杜芹芹,楊成

(1.大連理工大學化工學院,遼寧 大連 116024;2.大連理工大學化學學院,遼寧 大連 116024)

三七是五加科植物人參三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根及根莖,具有散瘀止血,消腫定痛,調節(jié)免疫等功效,在治療心腦血管疾病,抗炎抗腫瘤等方面有較好的應用[1]。三七的化學成分包含皂苷類、多糖類、揮發(fā)油類、黃酮類、甾醇類、聚炔醇類、氨基酸類等,其中三七皂苷和三七多糖被認為是主要的活性成分,研究最為廣泛[2-4],揮發(fā)性成分的研究相對較少[5-6]。三七有生品和熟品之分,目前三七炮制有蒸制、油炸、砂燙、微波等,其中蒸制法以其操作方便、溫度易于控制等優(yōu)點而較為常用[7]。三七在臨床應用上素有“生消熟補”之說:生三七偏于活血化瘀、消腫止痛,主要用于降血脂,防止動脈粥樣硬化等;熟三七偏于提高免疫、補氣養(yǎng)血,主要用于抗疲勞、抗腫瘤、免疫調節(jié)等[8-9]。三七經(jīng)炮制后成分變化明顯,皂苷類成分發(fā)生了糖基水解和脫水反應[10-11],總黃酮含量降低,多糖含量增加,與三七熟品補血補氣功效增強具有相關性[12]。但目前為止,尚未有從揮發(fā)性成分角度對“生消熟補”理論進行研究的相關報道。

頂空進樣技術是一種對液體或固體樣品中的可揮發(fā)性成分進行分析的有效方法,結合氣相色譜質譜聯(lián)用技術用于未知揮發(fā)性成分的定性分析,具有簡便快速,靈敏度高等特點,目前在生三七揮發(fā)性成分的研究中已有應用[13-15],但鮮見于熟三七的應用報道。本研究采用頂空-氣相色譜質譜聯(lián)用技術(HS-GC-MS),建立了三七揮發(fā)性成分HS-GC-MS測定方法,明確了三七及其炮制品的揮發(fā)性成分組成并比較了其變化,對炮制后成分的變化進行了合理地機理推論,為三七“生消熟補”的藥理解釋提供揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器7890A-5975C氣相色譜質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司),配電子轟擊(EI)離子源和Combi-PAL多功能進樣器(瑞士CTC公司);BS 124 S萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 材料生三七(Panaxnotoginseng,PN)購于大連藥房 (產地為云南文山,批號:20150802,規(guī)格:20頭;批號:20211018,規(guī)格:30頭;批號:20210312,規(guī)格30頭),藥材經(jīng)大連理工大學李娜副教授鑒定為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根及根莖。

2 方法與結果

2.1 樣品制備熟三七(SteamedPanaxnotoginseng,S-PN)由同批次生三七經(jīng)過100 ℃下蒸制3 h,60 ℃真空干燥8 h加工而成[16]。將生、熟三七用粉碎機粉碎后過80目篩,備用。

2.2 頂空提取方法精密稱取粉碎后的樣品粉末各1.0 g (精確到0.000 1 g),分別放入20 mL頂空進樣瓶中,密封后置于樣品盤上。樣品瓶加熱溫度為120 ℃,平衡時間為30 min,進樣針溫度設為100 ℃,進樣體積為500 μL。

2.3 氣相色譜-質譜條件氣相色譜條件:DB-FFAP毛細管色譜柱 (30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為He氣,流速為1.0 mL·min-1,分流比為20∶1。進樣口溫度為250 ℃,初始柱溫40 ℃,以10 ℃·min-1的速度升至240 ℃,保持15 min。

質譜條件:EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,傳輸線溫度為250 ℃.全掃描采集模式,掃描范圍m/z 30～500,掃描速率1.94 scans·s-1。

2.4 數(shù)據(jù)處理采用NIST 11.L譜庫進行譜圖檢索。根據(jù)匹配度和文獻已報道物質進行比對,選擇正匹配度大于800的物質。

2.5 頂空條件優(yōu)化平衡溫度和平衡時間是影響頂空提取效率的兩個重要因素。本文考察了80、100、120、140 ℃(平衡時間為30 min)4個溫度水平對三七揮發(fā)性成分的影響,結果如圖1 所示,當平衡溫度從80 ℃升到120 ℃時,化合物種類隨溫度升高而增加,峰強度也隨之增強。但溫度達到140 ℃時,幾乎檢測不到化合物,這是因為在140 ℃時,生、熟三七粉末在頂空瓶中結塊,影響了揮發(fā)性成分的逸出。此外,本試驗對平衡溫度為120 ℃時不同平衡時間(15、30、45 min)下三七揮發(fā)性成分的檢出進行了分析,發(fā)現(xiàn)目標物的種類和強度隨著時間延長而持續(xù)增加,30 min以后趨于穩(wěn)定(結果見圖2)。最終確定頂空條件為120 ℃下平衡30 min。

a.80 ℃;b.100 ℃;c.120 ℃;d.140 ℃

a.15 min;b.30 min;c.45 min

2.6 揮發(fā)性成分的定性分析生、熟三七在選定條件下的揮發(fā)性成分總離子流圖如圖3所示,從中可以看出它們的差異較大,主要體現(xiàn)在化合物種類和相對含量方面,說明炮制對揮發(fā)性成分有著顯著影響。通過NIST 11.L標準譜庫檢索,共鑒定出了126種化合物,采用面積歸一化法測定各成分的相對含量,具體如表1所示。

表1 生、熟三七揮發(fā)性成分分析

a.生三七;b.熟三七

生三七中檢測出103種揮發(fā)性成分,包括14種醛類、2種硫化物、3種呋喃衍生物、6種酯類、25種醇類、8種酮類、39種萜烯類、4種烷烴和2種雜環(huán)類。其中萜烯類化合物占總物質含量的51.75%,結果與文獻報道一致[14]。相對含量超過2%的化合物有6種,依次為α-古蕓烯(12.58%)、β-蒎烯(8.34%)、甘香烯(5.53%)、β-蓽澄茄油烯(3.80%)、γ-欖香烯(2.30%)、β-依蘭烯(2.00%)。本研究中匹配得到乙醛、丙醛、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、戊醛、丙酮、2-丁酮、2,3-戊二酮、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、甲醇、乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇等15種小分子化合物,推測該部分物質可能是三七成分在頂空高溫條件下的裂解或氧化產物。β-欖香烯、β-愈創(chuàng)木烯、γ-杜松烯、β-花柏烯,(+)-瓦倫烯等萜烯異構體也在本研究中首次被鑒定出來。熟三七中檢測出126種揮發(fā)性成分,包括16種醛類,3種硫化物,8種呋喃衍生物,7種酯類,27種醇類,9種酮類,9種含氮化合物,1種酸類,39種萜烯類,5種烷烴和2種雜環(huán)類。由表1和圖4可以看出,三七炮制后揮發(fā)性成分變化主要為醇類,酮類化合物種類增多,新生成含氮化合物和乙酸,呋喃衍生物種類和相對含量均明顯增加,萜烯類成分略有損失,α-蒎烯、β-蒎烯相對含量明顯降低。

圖4 生、熟三七揮發(fā)性成分比較

3 討論

預試驗中嘗試采用頂空瓶中加溶劑后提取三七中揮發(fā)性成分,效果不理想。故試驗過程中是直接對三七粉末進行頂空提取。熟三七經(jīng)過高溫蒸制和低溫烘干等熱處理后,有部分揮發(fā)性成分相對含量明顯變化,推測是因為在炮制過程中損失,或者轉化為與其結構相似的化合物[17]。生三七中α-蒎烯,β-蒎烯是檢出較多的萜烯類成分。研究表明,蒎烯具有較強的抗腫瘤和抗真菌活性,可增強抗生素對彎曲桿菌的抑制作用,誘導大鼠產生抗驚厥和抗氧化作用,同時具有鎮(zhèn)痛,抗過敏以及趨避昆蟲等藥物活性[18-20]。這可能與生三七在消腫止痛,活血化瘀方面具有顯著功效相關。而熟三七中蒎烯相對含量較低,導致熟三七在消炎方面的藥理活性減弱。熟三七中3-糠醛含量較高 (1.14%),新生成的呋喃類衍生物、乙酸、羥基丙酮、1,2-丁二醇以及含氮雜環(huán)化合物等17種物質是其特有的成分,推測均與生三七炮制過程中發(fā)生美拉德反應有關。生三七中含有多種糖和游離氨基酸[21],具有發(fā)生美拉德反應的物質基礎,熟三七的熱處理炮制過程則為美拉德反應的發(fā)生提供了必要的外部條件。熟三七中的特有揮發(fā)性物質,如醛類,羰基類,雜環(huán)類化合物,大多產生于美拉德反應的中間階段,即為烯醇化反應產物或Strecker降解產物。研究表明,美拉德反應產物具有顯著的抗氧化活性,可抑制血管緊張素Ⅰ轉化酶的活性,降低血壓,保護心肺功能,可通過刺激多種免疫細胞的自然產生來增強天然免疫和適應性免疫[22-23]。熟三七中美拉德反應產物的相對含量較高(7.08%),可能是熟三七發(fā)揮其補益,增強免疫功效的物質基礎之一。對于生熟三七的藥理活性差異與炮制過程中揮發(fā)性成分的具體相關性還需要進一步的藥理實驗證明,這是后續(xù)將進行的工作。

本文通過頂空-氣相色譜質譜聯(lián)用方法檢測了生、熟三七中的揮發(fā)性成分,共鑒定出126種化合物;對三七炮制前后的揮發(fā)性成分變化進行分析并對其產生機理進行合理推斷,發(fā)現(xiàn)熟三七中萜烯類化合物含量明顯降低,同時新生成了多種美拉德中間反應產物,這有助于多維度評價三七炮制工藝。結合已報道的化合物的生物活性,從揮發(fā)性成分角度闡釋“生消熟補”的作用機制,為三七的炮制規(guī)范提供重要的數(shù)據(jù)支持,為三七的深度開發(fā)應用提供化學依據(jù)。但目前三七炮制工藝并未形成規(guī)范,對不同炮制過程中揮發(fā)性成分的多維變化也還需要更進一步的分析研究。