郭 瑋，劉苗苗, ，潘 越，馮明星，姚現(xiàn)琦，張 歡，黃峻榕，曹云剛,

（1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.運城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運城 044000；3.臨沂金鑼文瑞食品有限公司，山東臨沂 276036）

肉及肉制品營養(yǎng)豐富，感官獨特，是人類日常膳食的重要組成，也是當(dāng)前預(yù)制食品生產(chǎn)加工的重要原料。然而，肉制品在屠宰、加工、運輸、銷售等各環(huán)節(jié)均易受到微生物的污染，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，造成經(jīng)濟損失和食品安全問題的發(fā)生。食品防腐劑[1]是一類可以抑制微生物生長繁殖、防止食品腐敗變質(zhì)、延長保質(zhì)期的食品添加劑。傳統(tǒng)的食品防腐劑，如：苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯、二氧化硫、亞硫酸鹽及亞硝酸鹽等，多為化學(xué)合成防腐劑[2]。該類防腐劑的長期、過量使用不僅易誘發(fā)食物中毒事件，還存在致癌、致畸等潛在風(fēng)險，嚴重危害人體健康[3]。因此，亟需尋找安全、高效的替代型防腐劑。

天然防腐劑[4]是指從植物、動物和微生物或其代謝產(chǎn)物中分離提取的一類具有抑菌防腐敗作用的天然產(chǎn)物，具有綠色、安全等特點，是目前食品安全領(lǐng)域關(guān)注的焦點。植物精油是從草本植物的花、葉、根、莖、皮、果實等部位經(jīng)過特定的提取、純化等工藝得到的一種具有特殊的芳香氣味的次級代謝產(chǎn)物。植物精油種類豐富，其含量較為豐富的植物類別有：傘形花科、唇形花科、菊科、蕓香科、柏科、木蘭科、樟科、姜科、桃金娘科、龍腦香科和禾本科等[5]。植物精油所含成分復(fù)雜，按化學(xué)結(jié)構(gòu)又可以分為萜類、芳香族化合物、脂肪族化合物、含氮和含硫化合物四類[6]。

不同來源和成分的植物精油所具有的生物活性不盡相同，近來植物精油的抑菌防腐作用受到廣泛關(guān)注。大量研究表明，植物精油具有顯著的抑菌活性，能夠高效抑制諸如假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、芽孢桿菌等多種食品腐敗菌和致病菌[7]，延長食品保質(zhì)期，是極具潛力的天然防腐劑[8]。然而，大部分植物精油在常溫下呈油狀，水溶性極差；同時其揮發(fā)性強，一些精油中的含氮、含硫化合物具有強烈的刺激性氣味[9]，嚴重影響食品感官；另外，精油極易被氧化，光、熱等環(huán)境因子均可促使精油發(fā)生氧化、聚合等化學(xué)反應(yīng)，造成精油香氣質(zhì)量和生物活性的大幅下降[10-11]。

納米乳液是一種納米級包埋系統(tǒng)，能夠包埋各類天然活性成分，具有粒徑小、比表面積大、穩(wěn)定性好、分散均勻、生物活性高等特點，是目前解決植物精油應(yīng)用局限性的有效方式。研究表明，相較純精油，植物精油納米乳液能夠通過增強精油在食品基質(zhì)中的分散性和穩(wěn)定性進而增強其抗菌活性，同時減少對食品感官品質(zhì)的不良影響[12]。目前，植物精油納米乳液的抑菌保鮮作用已被大量研究證實[13-14]，在肉制品防腐保鮮領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。然而，植物精油納米乳液對于肉源有害細菌的抑制作用及相關(guān)機制尚缺乏系統(tǒng)總結(jié)分析。因此，本文將從植物精油納米乳液對肉源腐敗菌和致病菌的抑菌作用、影響因素和抑菌機制等方面進行綜述，以期為植物精油納米乳液在肉類防腐保鮮中的研究及開發(fā)利用提供理論參考。

1 植物精油納米乳液的構(gòu)建

植物精油納米乳液是由水相、油相和乳化劑按一定比例組成的大小均勻、透明、半透明或乳白色的膠體分散體系[15]。其粒徑大小一般為50～200 nm[16]，也有部分文獻定義為50～500 nm[17]。

納米乳液可以通過多種方式構(gòu)建，通?？煞譃楦吣苋榛ê偷湍苋榛?。高能乳化方式主要包括高壓均質(zhì)法、超聲乳化法、微射流法、膜乳化法和微孔道乳化法等[18]，其是通過高壓設(shè)備輸入能量獲得納米乳液，制備過程可控，操作便捷，是目前制備植物精油納米乳液的常用實驗方法。然而高能乳化法往往需要較為昂貴的專業(yè)設(shè)備，較高的成本與冷卻問題限制了其工業(yè)化和規(guī)?；瘧?yīng)用。低能乳化法可分為自乳化法和相轉(zhuǎn)化（相轉(zhuǎn)化溫度和相轉(zhuǎn)化成分）法等[19]。該類方法相比高能法更節(jié)約成本，乳液更均一，但多適用于低黏度油相和小分子表面活性劑，且所需表面活性劑也較多，可能存在食品安全隱患和異味問題，另外，由于低能乳化是在熱力學(xué)驅(qū)動下完成的，更易受外界溫度、壓力和攪拌等熱力學(xué)參數(shù)的影響。

在納米乳液構(gòu)建過程中，油相和水相是兩種互不相溶的相，因而乳化劑作為中間相，是乳液的重要組成部分。乳化劑能夠降低水油界面的張力，防止顆粒聚集、沉降、絮凝、奧氏熟化等現(xiàn)象，促進納米乳液的形成并提高其穩(wěn)定性。常用乳化劑包括合成乳化劑和天然乳化劑兩種。在食品行業(yè)中，使用最廣泛的合成類乳化劑主要有吐溫、司盤等小分子表面活性劑及聚丙烯酰胺、聚甘油酯等[20]。天然乳化劑按其成分可分為多糖類乳化劑（如阿拉伯樹膠、黃蓍膠、果膠、大豆多糖、改性淀粉等）、蛋白類乳化劑（如明膠、乳清蛋白、乳鐵蛋白、豌豆蛋白、酪蛋白等）以及磷脂乳化劑（如卵磷脂、大豆磷脂等）[21-22]。然而，合成乳化劑對人體健康可能存在潛在隱患。因此，在實際食品工業(yè)中更傾向于天然乳劑的研究與應(yīng)用。

2 植物精油納米乳液的基本特性

植物精油納米乳液通常具有良好的穩(wěn)定性。一方面，納米乳液的粒徑較小，微小的液滴能夠通過布朗運動克服重力作用，因而不易發(fā)生聚集、絮凝、沉淀等不利變化[23]。另一方面，包埋在乳液系統(tǒng)內(nèi)部的植物精油受外界因素（如光、熱、氧氣、pH 等）的影響也較小，相比游離的純精油而言具有更強的穩(wěn)定性。Kreutz 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，卡尼里拉精油在納米乳液體系中的穩(wěn)定性優(yōu)于甲醇溶液體系，經(jīng)光處理和熱處理后，納米乳液中精油主要化合物的保留率更高。

植物精油納米乳液的穩(wěn)定性受到多種因素的影響。就納米乳液自身而言，其穩(wěn)定性與表面活性劑、乳化方式（平均粒徑、PDI）和Zeta 電位等有關(guān)[25]。粒徑越小，乳液越穩(wěn)定；PDI＜0.2、凈電位值＞30 mV，乳液穩(wěn)定性越高[26]。粗乳液受到的作用力越大，得到的納米乳液粒徑越小越均一，乳液越穩(wěn)定；一定范圍內(nèi)納米乳液的粒徑隨著乳化劑含量的升高和精油含量的降低而趨于更小和更穩(wěn)定[27]；隨貯藏時間的延長，乳液穩(wěn)定性逐漸下降[28]。就外界因素而言，納米乳液受到pH、離子強度、凍融、溫度等的影響。研究表明，納米乳液在pH 為7～10 范圍內(nèi)乳液相對穩(wěn)定；在一定范圍內(nèi)（-2～+3 價）隨離子強度的增加，乳液穩(wěn)定性降低，且一價陽離子對乳液穩(wěn)定性的影響顯著弱于二價陽離子；凍融后納米乳液的平均粒徑增大，乳液穩(wěn)定性降低[29]。因此，可以過調(diào)控其組分（如油、水相）和微觀結(jié)構(gòu)（如粒徑大?。蚣尤肽承┓€(wěn)定劑（如乳化劑、品質(zhì)改良劑或緩凝劑）等方法來進一步提高納米乳液的穩(wěn)定性。

植物精油納米乳液還可在一定程度上提高植物精油的生物利用率。植物精油的不穩(wěn)定性是導(dǎo)致生物利用率降低的主要原因，而納米乳液可以提高精油在體系中的分散性、生物可及率和機體對植物精油的吸收能力來提高植物精油的生物利用率[17]。納米乳液的理化特性和組成對植物精油的生物利用率有顯著影響：當(dāng)精油包埋在納米乳液中時，其生物利用率隨乳液粒徑的減小而增加[30]；乳化劑的不同也會影響生物利用率，其效果大小依次為：非離子型表面活性劑＞磷脂酰膽堿＞蛋白，且隨分子多分枝結(jié)構(gòu)和分散密度的降低生物利用率逐漸增加；還可通過調(diào)控乳液的成分來改變液滴間的聚集狀態(tài)，從而改變精油活性成分的利用率[31]。

3 植物精油納米乳液對肉源腐敗菌和致病菌的抑菌作用及其影響因素

3.1 抑菌作用

植物精油納米乳液中含有抑菌的植物精油，因而其對多種肉源有害細菌均具有一定抑制作用。研究表明，在培養(yǎng)基體系中，佛手精油納米乳液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為3.125、6.25、12.5 mg/mL[32]；鼠尾草精油納米乳液在濃度為6.25 mg/mL 時可抑制假單胞菌、液化沙雷氏菌、肺炎雷克伯菌和甲型副傷寒沙門氏菌的生長，濃度為12.5 mg/mL 時可抑制大腸桿菌、奇異變形桿菌和糞腸球菌的生長[33]；檸檬精油納米乳液在濃度為6.25 mg/mL 時可抑制肺炎克雷伯菌、液化沙雷氏菌和黃綠假單胞菌的生長，濃度為12.5 mg/mL 時可抑制甲型副傷寒沙門氏菌和糞腸球菌的生長[34]?？梢?，植物精油納米乳液能夠有效抑制多種肉源腐敗菌和致病菌的生長，但不同植物精油納米乳液對不同細菌的抑菌能力有顯著差異。同時，現(xiàn)有研究多集中在植物精油納米乳液對致病菌的防控研究上，而對肉源腐敗菌的關(guān)注較少。鑒于肉源腐敗菌種類繁多，組成復(fù)雜，防控難度大，因而亟需加強植物精油納米乳液對腐敗菌的研究。

在肉制品中，植物精油納米乳液亦可顯著抑制細菌生長，延長保質(zhì)期。Sun 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，茴香精油/肉桂醛可食性納米乳液可有效抑制豬肉餅中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，使保質(zhì)期從6 d 延長到10 d，另外納米乳液處理組菌落總數(shù)在第12 d 時僅為4.85 lg（CFU/g），顯著低于對照組5.79 lg（CFU/g）。王婧[36]研究發(fā)現(xiàn)，氯代肉桂醛納米乳可抑制低溫冷藏保鮮草魚片中微生物的繁殖，延長貨架期，對照組在第4 d 時菌落總數(shù)已超標(biāo)（6.88 lg（CFU/g）），而納米乳處理組菌落總數(shù)在第6 d 時才超標(biāo)（6.1 lg（CFU/g））。郗澤文[37]用檸檬精油納米乳液制備可食性涂膜用于鹵鴨脖的保鮮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品保質(zhì)期從8 d 延長至12 d，且對照組菌落總數(shù)在第8 d 時達到4.91 lg（CFU/g），超過國家標(biāo)準(zhǔn)（4.903 lg（CFU/g）），而處理組菌落總數(shù)在第12 d 時為4.85 lg（CFU/g），仍未超標(biāo)。由此可見，植物精油納米乳液在肉及肉制品中均具有良好的保鮮效果和開發(fā)應(yīng)用潛力。

3.2 影響因素

植物精油在納米乳液中能夠以微小粒子形式存在，比表面積顯著提高，因而其抑菌效力也發(fā)生一定改變。大部分研究者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過納米乳化后，植物精油的抑菌活性顯著高于純精油。例如，王雪薇等[38]研究表明，與純精油相比，黑皮油松松針精油納米乳液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強。邱亦亦[39]對昆侖雪菊油樹脂的研究表明，經(jīng)納米乳化后的油樹脂與純樹脂精油相比，納米乳液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強。然而，也有一些研究者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過乳化后，精油的抑菌活性出現(xiàn)不變或下降的結(jié)果。Mansouri 等[40]發(fā)現(xiàn)，百里香精油經(jīng)吐溫80 乳化后，其對鼠傷沙門氏菌、大腸埃希氏菌和單增李斯特菌的抑菌活性低于純精油；Mendes等[41]也發(fā)現(xiàn)，紫葉精油納米乳液對假單胞菌的抑菌活性顯著低于純精油。納米乳化包埋技術(shù)雖可以在一定程度上改變植物精油的抑菌能力，但對其具體的影響因素目前尚無準(zhǔn)確定論。

就納米乳液自身而言，精油種類、乳化方式、乳化劑、乳液粒徑等是影響植物精油納米乳化前后抑菌活性變化的重要因素（表1）。a.精油種類。在相同的乳化劑（吐溫80）和超聲乳化方式下，百里香精油[42]、鼠尾草精油[33]、月桂精油[43]的納米乳液對創(chuàng)傷弧菌的抑菌活性低于純精油，而檸檬精油納米乳液[34]對創(chuàng)傷弧菌的抑菌活性則高于純精油。b.乳化方式。以辛烯基琥珀酸淀粉鈉為乳化劑，利用高壓均質(zhì)法[44]制備的肉桂精油納米乳液，其對大腸桿菌的抑菌活性相比純精油無顯著變化，而利用高頻超聲法[45]和超聲均質(zhì)法[46]制備的肉桂納米乳液，其對大腸桿菌活性相較于純精油明顯升高。c.乳化劑。Donsì等[47]分別以棕櫚油和吐溫20 為乳化劑，經(jīng)高壓均質(zhì)法制備檸檬烯納米乳液，研究發(fā)現(xiàn)，以棕櫚油為乳化劑制備的納米乳液對大腸桿菌的抑菌活性相較于純檸檬烯沒有變化，而以吐溫20 為乳化劑制備的納米乳液相較于純檸檬烯對大腸桿菌的抑菌活性升高。d.乳液粒徑。Liu 等[48]利用超聲波乳化技術(shù)制備不同粒徑的大蒜精油納米乳液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著納米乳液粒徑的減?。?20.3→215.0 nm），其抑菌活性顯著增強。Gahruie 等[49]也發(fā)現(xiàn)，隨著納米乳液粒徑的減?。?10.5→90.9 nm），花澤蘭精油納米乳液制備的可食性薄膜抑菌活性顯著增加。

表1 植物精油納米乳化前后抑菌活性的變化Table 1 Changes in bacteriostatic activity of plant essential oils before and after nanoemulsification

另外，微生物種類的不同也會使精油納米乳液的抑菌活性表現(xiàn)出較大差異。例如，百里香精油經(jīng)納米乳化后，其對金黃色葡萄球菌、丹澤氏梭菌、液化沙雷氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌的抑菌活性高于純精油，但對糞腸球菌、創(chuàng)傷弧菌、奇異變形桿菌、黃體假單胞菌的抑菌活性低于純精油[40]。鼠尾草精油和檸檬精油也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[33-34]。鑒于以上差異，在實際應(yīng)用中應(yīng)針對具體的微生物種類，選用適當(dāng)?shù)闹参锞图{米乳液，以達到最佳抑制效果。同時，盡管植物精油納米乳液抑菌活性的影響因素已有大量研究報道，但是納米乳化調(diào)控精油抑菌活性的關(guān)鍵因素尚不明確，還需進一步研究。

4 植物精油納米乳液的抑菌機制

4.1 植物精油的抑菌機制

植物精油具有廣譜抗菌作用，其抑菌機制已得到大量研究。目前研究者認為，植物精油抑菌的主要作用靶點是微生物的細胞膜，其通過破壞細胞膜的磷脂雙分子層，增加膜的通透性，誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)坍塌、功能紊亂，進而造成胞內(nèi)重要物質(zhì)的泄漏，最終導(dǎo)致菌體的死亡[52]。同時，精油在進入菌體內(nèi)部后，還能夠產(chǎn)生以下影響，如降低ATP 的合成，影響菌體的能量代謝；誘導(dǎo)細菌蛋白質(zhì)和核酸的正常合成和代謝；造成氨基酸代謝紊亂等[53-55]，具體如圖1 所示。

圖1 植物精油及其納米乳液的抑菌機制圖Fig.1 Antibacterial mechanism of plant essential oils and their nanoemulsions

4.2 植物精油納米乳液的抑菌機制

植物精油納米乳液中含有精油成分，因而其能夠通過與純精油相似的作用機制發(fā)揮抑菌活性。如茶皂素基香芹酚乳液可使微生物細胞膜的完整性被破壞，細胞內(nèi)電解質(zhì)離子和蛋白質(zhì)的流出，改變細胞膜的通透性，致使細胞死亡[56]；檸檬精油納米乳液可顯著破壞菌體形態(tài)，損傷細胞膜，使細胞壁溶解和缺失，細胞內(nèi)環(huán)境被破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、K+等內(nèi)溶物大量泄露，致使細胞死亡[57]。納米包埋后的植物精油進入細胞后可使胞內(nèi)的氨基酸代謝、嘌呤代謝、氨基糖代謝、嘧啶代謝等代謝通路發(fā)生改變；還可抑制細胞能量代謝，降低能量代謝過程中關(guān)鍵調(diào)解酶的活性；降解核糖體、膜受體及能量代謝從而使得相關(guān)調(diào)控基因發(fā)生變化[58-59]。

然而相比純精油，植物精油納米乳液對菌體細胞膜的破壞作用又存在顯著不同。植物精油納米乳液具有液滴粒徑小，比表面積大、穩(wěn)定性好等特點，對微生物作用時靶向性更強，更易附著在微生物表面，因而對微生物的抑制效果更加顯著。劉如楠等[60]研究發(fā)現(xiàn)，褚橙精油納米乳液抗菌活性高于純精油的原因是納米乳液中的小脂質(zhì)顆粒能夠?qū)⒏嗟木蛶У轿⑸锛毎け砻?，而純精油水溶性低，由于疏水作用，不易與細胞膜發(fā)生靶向作用。王雪薇[61]研究表明，黑皮油松松針精油納米乳液較純精油抑菌活性升高，其機理為以細菌的細胞膜為目標(biāo)，納米乳液通過與細胞膜的靶向作用，使細菌的親水性增強，導(dǎo)致細胞死亡。Li 等[62]認為，精油納米乳液與微生物細胞膜的磷脂雙分子層間的吸附促進了精油在所需位點的靶向釋放；Chang 等[63]認為，帶正電的納米乳液液滴與帶負電的微生物細胞壁間的靜電相互作用增加了作用部位的精油濃度。除此之外，Donsì等[64]認為，在油水相的雙重驅(qū)動下，納米乳液包埋的精油隨釋放時間的增加，延長了油水相間精油的生物活性；Moghimi 等[65]認為，精油納米乳液表面積的增大提高了細胞膜的被動運輸，提高微生物細胞的可及性?？梢?，植物精油納米乳液的靶向結(jié)合、持續(xù)釋放、被動運輸?shù)仁瞧浒l(fā)揮抑菌作用的重要途徑（圖1），但相關(guān)機制仍有待進一步闡明。

上述研究表明，納米乳液的包埋有助于植物精油中的活性成分進入菌體細胞內(nèi)，此外，還可增加植物精油在水介質(zhì)中的分散性和溶解性，從而使植物精油更加充分地與目標(biāo)微生物接觸，表現(xiàn)出更強的抑菌活性。

5 總結(jié)與展望

腐敗菌和致病菌是引起肉類食品保鮮和安全問題的重要因素。隨著人們對綠色、健康食品需求的提升，開發(fā)新型防腐保鮮劑已經(jīng)當(dāng)下的研究熱點。天然的植物精油具有廣譜抑菌作用，在肉制品防腐保鮮領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。經(jīng)納米乳液包埋后，植物精油的親水性和穩(wěn)定性均顯著提升，其生物利用率和抑菌活性也得到改善。植物精油納米乳液能夠有效抑制多種肉源腐敗菌和致病菌的生長，但其抑菌活性受到精油種類、乳化方式、乳化劑、乳液粒徑和微生物種類的顯著影響。相比純精油，植物精油納米乳液能夠通過靶向結(jié)合、持續(xù)釋放、被動運輸?shù)仍鰪姳话窬蛯w細胞的膜損傷作用及對胞內(nèi)重要代謝過程的干擾，最終促使菌體死亡。然而，目前植物精油納米乳液的研究與應(yīng)用仍存在一些局限性，包括以下幾個方面：a.植物精油納米乳液的抑菌活性研究多集中于肉源致病菌，對肉源腐敗菌的研究仍較為有限；b.納米乳化過程中，影響精油抑菌活性的關(guān)鍵因素尚不明確；c.植物精油納米乳液的抑菌機制仍未被充分闡明，目前對其抑菌機制的研究多停留在菌體細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，后續(xù)可從菌體內(nèi)部代謝和分子層面進行深入探究。同時，植物精油納米乳液的靶向結(jié)合、持續(xù)釋放、被動運輸?shù)仁瞧浒l(fā)揮抑菌作用的潛在重要途徑，但內(nèi)在機制仍有待進一步闡明；d.在實際應(yīng)用中，精油的添加限量很低，可通過探討幾種精油納米乳液的協(xié)同抑菌作用，或與其他物質(zhì)的協(xié)同作用進行改進，同時需綜合考量其對肉制品感官品質(zhì)的影響?？傊?，植物精油納米乳液作為新型高效的防腐劑在肉制品的高質(zhì)保鮮中仍存在巨大的潛力和挑戰(zhàn)。