翁飛，孟盈，李騰，程時(shí)棟

（1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院設(shè)備處，武漢 430071；2.湖北省計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，武漢 430223）

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[1?2]是一種對(duì)特定的DNA或RNA 片段在體外記性快速擴(kuò)增的方法，由變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。PCR儀是基于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理，模擬DNA 或RNA 的復(fù)制過(guò)程，在模板、引物、聚合酶等存在的條件下，特異擴(kuò)增已知序列，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析的儀器設(shè)備。

根據(jù)JJF 1527—2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析校準(zhǔn)規(guī)范》[3]，PCR 儀的計(jì)量特性有溫度示值誤差、溫度均勻性、平均升溫速率、平均降溫速率、樣本濃度示值誤差、樣本線性。在對(duì)樣本濃度示值誤差進(jìn)行校準(zhǔn)時(shí)，由于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方法、樣本濃度測(cè)量平均值的計(jì)算方法存在多樣性，導(dǎo)致樣本濃度示值誤差的計(jì)算以及不確定度評(píng)定方法也存在多樣性。筆者通過(guò)20 組PCR 儀擴(kuò)增獲取的數(shù)據(jù)對(duì)這幾種校準(zhǔn)方法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，探討出兼顧數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和計(jì)算簡(jiǎn)潔性的PCR儀樣本濃度示值誤差校準(zhǔn)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

該方法使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)機(jī)構(gòu)為中國(guó)計(jì)量科學(xué)院，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以重量法制備值作為標(biāo)準(zhǔn)值，并采用數(shù)字PCR方法進(jìn)行突變基因拷貝數(shù)濃度驗(yàn)證。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)信息如表1，其包裝規(guī)格為96孔，反應(yīng)孔排布圖如圖1，設(shè)定U1、U2為目標(biāo)樣本。從冰箱內(nèi)取出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平衡至室溫并混勻，以3 000 r/min離心后使用。

圖1 PCR儀反應(yīng)孔排布圖

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的信息表

1.2 主要儀器

PCR 儀：隨機(jī)選取10 臺(tái)使用狀況良好的96 孔的定量PCR儀作為實(shí)驗(yàn)用設(shè)備。

1.3 PCR儀樣本濃度示值誤差校準(zhǔn)

1.3.1 校準(zhǔn)流程

依據(jù)JJF 1527—2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析校準(zhǔn)規(guī)范》，樣本濃度示值誤差的校準(zhǔn)步驟如圖2。

圖2 PCR儀樣本濃度示值誤差校準(zhǔn)步驟

PCR 儀樣本濃度示值誤差的不確定度評(píng)定基于GUM[4?5]進(jìn)行評(píng)定，其流程圖如圖3所示。

圖3 基于GUM的測(cè)量不確定度評(píng)定流程圖

1.3.2 校準(zhǔn)方法

在樣本濃度示值誤差的校準(zhǔn)過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合是基于最小二乘法[6?7]完成，有兩種方法；(1)采用配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的全部原始數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合；(2)先取同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)平均值，再根據(jù)這些平均值進(jìn)行擬合。根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣本所在反應(yīng)孔擴(kuò)增Ct值可求得若干個(gè)濃度對(duì)數(shù)值后，樣本濃度測(cè)量平均值的計(jì)算方法有兩種：(1)取濃度對(duì)數(shù)值的均值，根據(jù)均值求得對(duì)應(yīng)的濃度值作為樣本濃度的測(cè)量平均值；(2)求得每一個(gè)濃度對(duì)數(shù)值對(duì)應(yīng)的濃度測(cè)量值，取濃度測(cè)量值的均值作為目標(biāo)樣本濃度的測(cè)量平均值。在標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和樣本濃度測(cè)量平均值的計(jì)算過(guò)程中，不同方法的組合導(dǎo)致樣本濃度示值誤差的計(jì)算以及不確定度評(píng)定方法有以下4種：

方法一，標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的全部原始數(shù)據(jù)擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴(kuò)增Ct值及擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得若干個(gè)濃度對(duì)數(shù)值，取濃度對(duì)數(shù)值的均值，再根據(jù)均值求得對(duì)應(yīng)的濃度值作為樣本濃度的測(cè)量平均值。

方法二，標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的全部原始數(shù)據(jù)擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴(kuò)增Ct值及擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得若干個(gè)濃度對(duì)數(shù)值，求得每一個(gè)濃度對(duì)數(shù)值對(duì)應(yīng)的濃度測(cè)量值，取濃度測(cè)量值的均值作為目標(biāo)樣本濃度的測(cè)量平均值。

方法三，標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)先取同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)平均值，再根據(jù)這些平均值進(jìn)行擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴(kuò)增Ct值及擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得若干個(gè)濃度對(duì)數(shù)值，取濃度對(duì)數(shù)值的均值，再根據(jù)均值求得對(duì)應(yīng)的濃度值作為樣本濃度的測(cè)量平均值。

方法四，標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)先取同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)平均值，再根據(jù)這些平均值進(jìn)行擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴(kuò)增Ct值及擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得若干個(gè)濃度對(duì)數(shù)值，求得每一個(gè)濃度對(duì)數(shù)值對(duì)應(yīng)的濃度測(cè)量值，取濃度測(cè)量值的均值作為目標(biāo)樣本濃度的測(cè)量平均值。

2 PCR儀樣本濃度示值誤差不確定度評(píng)定

2.1 基于最小二乘法的不確定度評(píng)定

對(duì)于變量x和y，如果存在線性關(guān)系，則可以表示為y=a+bx，其中斜率b、截距a由獨(dú)立測(cè)得的n組值(x1，y1)，(x2，y2)，…，(xn，yn)確定。當(dāng)對(duì)測(cè)量值y進(jìn)行m次測(cè)量，被測(cè)量值的估計(jì)值xˉj的不確定度計(jì)算公式為[8?10]：

式中：xˉi——被測(cè)量值的平均值；

i——測(cè)量次數(shù)，i=1，2，…，n；

s(xˉi)——被測(cè)量值平均值的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差；

xˉj——被測(cè)量值的估計(jì)值；

s(y)——測(cè)量值的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差；

b——擬合線性方程的斜率；

j——測(cè)量次數(shù)，j=1，2，…，m；

xi——第i次測(cè)量值。

2.2 PCR儀樣本濃度示值誤差不確定度評(píng)定

2.2.1 數(shù)學(xué)模型

樣本濃度示值誤差測(cè)量模型為：

式中：Δc——樣本濃度示值誤差；

cˉ——樣本濃度測(cè)量平均值；

cs——樣本濃度標(biāo)稱值。

根據(jù)不確定度傳播規(guī)律[11?12]可知Δc不確定度的計(jì)算公式為：

其中u(cs)可以由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原始濃度及稀釋系數(shù)求得，因此Δc不確定度評(píng)定的關(guān)鍵為樣本濃度測(cè)量平均值cˉ的不確定度u(cˉ)的評(píng)定。

2.2.2cˉ測(cè)量不確定度分量評(píng)定

(1)方法一。樣本濃度測(cè)量平均值cˉ測(cè)量模型為：

式中：xˉ——樣本濃度對(duì)數(shù)值xi的均值，i=1，2，…，n；

n——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(S1～S7)反應(yīng)孔的數(shù)量。

樣本濃度測(cè)量平均值cˉ的不確定度為：

cˉ測(cè)量不確定度來(lái)源包括兩部分：測(cè)量重復(fù)性引入的u1(xˉ)和測(cè)量模型引入的u2(xˉ)。因此樣本濃度測(cè)量平均值的不確定度為：

式中：yi——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔擴(kuò)增Ct值，i=1，2，…，n；

s(y)——yi的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

k——包含因子，k=2；

ci——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的樣本濃度，i=1，2，…，n。

將公式(7)、(8)代入到公式(6)中即可得到樣本濃度測(cè)量平均值cˉ的合成不確定度。

(2)方法二。目標(biāo)樣本濃度測(cè)量平均值測(cè)量模型為：

式中：cj——樣本濃度的測(cè)量值，j=1，2，…，m。

cˉ測(cè)量不確定度來(lái)源包括兩部分：測(cè)量重復(fù)性引入的u1(cˉ)；測(cè)量模型引入的u2(cˉ)。因此目標(biāo)樣本濃度測(cè)量平均值的不確定度：

將式(13)～(16)代入式(12)即可得到樣本濃度測(cè)量平均值cˉ的合成不確定度。

(3)方法三。該方法與方法一中樣本濃度測(cè)量平均值的不確定計(jì)算公式類(lèi)似，同樣由公式(7)、(8)代入到公式(6)，只是標(biāo)準(zhǔn)偏差s(y)計(jì)算不同：

式中：p——配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度梯度數(shù)，且由p替代公式(8)中的n。

(4)方法四。與方法二中樣本濃度測(cè)量平均值的不確定計(jì)算公式類(lèi)似，同樣是由式(13)～(16)代入式(12)，只是用配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度梯度數(shù)p代替測(cè)量次數(shù)n。

2.2.3 Δc不確定度評(píng)定

根據(jù)公式(3)計(jì)算出u(Δc)后，樣本濃度示值誤差的擴(kuò)展不確定度為：

3 結(jié)果分析

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)行PCR 儀擴(kuò)增程序，分別用4 種方法對(duì)樣本示值誤差進(jìn)行校準(zhǔn)，總共進(jìn)行了20組實(shí)驗(yàn)，4種方法的校準(zhǔn)結(jié)果如表2所示。

表2 4種方法的校準(zhǔn)結(jié)果

3.2 差異顯著性檢驗(yàn)

3.2.1 樣本濃度相對(duì)示值誤差差異顯著性檢驗(yàn)

樣本濃度相對(duì)示值誤差計(jì)算公式為：δ(Δc)=Δc/cs×100%，用F檢驗(yàn)對(duì)4 種方法計(jì)算出的樣本濃度相對(duì)示值誤差進(jìn)行差異顯著性分析[13?15]，P=0.998>0.05，結(jié)果如表3所示。

表3 樣本濃度相對(duì)示值誤差差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 樣本濃度示值誤差相對(duì)擴(kuò)展不確定度差異顯著性檢驗(yàn)

樣本濃度示值誤差的相對(duì)擴(kuò)展不確定度[16]計(jì)算公式為：urel(Δc)=u(Δc)/Δc，用F檢驗(yàn)對(duì)4種方法計(jì)算出的樣本濃度示值誤差相對(duì)擴(kuò)展不確定度進(jìn)行差異顯著性分析，P=0.351>0.05，結(jié)果如表4。

表4 樣本濃度示值誤差相對(duì)擴(kuò)展不確定度差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

3.3 結(jié)果分析

從4 種方法的計(jì)算公式可以看出：(1) 4 種方法中，方法一和方法二是基于實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，其結(jié)果更能真實(shí)反映儀器的性能；(2)方法二和方法四中的計(jì)算更為繁瑣。

從表2 中的計(jì)算結(jié)果可知：(1)每一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，方法一和方法二的相關(guān)系數(shù)r值一致，方法三和方法四的相關(guān)系數(shù)r值一致，并且后者的r值更接近1，即先將同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)取平均值，再根據(jù)這些平均值擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本線性[17]更好；(2)方法一和方法三計(jì)算得到的示值誤差一樣，方法二和方法四得到的示值誤差一樣，即樣本濃度示值誤差值大小只與樣本濃度平均值的計(jì)算方法有關(guān)，并且方法一和方法三得到的示值誤差更?。?3) 20 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，4 種方法計(jì)算的樣本濃度示值誤差不確定度大小均不一致，即濃度示值誤差不確定度大小與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方法、樣本濃度平均值的計(jì)算方法均有關(guān)，并且4 種方法中方法四計(jì)算出的不確定度值最小。

從表3中結(jié)果可知，4種方法計(jì)算的樣本濃度相對(duì)示值誤差差異性不顯著，從表4 中的結(jié)果可知，4種方法計(jì)算的樣本濃度示值誤差相對(duì)不確定度差異性不顯著(P=0.351>0.05)。

4 結(jié)語(yǔ)

基于以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，4 種PCR 儀樣本濃度示值誤差校準(zhǔn)方法的結(jié)果差異性不顯著。因此綜合考慮計(jì)算的復(fù)雜度、計(jì)算結(jié)果反應(yīng)儀器性能的真實(shí)程度等因素，推薦采用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、將依據(jù)濃度對(duì)數(shù)值的均值求得的濃度值作為樣本濃度的測(cè)量平均值這種方法進(jìn)行PCR 儀樣本示值誤差校準(zhǔn)。