焦 雪，董羽織，王靖雯，呂晨澤，方結(jié)紅，蔣 晗

（中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院浙江省特色農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點實驗室，浙江杭州 310018）

多黏菌素是一種提取于多粘芽孢桿菌變種的多肽類抗生素，臨床上用于治療多重耐藥革蘭氏陰性菌引起的感染，被稱為抵抗多重耐藥細菌感染的“最后一道防線”[1-2]。此外，硫酸粘菌素也在全球養(yǎng)殖業(yè)中作為細菌性疾病治療用藥而廣泛應(yīng)用[3]。然而，自2015 年質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1首次被報道后[4]，其在臨床、食品、畜牧養(yǎng)殖、水產(chǎn)及相關(guān)環(huán)境中屢屢檢出[5-6]。Borowiak 等[7]分析了德國聯(lián)邦風險評估研究所從動物、食物、飼料和環(huán)境中收集的耐藥沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)mcr-1基因在德國家畜和食品來源的沙門氏菌中廣泛流行。此外，mcr-1基因也普遍存在于大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌中[8-11]。有報道顯示，動物源、動物性食品源和人源腸桿菌科細菌中，mcr-1基因檢出率在5%～30%[12-13]。與其他國家相比，我國的mcr-1基因檢出率較高，在5%～80%之間[14-16]。mcr-1基因的流行率高且傳播速度快，嚴重威脅了公眾安全和人類健康，因此亟需建立一種適用于基層的的檢測方法對該耐藥基因進行快速診斷和及時監(jiān)測。

目前，對mcr-1基因的檢測，主要是基于傳統(tǒng)PCR、熒光定量PCR 以及數(shù)字PCR 等技術(shù)的分子檢測方法[17-20]。這些檢測方法重復(fù)性、特異性均較好，但大多數(shù)仍存在反應(yīng)時間長、操作較為繁瑣等弊端，且相關(guān)實驗設(shè)備昂貴，對技術(shù)人員的熟練度要求高，不適用于基層對目的樣品的快速檢測。重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）被稱為是可以替代PCR 的核酸檢測技術(shù)，其特點是能夠在常溫條件下實現(xiàn)核酸擴增[21]。RPA 技術(shù)使用重組酶促進寡核苷酸引物與其雙鏈DNA 分子互補序列結(jié)合，該過程由單鏈DNA 結(jié)合蛋白輔助，可防止引物解離，之后由DNA 聚合酶進行復(fù)制[22]。RPA 技術(shù)具有反應(yīng)時間快速、操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點，一般在20～30 min 即可獲得檢出范圍內(nèi)的擴增產(chǎn)物，非常適用于基層檢測[23-26]。通過與熒光基團標記后，獲得的擴增產(chǎn)物可與側(cè)流層析試紙條（lateral flow dipstick，LFD）相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)可視化檢測。RPA 技術(shù)在臨床檢驗、動物疫病診斷、畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)、微生物及其耐藥性檢測等領(lǐng)域均有涉及，已成功應(yīng)用到日本血吸蟲、非洲豬瘟病毒、豬嵴病毒、布魯氏菌病等的檢測中，結(jié)合LFD 后，其定性檢測結(jié)果可在2～5 min 內(nèi)直接進行判定[27-30]。此外，LFD 檢測結(jié)果可通過手持式膠體金讀數(shù)儀掃描，讀取T/C 值，進一步實現(xiàn)目的基因的定量檢測。

本研究利用RPA-LFD 技術(shù)輔以手持式膠體金讀數(shù)儀，建立了一種快速、高效、可應(yīng)用于基層的細菌多黏菌素耐藥基因mcr-1的檢測方法，這對多黏菌素耐藥基因mcr-1的快速檢測、切斷傳播途徑、保障人們身體健康具有十分重要的意義[31-33]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

攜帶mcr-1基因的重組質(zhì)粒pGM-T-mcr-1、攜帶質(zhì)粒pGM-T-mcr-1的重組大腸桿菌Escherichia coliTop10-pGM-T-mcr-1本實驗室前期構(gòu)建；質(zhì)粒pGM-T、大腸桿菌E. coliTop10 杭州紐貝生物科技有限公司；質(zhì)控菌株大腸桿菌E. coliATCC 25922（不含耐藥基因） 美國典型培養(yǎng)物保藏中心；不攜帶mcr-1基因的大腸桿菌E. coli、彎曲腸桿菌Enterobacter campylobacter、霍氏腸桿菌E. hormaechei、干酪乳桿菌Lactobacillus casei實驗室前期分離鑒定；15 株大腸桿菌分離株E. coli（菌株編號E1～E15）、15 株彎曲腸桿菌分離株E. campylobacter（菌株編號EC1～EC15） 來源于浙江省某養(yǎng)殖場的豬糞樣品，為實驗室前期分離保存；15 份生豬養(yǎng)殖場環(huán)境樣品（樣品編號SZ1～SZ15） 來源于浙江省某養(yǎng)殖場豬糞（取生豬新鮮糞便分別密封于無菌均質(zhì)袋中，置于裝有冰袋的泡沫箱中，密封后在2 h 內(nèi)運送回實驗室處理）；15 份肉雞養(yǎng)殖場環(huán)境樣品（樣品編號RJ1～RJ15） 來源于浙江省某養(yǎng)殖場雞糞（處理方法同上）；15 份豬肉樣品（樣品編號ZR1～ZR15）和15 份雞肉樣品（樣品編號JR1～JR15） 浙江省某農(nóng)貿(mào)市場（處理方法同上）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基和甘油等生化試劑 青島海博生物技術(shù)有限公司；RPA 核酸擴增試劑盒（基礎(chǔ)型） 英國TwistDX 公司；其它常規(guī)生化試劑 美國Sigma 公司；PCR 試劑、細菌質(zhì)粒提取試劑盒、細菌基因組DNA 提取試劑盒等分子生物學(xué)試驗用試劑 寶生物工程（大連）有限公司。

SW-CJ-2FD/2F 超凈工作臺 上海BOXUN 公司；GT14DP 高壓蒸汽滅菌鍋 美國ZEALWAYF公司；NanoDrop 2000c 超微量紫外分光光度計 美國Thermo Scientific 公司；EPS-600 電泳裝置 上海Tanon 公司；Arktik PCR 儀 美國Thermo Scientific 公司；Gel Doc EZ 凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad 公司；TSR-200 手持式膠體金讀數(shù)儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 攜帶mcr-1基因的標準質(zhì)粒pGM-T-mcr-1制備 在-80 ℃冰箱中取出實驗室凍存的攜帶mcr-1基因的重組大腸桿菌E. coliTop10-pGM-T-mcr-1劃線于LB 瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，搖床中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600為1.0，參照細菌質(zhì)粒提取試劑盒操作說明書方法提取攜帶mcr-1基因標準質(zhì)粒pGM-T-mcr-1。利用Nanodrop 2000c 紫外分光光度計測定標準質(zhì)粒濃度。采用煮沸法制備待測大腸桿菌E. coli、彎曲腸桿菌E. campylobacter、霍氏腸桿菌E. hormaechei、干酪乳桿菌L. casei等菌液模板DNA：取1 μL 待測菌液加入30 μL Tris 緩沖液，煮沸5 min，冰上冷卻2 min，離心12000 r/min，2 min，取上清液用作DNA 模板[34]。

1.2.2 PCR 和RPA 引物設(shè)計 登錄NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載mcr-1基因序列，分析目標基因mcr-1序列的多態(tài)性并確定其保守區(qū)域。針對保守區(qū)域序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計PCR 與RPA 引物。PCR 與RPA 引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RPA 擴增和PCR 擴增引物序列Table 1 Sequence of RPA amplification and PCR amplification primers

1.2.3 PCR 與RPA 反應(yīng)體系與反應(yīng)程序 PCR 反應(yīng)體系：總體系25.0 μL，Premix TaqTM12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 樣本2 μL，滅菌去離子水8.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30次循環(huán)；72℃延伸20 s，72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。取6 μL 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，分析凝膠成像結(jié)果。RPA 反應(yīng)體系（50.0 μL）：反應(yīng)干粉1 管，Rehydration Buffer 29.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Mg2+2.5 μL，DNA 樣本5.0 μL，滅菌去離子水11.0 μL。37 ℃孵育30 min。RPA 擴增產(chǎn)物純化后進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分析凝膠成像結(jié)果。

1.2.4 RPA-LFD 可視化檢測策略 RPA-LFD 可視化檢測策略如圖1 所示。RPA 引物熒光集團標記：mcr-1-rpa-F2 引物5’端標記Biotin，mcr-1-rpa-R2 引物5’端標記Digoxin；LFD 試紙條制備：利用金標點膜儀將0.65 mg/mL 抗Biotin 單克隆抗體、1 mg/mL羊抗鼠多克隆二抗和10 μg/mL 的膠體金標記Digoxin單抗溶液分布均勻標記在LFD 試紙條NC 膜的檢測線T 線、質(zhì)控線C 線和結(jié)合墊上。將標記好的NC 膜和結(jié)合墊置于烘箱37 ℃干燥12 h。將干燥好的NC 膜、結(jié)合墊與樣品墊、吸收墊和底板組合組裝成LFD 試紙條；RPA-LFD 可視化：將稀釋后的RPA 擴增產(chǎn)物滴加到LFD 試紙條樣品墊，標記有Biotin 和Digoxin的擴增產(chǎn)物側(cè)向?qū)游龊蟊话辉跈z測線T 的抗Biotin 單克隆抗體捕獲，被捕獲的擴增產(chǎn)物因標記有Digoxin，將膠體金標記Digoxin 單抗捕獲在T 線，多余的膠體金標記Digoxin單抗在控制線C 線被包被的多克隆二抗捕獲，最終實現(xiàn)T 線、C 線顯色；當擴增產(chǎn)物無目標產(chǎn)物時，則只有C 線顯色；可用TSR-200 手持式膠體金讀數(shù)儀讀取試紙條T/C 值，記錄數(shù)據(jù)，分析檢測定量結(jié)果。

圖1 RPA-LFD 可視化檢測原理圖Fig.1 Schematic diagram of RPA-LFD visual inspection

1.2.5 RPA-LFD 方法的優(yōu)化 RPA 反應(yīng)體系見1.2.3。用LFD 試紙條緩沖液將RPA 擴增產(chǎn)物稀釋50 倍進行LFD 側(cè)流層析。5～10 min 內(nèi)讀取結(jié)果。為提高目標基因的擴增效率，獲得最優(yōu)的反應(yīng)條件，對RPA-LFD 可視化體系的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間以及Mg2+反應(yīng)濃度進行了優(yōu)化。設(shè)置反應(yīng)溫度梯度為：30、35、37、39、45 和50 ℃；固定反應(yīng)溫度以及Mg2+反應(yīng)濃度，設(shè)置反應(yīng)時間梯度為：2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5 和30 min；設(shè)置Mg2+反應(yīng)濃度梯度為：2.8、5.6、8.4、11.2、14 和16.8 mmol/L。在研究一個變量時，RPA 反應(yīng)的其它條件按照

1.2.3 里的條件固定。

1.2.6 RPA-LFD 方法特異性分析 采用優(yōu)化后的RPA-LFD 體系，以重組質(zhì)粒pGM-T-mcr-1和重組大腸桿菌E. coliTop10-pGM-T-mcr-1為陽性對照，以質(zhì)粒pGM-T、大腸桿菌E. coliTop10、耐藥敏感菌株大腸桿菌E. coliATCC25922、以經(jīng)鑒定不攜帶mcr-1基因的大腸桿菌E. coli、彎曲腸桿菌E.campylobacter、霍氏腸桿菌E. hormaechei、干酪乳桿菌L. casei分離株為陰性對照，以滅菌去離子水為空白對照，分析RPA-LFD 方法特異性。

1.2.7 RPA-LFD 方法靈敏度分析 利用Nanodrop 2000c 紫外分光光度計測定提取的pGM-T-mcr-1標準質(zhì)粒濃度，并計算標準質(zhì)粒拷貝數(shù)?？截悢?shù)計算公式為：拷貝數(shù)/μL=質(zhì)粒濃度（ng/μL）×6.02×1023/（660×質(zhì)粒長度），其中6.02×1023為1 摩爾中含有的摩爾分子（拷貝數(shù)）；660 為計算dsDNA 平均分子量的常數(shù)。用Tris-HCl 緩沖液以10 為倍數(shù)梯度稀釋標準質(zhì)粒，制備108、107、106、105、104、103、102、101、100和10-1copies/μL 濃度梯度的標準質(zhì)粒溶液。以10 倍濃度梯度稀釋的標準質(zhì)粒溶液為模板，采用優(yōu)化的最優(yōu)RPA-LFD 反應(yīng)，分析RPA-LFD 方法靈敏度。同時，利用讀數(shù)儀讀取LFD 試紙條T/C 值，以T/C 值為縱坐標軸，以標準質(zhì)粒拷貝數(shù)濃度的lg10對數(shù)為橫坐標軸，建立mcr-1基因定量標準曲線。

1.2.8 RPA-LFD 方法用于模擬食樣檢測 從當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場購買豬肉和雞肉等樣品，參考GB 4789.1 進行樣品前處理，制成樣品液。用細菌基因組DNA 提取試劑盒法提取樣品DNA，采用常規(guī)PCR 方法確證所有樣品中不含mcr-1耐藥基因。將標準質(zhì)粒添加到豬肉和雞肉樣品，使得樣品中標準質(zhì)粒菌株的終濃度為104～100copies/μL，制備樣品液并提取樣品DNA，用建立的RPA-LFD 方法分析模擬食樣中攜帶mcr-1基因情況。

1.2.9 RPA-LFD 方法用于實際樣品檢測 利用RPA-LFD 方法和常規(guī)PCR 方法，分析15 份豬肉樣品（樣品編號ZR1～ZR15）、15 份雞肉樣品（樣品編號JR1～JR15）、15 份生豬養(yǎng)殖場環(huán)境樣品（樣品編號SZ1～SZ15）、15 份肉雞養(yǎng)殖場環(huán)境樣品（樣品編號RJ1～RJ15）、15 株大腸桿菌分離株E. coli（菌株編號E1～E15）和15 株彎曲腸桿菌分離株樣品E. campylobacter（菌株編號EC1～EC15）中攜帶mcr-1基因情況，分析RPA-LFD 方法與常規(guī)PCR 方法檢測結(jié)果一致性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Adobe Photoshop CC 2019將所得電泳、試紙條圖片進行標注；利用OriginLab Origin 2021 對數(shù)據(jù)進行處理并制作柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA-LFD 檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化

以mcr-1基因標準質(zhì)粒pGM-T-mcr-1為模板，對RPA-LFD 方法的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間以及Mg2+濃度進行優(yōu)化。設(shè)置30～50 ℃溫度梯度，對反應(yīng)溫度進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，在35、37 和39 ℃的反應(yīng)溫度下，mcr-1基因檢出效果均較好，電泳條帶明亮且試紙條的目標檢測線較為清晰（圖2a1～圖2a3）。設(shè)置2.5～30 min 反應(yīng)時間梯度，對反應(yīng)時間進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，在電泳條帶和試紙條顏色在反應(yīng)20、22.5 和30 min 處清晰明亮，mcr-1基因檢出效果均較好（圖2b1～圖2b3）。設(shè)置2.8～16.8 mmol/L 的Mg2+反應(yīng)濃度梯度，優(yōu)化Mg2+濃度，結(jié)果顯示，Mg2+濃度達到14.0 和16.8 mmol/L 時mcr-1耐藥基因檢出效果均較好（圖2c1～圖2c3）。綜上所述，結(jié)合高效與節(jié)約角度，37 ℃為最優(yōu)反應(yīng)溫度，14 mmol/L 為最優(yōu)Mg2+濃度，22.5 min 為最佳反應(yīng)時間。

圖2 RPA-LFD 反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of RPA-LFD reaction conditions

2.2 特異性試驗

特異性試驗按照1.2.6 進行，檢測結(jié)果如圖3 所示。經(jīng)RPA-LFD 檢測，僅重組質(zhì)粒pGM-T-mcr-1和重組大腸桿菌E. coliTop10-pGM-T-mcr-1為的檢測結(jié)果顯示為陽性。質(zhì)粒pGM-T、大腸桿菌E. coliTop10、耐藥敏感菌株大腸桿菌E. coliATCC25 922、不攜帶mcr-1基因的大腸桿菌E. coli、彎曲腸桿菌E. campylobacter、霍氏腸桿菌E. hormaechei、干酪乳桿菌L. casei分離株等不含mcr-1耐藥基因樣品檢測結(jié)果均顯示為陰性。試驗結(jié)果表明，本研究建立的RPA-LFD 檢測mcr-1耐藥基因的方法特異性好，與其他不攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒和分離株無交叉反應(yīng)。

圖3 RPA-LFD 特異性檢測Fig.3 RPA-LFD specificity test

2.3 靈敏度試驗

靈敏度試驗按照1.2.7 進行，檢測結(jié)果如圖4 所示。以108～10-1copies/μL 濃度梯度的mcr-1基因標準質(zhì)粒為RPA 擴增模板，進行RPA-LFD 靈敏度試驗。結(jié)果表明 RPA-LFD 方法檢測mcr-1耐藥基因的檢測靈敏度為 101copies/μL，具有較好的檢測靈敏度。根據(jù)LFD 試紙條T/C 值和對應(yīng)mcr-1基因標準質(zhì)?？截悢?shù)濃度的對數(shù)，建立mcr-1基因RPALFD 定量標準曲線，結(jié)果顯示，T/C 值和對應(yīng)mcr-1基因標準質(zhì)?？截悢?shù)濃度的對數(shù)存在顯著的正相關(guān)性，標準曲線方程為y=0.117x+0.051，R2=0.9920。

圖4 RPA-LFD 檢測靈敏度Fig.4 RPA-LFD detection sensitivity

2.4 模擬食樣檢測

模擬食樣檢測按照1.2.8 進行，檢測結(jié)果如表2所示。RPA-LFD 方法對添加mcr-1基因標準質(zhì)粒的模擬食樣的檢出結(jié)果傳統(tǒng)PCR 方法檢測結(jié)果一致，且RPA-LFD 方法檢測模擬樣品中的攜帶mcr-1耐藥基因的菌液的檢出限可達101copies/μL，比PCR 方法的檢出限102copies/μL 低1 個數(shù)量級。

表2 模擬食樣檢測結(jié)果Table 2 Test results of simulated food samples

2.5 實際樣品檢測

實際樣品檢測按照1.2.9 進行，檢測結(jié)果如表3所示。在實際樣品的檢測試驗中，RPA-LFD 方法與常規(guī)PCR 方法對15 份豬肉樣品（樣品編號ZR1～ZR15）、15 份雞肉樣品（樣品編號JR1～JR15）、15 份生豬養(yǎng)殖場環(huán)境樣品（樣品編號SZ1～SZ15）、15 份肉雞養(yǎng)殖場環(huán)境樣品（樣品編號RJ1～RJ15）、15 株大腸桿菌分離株E. coli（菌株編號E1～E15）和15 株彎曲腸桿菌分離株樣品E. campylobacter（菌株編號EC1～EC15）中mcr-1基因攜帶情況進行分析，結(jié)果顯示，RPA-LFD 方法與常規(guī)PCR 方法陽性樣本檢出率一致，共檢出9 份mcr-1基因陽性樣品。RPALFD 定量分析顯示，陽性樣品中mcr-1基因濃度在4.5×102～8.6×104copies/μL 之間。

3 討論與結(jié)論

自細菌多黏菌素耐藥基因mcr-1被報道以來，基于PCR 方法[17-20]和重組酶介導(dǎo)擴增方法[35]等檢測方法相繼出現(xiàn)。如屈素潔等[17]建立了blaNDM-1和mcr-1基因雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法，該法對mcr-1基因檢出下限為1.63×101copies/μL，并且能夠特異性的檢出blaNDM-1和mcr-1基因質(zhì)粒標準品，重復(fù)性好。沈偉偉等[18]建立了雙重熒光定量PCR 檢測攜帶mcr-1基因的鼠傷寒沙門菌的檢測方法，該法對mcr-1基因檢測的線性范圍為1.40×101～1.40×108copies/μL，能夠?qū)崿F(xiàn)對攜帶mcr-1基因的鼠傷寒沙門菌的篩查與耐藥性持續(xù)監(jiān)測。車勇良等[35]建立了多黏菌素耐藥基因mcr-1重組酶介導(dǎo)擴增結(jié)合熒光定量PCR 的方法，可在21 min 后出結(jié)果，能特異性地檢測多黏菌素耐藥基因mcr-1，最低檢出限為102copies/μL 的mcr-1陽性質(zhì)?？截悢?shù)。這些檢測方法重復(fù)性、特異性均好，但大多數(shù)仍存在依賴大型儀器等不足，目前仍未見適用于基層進行耐藥篩查和監(jiān)測的mcr-1耐藥基因快速檢測方法。

本研究利用RPA-LFD 技術(shù)，是一項將重組酶聚合酶擴增、膠體金標記（三明治夾心法）、分子雜交和側(cè)向流層析等方法相結(jié)合，且結(jié)果可視化的核酸檢測技術(shù)[36]，與PCR 方法相比，不需要復(fù)雜的熱循環(huán)和PCR 反應(yīng)儀器，用時短，在此次細菌多黏菌素耐藥基因mcr-1的檢測中，只需要37 ℃恒溫擴增20 min即可完成，且檢出限為101copies/μL，比PCR 法低一個數(shù)量級且模擬樣品檢出結(jié)果與PCR 法一致。若無恒溫條件也可以手握進行核酸擴增，隨后將擴增產(chǎn)物滴加在試紙條上便可用肉眼讀數(shù)，也可用手持式膠體金讀進行定量分析，十分簡便快速。

綜上，本研究建立的RPA-LFD 方法檢測特異性、靈敏度好，縮短了檢測時長，降低了對儀器設(shè)備及實驗人員的依賴性。這對在生豬養(yǎng)殖場和肉雞養(yǎng)殖場開展mcr-1耐藥基因監(jiān)測、切斷傳播途徑、保障人們身體健康具有重要意義[37]；同時，可為其它致病微生物及其耐藥基因的快速檢測方法研究提供借鑒，使致病微生物及其耐藥性基因的檢測向高通量、高靈敏度、簡便快捷、經(jīng)濟適用的方向發(fā)展。