shè)定為Day0。從Day1 開始至Day7，連續(xù)每日給藥。每日上午8：00、下午16：00 各給藥一次。給藥方式為：將灌胃針伸入wistar大鼠咽喉2 cm 食道起始部，右手固定大鼠，左手固定灌胃針，防止灌胃針移動引起大鼠嗆咳或針頭深入到食管深處。給藥時由助手緩慢推動注射器，注射速度為1 mL/min，后禁食水1 h，保證藥物與食管表面充分接觸。正常對照組（CONTROL）每次予滅菌注射用水1 mL；模型對照組（MODEL）每次予滅菌注射用水1 mL；康復(fù)新液組（KFXY）每次予康復(fù)新液1 mL、中藥潰瘍液組（KYY）每次予中藥潰瘍液1 mL、納米水滑石基質(zhì)組（NANO）每次予納米水滑石基質(zhì)1 mL、納米潰瘍液組（NANO-KYY）每次予納米潰瘍液1 mL。

連續(xù)給藥干預(yù)7 d 后，各組大鼠同時取材。每只大鼠在取材前留取血清樣本。處死前使用小動物呼吸麻醉機，2.5%～3.5%異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉后，改為1.5%～2.0%面罩吸入維持麻醉。將大鼠固定在操作板上，充分暴露腹部，顯露腹主動脈后動脈取血，取血至黃色促凝管中，靜置1 h 后，3000 r/min，離心15 min，吸取血清至離心管，置于-80 ℃冰箱凍存。

取血后wistar 大鼠通常因失血性休克死亡，若未死亡，則脫頸椎處死。待大鼠心跳呼吸停止后，沿食管胃結(jié)合部向上剖開胸腔，取出全段食管組織，用生理鹽水沖掉食管內(nèi)食物殘渣，取1/2 食管置于10%中性福爾馬林固定液，充分固定后予脫水、浸蠟、石蠟包埋處理后切片，行蘇木素-伊紅染色。剩余部分液氮速凍后置于-80 ℃冰箱凍存留作后續(xù)分析使用。

1.6 檢測方法

HE 染色觀察各組食管病理損傷評分 食管組織固定完成后，進行石蠟包埋，切片，放置于65 ℃烘箱中烘干，脫蠟水化后進行HE 染色，脫水封片后置于顯微鏡下觀察。參照Trowers 等［5］提出的分級方法對放射性食管炎大鼠進行病理損傷程度評分（score of RE pathology grade），在食管組織損傷程度、炎癥細(xì)胞浸潤深度及程度兩方面進行評分。每張切片隨機取5 個視野，5 個視野病理損傷評分平均值為該樣本最終病理損傷評分［6］。具體計分方式見表1。

表1 食管病理損傷程度評分表Tab 1 Scoring table for the degree of esophageal pathological injury

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測各組血清疼痛因子濃度 用PH 9.6 的CBS 包被液稀釋包被抗原至5 μg/mL，酶標(biāo)板中每孔加入50 μL，室溫、4℃或37℃過夜包被。棄包被液（用力拍干，再用無塵紙吸干），用PH 7.2～7.4 的1×PBST 洗滌液洗板3 次（每孔均要加滿），每次3 min～5 min。封閉：每孔加封閉液（1%BSA）250 μL，37℃封閉2 h。洗滌：用1×PBST 洗滌液洗板3 次，每次3 min～5 min。用PBST 緩沖液1 000 倍稀釋大鼠血清，每孔100 μL，要設(shè)立陰性對照，37℃孵育。結(jié)合酶標(biāo)二抗：每孔加1×PBST 緩沖液1 000 倍稀釋的酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG-HRP（稀釋倍數(shù)根據(jù)產(chǎn)品不同有所不同，可按說明書進行）50 μL，37℃孵育1 h。洗滌后顯色：每孔加底物溶液（TMB）50 μL，置室溫避光顯色10 min。待顯色后，每孔加入50 μL 終止液（2 mol/L H2SO4）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀讀取450 nm 的OD值，以確定血清抗體水平。

蛋白免疫印跡法（Western Blotting）檢測各組食管組織NF-κB 蛋白的表達 取凍存的食管組織，加入配置好的裂解液于冰上裂解45 min，4 ℃，12 000 r/min 離 心15 min，提 取 上 清 液，BCA 蛋 白 定 量 分析。制膠，上樣，根據(jù)預(yù)染Marker 和NF-κB 蛋白分子量來確定電泳停止時間。100 V 恒壓電泳下用PVDF 轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗NF-κB，4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次，每次15 min，加入二抗孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次15 min。ECL 發(fā)光液化學(xué)發(fā)光顯色法曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶，軟件 Image J 計算灰度值。

1.7 統(tǒng)計方法

實驗所得數(shù)據(jù)使用 SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，經(jīng)檢驗所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊性，以（）表示。實驗結(jié)果多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重及進食量變化

從大鼠體重變化看：每日稱量各組大鼠體重并記錄，造模前各組大鼠體重接近，CONTROL 組大鼠未照射，自Day0 起體重逐日增加，第7 天體重為（284.3±6.5）g；其他各組大鼠自D0 起體重逐日減低，MODEL 組第7 天體重為（175.5±4.3）g，相比CONTROL 組體重明顯降低；其他各干預(yù)組大鼠體重均降低，但與MODEL 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)前及干預(yù)后各組大鼠體重見表2，各組大鼠每日體重變化曲線見圖1。

表2 各組大鼠干預(yù)前后體重（n=6，g，）Tab 2 Weight of rats in each group before and after intervention（n=6，g，）

組別正常組（CONTROL）模型組（MODEL）康復(fù)新液組（KFXY）納米水滑石基質(zhì)組（NANO）中藥潰瘍液組（KYY）納米潰瘍液組（NANO-KYY）干預(yù)前D0 體重239.5 ± 5.7 232.7 ± 6.3 241.3 ± 3.3 239.5 ± 4.9 237.2 ± 4.6 240.7 ± 4.7干預(yù)后D7 體重284.3 ± 6.5 175.5 ± 4.3 176.7 ± 6.1 168.3 ± 5.1 174.8 ± 4.7 168.4 ± 5.6

從大鼠進食量看：造模前各組大鼠進食量接近，CONTROL 組大鼠未照射，自D0 起仍舊正常進食，之后7 日內(nèi)總進食量為（192.8±9.4）g；其他7 組大鼠自D0 起進食量較照射前明顯降低，MODEL 組7 日內(nèi)總進食量為（39.3±6.2）g，相比正常組體重明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；NANO-KYY 組（NANO-KYY）7 日內(nèi)總進食量為（64.2±4.5）g，高于MODEL 組和其他干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.65，P＜0.05）；其他各干預(yù)組與MODEL 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具體數(shù)值及柱狀圖如下表3、圖2 所示：

圖2 各組大鼠預(yù)后7 d 內(nèi)總進食量比較Fig 2 Comparison of total food consumption within 7 days after prognosis of rats in each group

表3 各組大鼠干預(yù)后7 天內(nèi)總進食量（n=6，g，）Tab 3 Total food consumption of rats in each group within 7days after intervention（n=6，g，）

表3 各組大鼠干預(yù)后7 天內(nèi)總進食量（n=6，g，）Tab 3 Total food consumption of rats in each group within 7days after intervention（n=6，g，）

組別正常組（CONTROL）模型組（MODEL）康復(fù)新液組（KFXY）納米水滑石基質(zhì)組（NANO）中藥潰瘍液組（KYY）納米潰瘍液組（HIGH）造模后7 日總進食量192.8 ± 9.4 39.3 ± 6.2 46.0 ± 7.4 42.5 ± 5.9 43.3 ± 7.6 64.2 ± 4.5

2.2 各組大鼠食管組織病理損傷評分比較

各組大鼠食管組織的HE 染色結(jié)果如圖3 所示。正常組的大鼠食管黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜層、黏膜下層、肌層及外膜層均無病理損傷，基底層排列緊密，基底層外多層棘細(xì)胞層、顆粒層排列致密，角質(zhì)層完整未見脫落壞死細(xì)胞，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。其余各組與之相比均出現(xiàn)不同程度食道組織損傷和炎細(xì)胞浸潤，可見部分黏膜缺失，黏膜基底細(xì)胞排列紊亂，棘細(xì)胞層萎縮變薄、排列紊亂，角質(zhì)細(xì)胞明顯脫落，大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤。根據(jù)大鼠放射性食管炎病理損傷評分方法計算各組大鼠病理變化積分后結(jié)果見表4、圖4。未照射大鼠未見明顯食管損傷，病理評分為0.33±0.52，照射后各組大鼠食管組織損傷嚴(yán)重，病理評分明顯高于Control 組；除 Control 組，納 米 潰 瘍 液 組（NANO-KYY）大鼠食管病理損傷評分為2.17±0.75，明顯低于其他各組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.523，P＜0.05）；其他各組間兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠大鼠食管組織的HE 染色（×100）Fig 3 HE staining of rat esophageal tissue in each group（×100）

圖4 各組大鼠食管組織病理損傷評分比較Fig 4 Comparison of pathological damage scores of rat esophageal tissue in each group

表4 各組大鼠食管組織病理損傷評分（n=6，）Tab 4 Pathological damage scores of rat esophageal tissue in each group （n=6，）

表4 各組大鼠食管組織病理損傷評分（n=6，）Tab 4 Pathological damage scores of rat esophageal tissue in each group （n=6，）

組別正常組（CONTROL）模型組（MODEL）康復(fù)新液組（KFXY）納米水滑石基質(zhì)組（NANO）中藥潰瘍液組（KYY）納米潰瘍液組（NANO-KYY）病理損傷評分0.33±0.52 3.67±1.37 3.83±0.98 3.50±0.84 4.00±1.41 2.17±0.75

2.3 各組大鼠疼痛相關(guān)因子分泌情況

ELISA 結(jié)果顯示放射線照射后大鼠血清中的疼痛相關(guān)因子前列腺素-2（PGE-2）、P 物質(zhì)（SP）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）表達量分別為（437.20±52.21）、（5.84±0.41）、（29.53±3.91）ng/L，相比正常組明顯升高，單純給予納米水滑石基質(zhì)無法降低疼痛因子水平，康復(fù)新液、中藥潰瘍液、納米潰瘍液都能降低三種疼痛因子表達量，納米潰瘍液干預(yù)后PGE-2、SP、CGRP 分別為（298.10±71.74）、（3.23±0.74）、（14.62±3.80）ng/L，其中降低CGRP 幅度最大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.914，P＜0.05）。各種疼痛因子的ELISA 結(jié)果如下表5、圖5 所示。

圖5 PGE-2、SP、CGRP 表達量Fig 5 Expression levels of PGE-2，SP，and CGRP

表5 ELISA 檢測結(jié)果統(tǒng)計表（n=6，ng/L，）Tab 5 Statistical Table of ELISA Test Results（n=6，ng/L，）

表5 ELISA 檢測結(jié)果統(tǒng)計表（n=6，ng/L，）Tab 5 Statistical Table of ELISA Test Results（n=6，ng/L，）

組別正常組（CONTROL）模型組組（MODEL）康復(fù)新液組（KFXY）納米基質(zhì)組（NANO）中藥組（KYY）納米潰瘍液組（NANO-KYY）前列腺素-2 241.60 ± 61.87 437.20 ± 52.21 319.10 ± 78.64 372.40± 76.18 239.20 ± 39.04 298.10 ± 71.74 P 物質(zhì)2.77 ± 0.32 5.84 ± 0.41 4.20 ± 0.89 5.30 ± 0.74 4.44 ± 0.70 3.23 ± 0.74降鈣素基因相關(guān)肽14.67 ± 4.50 29.53 ± 3.91 19.83 ± 4.17 24.12 ± 3.79 20.18 ± 4.08 14.62 ± 3.80

2.4 各組大鼠炎癥相關(guān)蛋白表達情況

Western Blot 結(jié) 果 顯 示，各 組 內(nèi) 參GAPDH 表達量一致，WB 結(jié)果具有可比性。各種蛋白的Western Blot 結(jié)果見圖6，相對灰度值統(tǒng)計見表6、柱狀分析統(tǒng)計圖見圖7，分別如下。結(jié)果表明放射線照射會導(dǎo)致食管組織中的炎性相關(guān)蛋白NF-κB 表達量升高，Model 組NF-κB 蛋白表達相對灰度值為0.46±0.08，與Control 相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.708，P＜0.05）；康復(fù)新液、中藥潰瘍液、納米潰瘍液都能降低NF-κB 表達量，納米潰瘍液干預(yù)后降低至0.10 ± 0.04，與MODEL 組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.369，P＜0.05）。

圖6 NF-κB 蛋白表達條帶展示圖Fig 6 NF-κB-protein expression band display diagram

圖7 NF-κB 蛋白表達量Fig 7 NF- κB protein expression level

表6 NF-κB 蛋白表達量（灰度相對值）Tab 6 NF-κB protein expression level（gray relative value）

3 討論

放射性食管炎是頸胸部腫瘤放射治療常見并發(fā)癥，主要臨床表現(xiàn)包括吞咽疼痛、吞咽困難、反酸、胸骨后燒灼感，嚴(yán)重者甚至可出現(xiàn)食管黏膜出血、食管穿孔、食管氣管瘺等急危重癥［7］，不僅給患者帶來極大痛苦，甚至部分患者因嚴(yán)重食管炎被迫中斷放療進程，限制放療療效［8］。因此，早期干預(yù)放射性食管炎可減輕患者吞咽痛苦、改善營養(yǎng)狀態(tài)、保證放療計劃順利完成，提高腫瘤控制率、改善患者遠期生存率。當(dāng)前放射性食管炎治療缺少有循證依據(jù)的治療手段，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療放射性食管炎效果有限。

潰瘍液是中日友好醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科研制的院內(nèi)制劑，是治療急性放射損傷的經(jīng)驗藥，治療放射性皮炎［9］、放射性口腔炎［10］、放射性食管炎［2］等放射性皮膚黏膜損傷疾病有顯著療效。潰瘍液由生大黃、白芷、當(dāng)歸、紅花、紫草等藥物組成。生大黃能瀉火解毒，涼血祛瘀；紫草涼血活瘀，清解血分熱毒；紅花能行瘀，并能活血潤血；當(dāng)歸能活血補血，能起消腫止痛，排膿生肌之功效；白芷能治瘡瘍腫痛，消腫排膿托瘡，生肌長肉。諸藥味溫涼并用，清熱涼血解毒而不涼遏，活血祛瘀止痛而不燥熱，并能消腫止痛、排膿生肌，共起解毒化瘀之功效。基于中醫(yī)外治理論制備的中藥潰瘍液主要通過皮膚及黏膜吸收起效，治療放射性皮炎、口腔炎取得顯著臨床療效，但治療放射性食管炎療效仍有待提升。出現(xiàn)這種差異的主要原因可能是由于食管獨特的解剖結(jié)構(gòu)和生理特點，導(dǎo)致藥物難以黏附在食管表面，影響藥物吸收利用。為解決這一問題，提高中藥潰瘍液的黏附性和吸收利用路，本研究計劃將潰瘍液進行納米化改良。納米水滑石（nano-LDH）由北京化工大學(xué)化學(xué)學(xué)院化工資源有效利用國家重點實驗室研究并開發(fā)［11］。nano-LDH又稱為納米級別層狀復(fù)合氫氧化物。近年來，nano-LDH 在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用引起了人們的極大興趣。nano-LDH 材料合成方式簡單且成本相對低廉，載藥效率高且藥物細(xì)胞膜透過率高［3］。目前，nano-LDH 作為一種新型藥物載體在抗菌，抗腫瘤和生物成像等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。nano-LDH 生物相容性好，容易被細(xì)胞攝取，且在酸性條件下易降解?；诩{米水滑石的材料學(xué)優(yōu)勢，選擇納米水滑石作為載體制備納米潰瘍液。

放射性食管損傷炎癥機制可分為直接損傷和間接損傷。直接損傷是指輻射直接作用于細(xì)胞DNA，導(dǎo)致DNA 斷裂。間接損傷是指放射線對水的作用間接形成的活性產(chǎn)物，即具有高度的活性和極強的氧化能力的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）發(fā)揮作用。ROS 可作為第二信使激活細(xì)胞內(nèi)多條信號通路和轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB 在ROS 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起重要作用。NF-κB 作為一種重要的多效性核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種基因的表達［12］。當(dāng)NF-κB 受 到 ROS 刺 激 時，導(dǎo) 致NF-κB 解離并以活性形式轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟動和調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白介素-6（IL-6）等多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄［13］。放射性食管炎通常伴有嚴(yán)重的吞咽疼痛或胸骨后燒灼感，與前列腺素-2（PGE-2）、P 物質(zhì)（SP）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等多種疼痛因子水平升高相關(guān)。本研究首先進行納米潰瘍液的藥效學(xué)研究，同時以NF-κB 為炎癥檢測指標(biāo)；PGE-2、SP、CGRP 作為疼痛相關(guān)指標(biāo)進行機制研究。

本次研究結(jié)果顯示，納米潰瘍液干預(yù)后放射性食管炎大鼠進食量高于其他各組，食管病理損傷評分低于其他各組，表明NANO-KYY 組大鼠食管炎癥、吞咽困難和吞咽疼痛較其他造模組更輕，納米潰瘍液治療放射性食管炎療效更加，優(yōu)于中藥潰瘍液和臨床常用治療放射性損傷藥物康復(fù)新液。而NANO 組大鼠進食量和食管損傷與MODEL 組無明顯差異，說明單純納米水滑石基質(zhì)對于大鼠放射性食管炎無明顯治療作用，只有與中藥潰瘍液結(jié)合制備納米潰瘍液，黏附性增強，藥物有效成分在食管表面滯留更長時間，才能提高療效，減輕大鼠食道炎癥和疼痛，促進大鼠進食。WB 結(jié)果顯示，造模后大鼠NF-κB 水平顯著升高，納米潰瘍液干預(yù)后NF-κB 水 平 顯 著 下 降。NF-κB 作 為 炎 癥 反 應(yīng) 的 重要分子，可調(diào)控TNF-α、IL-6 等多種炎癥因子，NF-κB 的激活是炎癥通路的核心步驟，而納米潰瘍液對NF-κB 水平的抑制也證明了其抗炎功效。疼痛癥狀出現(xiàn)時伴有多種疼痛因子水平升高，PGE-2在炎性疼痛及痛覺過敏的產(chǎn)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，能刺激長入食管組織的末梢神經(jīng)，進而產(chǎn)生痛感［14］。研究表明基因敲除PGE-2 受體可明顯減弱急性帶狀皰疹疼痛［15］；SP 是一種廣泛分布于細(xì)神經(jīng)纖維內(nèi)參與痛覺傳導(dǎo)的多肽，通過與神經(jīng)激肽-1（NK-1）受體結(jié)合發(fā)揮生理作用。通過直接或間接促進谷氨酸等的釋放，SP 參與痛覺傳遞，疼痛產(chǎn)生后，腦啡肽的釋放起到鎮(zhèn)痛作用［16］。SP 是疼痛傳導(dǎo)的關(guān)鍵因子，可激活參與痛感傳遞產(chǎn)生痛覺，水平與疼痛度正相關(guān)［17］；CGRP 是由一種感覺神經(jīng)末梢釋放的生物活性多肽［18］，廣泛分布在消化腸管、心血管系統(tǒng)、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在疼痛感覺傳遞中起重要作用，可通過參與痛覺信息傳遞及中樞敏化、介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激活膠質(zhì)細(xì)胞促進疼痛的發(fā)生［19］。ELISA 結(jié)果表明，放射性食管炎造模后，造模大鼠疼痛因子較正常大鼠顯著升高。給予不同干預(yù)方式，疼痛因子出現(xiàn)不同變化趨勢。NANO 組只應(yīng)用納米水滑石基質(zhì)干預(yù)，藥物中不含有中藥成分，三種疼痛因子水平與MODEL 組接近，故納米水滑石成分對疼痛無治療作用?？祻?fù)新液、中藥潰瘍液、納米潰瘍液都體現(xiàn)出對三種疼痛因子表達顯著的抑制作用，納米潰瘍液干預(yù)后PGE-2、SP、CGRP 下降與MODEL 組比較差異最為明顯。

綜上所述，納米潰瘍液對大鼠放射性食管炎有治療作用，可提高放射性食管炎大鼠進食量，減輕大鼠食管組織損傷，降低血清疼痛因子濃度；納米潰瘍液抗炎可能與降低NF-κB 炎癥因子水平相關(guān)。

本實驗選擇具有代表性的炎性反應(yīng)相關(guān)因子進行檢測，除此之外組織修復(fù)也是放射性食管炎重要病理變化，可在進一步實驗中檢測放射性食管炎大鼠食管組織中表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等蛋白表達水平。

作者貢獻度說明：

李凱旋：全程參與并撰寫論文；王欽：飼養(yǎng)動物，協(xié)助完成試驗，參與論文撰寫；鄭佳彬：指導(dǎo)實驗操作及論文撰寫；滕峰：指導(dǎo)動物放射造模；賈立群：課題設(shè)計，指導(dǎo)實驗及論文撰寫。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。