解小芬，胡光線，潘 露，伍徐嫻，周 丹，陳九瓊，匡夢(mèng)嵐，葉 蘭，秦 臻, ，許鍵煒,

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)到2050 年，全球65 歲以上老年人口數(shù)量將增加21.5%[1]，達(dá)到15 億[2]。衰老是一種無法避免的自然現(xiàn)象，也是一個(gè)持續(xù)的生理過程，并且伴隨著細(xì)胞、組織和器官的物質(zhì)、形態(tài)改變和功能退化[3]。衰老會(huì)加劇許多與年齡有關(guān)的各種疾病的發(fā)生，包括神經(jīng)系統(tǒng)退行性變、心血管疾病等。雖然衰老不可逆轉(zhuǎn)，但可通過多種措施來延緩衰老，如食療、中藥干預(yù)、加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)等途徑[4-6]。進(jìn)入21 世紀(jì)后，隨著全球老齡化日趨嚴(yán)重，由衰老和衰老相關(guān)疾病引起的健康問題日益突出。因此，盡快闡明衰老的機(jī)制，探尋有效的抗衰老藥物，已成為刻不容緩的任務(wù)，有著重大的社會(huì)意義。

黃精是百合科植物多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）、黃精（Polygonatum sibiricumRed.）或滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）的干燥根莖，被收載于2020 版中國(guó)藥典。黃精是一種傳統(tǒng)經(jīng)典的藥食兩用植物，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、益腎、健脾、潤(rùn)肺的功效[7]。其口感好，具有甜味和香味，可長(zhǎng)期大量食用。黃精作為藥物或膳食補(bǔ)充劑的應(yīng)用歷史可以追溯到2000 多年前，當(dāng)時(shí)它被記錄在漢末的《名醫(yī)別錄》一書中[8-9]。現(xiàn)代研究表明黃精具有多種活性成分，包括黃精多糖、薯蕷皂苷元、凝集素和高異黃烷酮等化合物[10-12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃精在抗菌、抗糖尿病、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、抗衰老等方面具有廣泛的藥理作用[13-15]。目前僅有的研究報(bào)道黃精具有延緩大腦衰老的作用?？赏ㄟ^清除自由基、減少Aβ的聚集、逆轉(zhuǎn)突觸結(jié)構(gòu)改變、加速神經(jīng)元的損傷修復(fù)與再生、改善學(xué)習(xí)記憶能力等來改善大腦衰老[16-19]。本課題組前期研究表明，黃精可通過提高端粒酶活性，降低細(xì)胞ROS 水平，減輕細(xì)胞氧化損傷來保護(hù)衰老大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPCs）的功能[20-21]。但未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究黃精對(duì)衰老小鼠器官功能的影響及機(jī)制。

因此，本研究利用D-gal 誘導(dǎo)建立小鼠衰老模型，觀察黃精提取物對(duì)衰老模型小鼠重要器官的保護(hù)作用，并探討其抗衰老作用的分子機(jī)制，旨在為開發(fā)功能性食品和新型抗衰老及相關(guān)疾病的藥物提供新思路，同時(shí)促進(jìn)道地藥材黃精的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)昆明小鼠50 只 雌雄各半，8 周齡，體重20±2 g，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0010），飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房：室溫20～25 ℃，濕度30%～40%，光照明暗交替12 h，自由飲水，常規(guī)飼料喂養(yǎng)；黃精飲片（20062701） 貴州一品藥業(yè)連鎖有限公司；D-半乳糖（V900922-100 g）美國(guó)Sigma 公司；trizol 試劑（15596026-100 mL）美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（RR047A-100T, RR820A -200T）TaKaRa 公司；PCR 引物 Invtrogen 公司。

Hc3016r 高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Gscan20 數(shù)字病理切片掃描儀 日本Hamamatsu 有限公司；JC-FD200 金屬恒溫孵育器 德國(guó)Eppendorf 公司；CFX96熒光定量PCR 儀美國(guó)Bio-Rad 公司；TBAFX8 全自動(dòng)生化分析儀上海瑞美電腦科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃精提取物（PSE）的制備 取黃精飲片15 g，粉碎，過4 號(hào)篩；用95%的乙醇提取三次；每次按1:10 的比例，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為1 h；收集三次粗液，冷卻后過濾，濃縮至浸膏，制備得到PSE[22]。計(jì)算PSE 得率為23.48%，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS 鑒定PSE 成分為皂苷類。

1.2.2 分組、造模與治療 50 只小鼠隨機(jī)分為正常組（Control 組）、模型組（D-gal 組）、PSE 低劑量組（L-PSE 組）、PSE 中劑量組（M-PSE 組）、PSE 高劑量組（H-PSE 組）。本次研究造模方法參照文獻(xiàn)[23]，模型組、PSE 低、中、高劑量組小鼠頸背部皮下注射500 mg/ kg/d D-半乳糖構(gòu)造衰老模型，連續(xù)8 周。第4 周開始灌胃相應(yīng)劑量的PSE（低、中、高劑量組分別為0.5、1、2 g/kg），連續(xù)給藥四周，正常組皮下注射等量的生理鹽水作為對(duì)照，正常組與模型組灌胃生理鹽水。（皮下注射生理鹽水是與D-gal 對(duì)照，而灌胃生理鹽水是與給藥組進(jìn)行對(duì)照）。貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序（NO：2001976）。

1.2.3 血清樣本采集 小鼠禁食12 h，眼眶采血，3500 r/min 離心15 min，吸取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用全自?dòng)血液生化分析儀測(cè)定肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、尿素肌酐比值（BUN/Scr）、腎小球?yàn)V過率（eGFR）活性。

1.2.4 臟器指數(shù)的測(cè)定 小鼠禁食12 h，頸椎脫位處死小鼠，取出各組小鼠的肝、胸腺、脾臟、腎臟等組織，用生理鹽水清洗干凈臟器組織，稱取臟器組織重量。

1.2.5 組織病理學(xué)和纖維化分析 取小鼠皮膚、肝臟、腎臟、心臟、大腦等組織進(jìn)行HE 和Masson 染色，光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠以上組織病理學(xué)和纖維化變化。

1.2.6 Realtime-PCR 檢測(cè)大腦、肝臟、腎臟、心臟組織中p53、p16、p21、RB、HO-1、Nrf2、Keap1mRNA表達(dá)水平 取血后，頸椎脫位處死小鼠，取心臟，肝臟和腎臟和全腦組織。參照說明書用Trizol 法提取大腦、肝臟、腎臟、心臟總mRNA，用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。合成后，按照TB Green Premix Ex Taq[TM]試劑盒說明書依次添加試劑，再置于PCR 儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。分析PCR 反應(yīng)中各組樣本的Ct 值，并用2-△△Ct表示mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。p53、p16、p21、RB、HO-1、Nrf2、Keap1及內(nèi)參GAPDH序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of RT- PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD。使用SPSS26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行不同組間的比較，P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

免疫器官隨著衰老會(huì)導(dǎo)致免疫器官指數(shù)的降低，這通常被用作評(píng)估衰老小鼠模型成功的標(biāo)志。結(jié)果如表2 所示，8 周的D-gal 治療導(dǎo)致胸腺和脾臟指數(shù)降低（P＜0.01，P＜0.05），D-gal 組小鼠胸腺和脾臟萎縮, 說明造模成功。給予低中高劑量的PSE 治療則有所恢復(fù)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，L-PSE, M-PSE, HPSE 胸腺指數(shù)極顯著提高（P＜0.01），L-PSE 脾臟指數(shù)較模型組提高（P＜0.05），M-PSE, H-PSE 脾臟指數(shù)較模型組極顯著提高（P＜0.01），說明PSE 能延緩免疫器官衰老。肝、腎臟器指數(shù)的變化可體現(xiàn)肝臟和腎臟的衰老情況，一般機(jī)體正常時(shí)臟器指數(shù)比較恒定。當(dāng)機(jī)體受外界因素影響時(shí)，引起臟器受損，其質(zhì)量發(fā)生改變，故臟器指數(shù)也隨之而改變。肝、腎臟器指數(shù)減小，表明肝腎損傷及其他退行性改變[24-25]。與對(duì)照組相比, D-gal 組的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)極顯著降低（P＜0.01），說明連續(xù)8 周的D-gal 治療對(duì)小鼠肝臟和腎臟造成了損傷。低中高劑量的PSE 治療能升高肝臟和腎臟指數(shù)，L-PSE、M-PSE、H-PSE 肝臟指數(shù)與模型組比較有所提高（P＜0.05），L-PSE, M-PSE, HPSE 腎臟指數(shù)與模型組比較極顯著提高（P＜0.01），說明PSE 具有保護(hù)小鼠臟器損傷、延緩衰老的功能。

表2 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠臟器指數(shù)的影響（±SD，n=10）Table 2 Effect of PSE on organ index of aging mice induced by D-gal (±SD, n=10)

表2 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠臟器指數(shù)的影響（±SD，n=10）Table 2 Effect of PSE on organ index of aging mice induced by D-gal (±SD, n=10)

注：*與Control組相比差異顯著（P＜0.05）；**與Control組相比差異極顯著（P＜0.01）；#與D-gal組相比差異顯著（P＜0.05）；##與D-gal組相比，差異極顯著（P＜0.01）；表3～表4同。

腎臟指數(shù)（mg/g）Control 3.98±0.253.05±0.5361.19±2.6413.98±0.46 D-gal1.97±0.57**2.11±0.47*51.97±3.05**11.63±0.50**L-PSE 3.48±0.50##2.92±0.26#58.25±2.87#15.46±0.82##M-PSE 3.46±0.37##4.37±0.54##58.43±4.32#14.95±1.11##H-PSE 3.54±0.30##3.89±0.55##60.29±6.36#16.33±0.42##組別胸腺指數(shù)（mg/g）脾臟指數(shù)（mg/g）肝臟指數(shù)（mg/g）

2.2 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠生化指標(biāo)的影響

分析PSE 對(duì)衰老小鼠血清中心肌酶水平的影響，肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）可反應(yīng)心臟功能，是心肌壞死的指標(biāo)[26]。CK 是心肌組織損傷的敏感指標(biāo)之一，在心肌損傷期間呈上升趨勢(shì)，臨床上常作為急性心肌梗死的輔助診斷指標(biāo)[27]。CK 主要分布于心肌細(xì)胞中，當(dāng)心臟發(fā)生病理性損傷時(shí)，心肌細(xì)胞中的代謝酶會(huì)釋放入血，血清中CK 活性會(huì)迅速升高[28]。CK-MB 是CK 的一種同工酶，主要存在于心肌細(xì)胞中。其含量在常態(tài)下較低，然而當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷后，由于細(xì)胞和亞細(xì)胞室的解體而泄漏到細(xì)胞外液中，其水平會(huì)立即升高。是心肌損傷以及缺血壞死的早期標(biāo)志物，其水平越高則表示心肌損傷加重[29-30]。如表3，在模型組小鼠的血清中觀察到D-gal 處理導(dǎo)致CK、CK-MB 活性升高（P＜0.01），分別提高了170.54%、67.23%, 說明D-gal 治療損害了心臟功能。在本次研究中，用不同劑量PSE 治療可抑制血清中CK、CK-MB 活性升高（P＜0.01，P＜0.05），PSE 低、中、高劑量組CK 水平分別降低了66.67%、68.53%和68.70%；CK-MB 水平分別下降42.44%、48.35%和49.71%，表明PSE 對(duì)D-gal 誘導(dǎo)的心臟損傷具有保護(hù)作用。

表3 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠血清生化指標(biāo)的影響（±SD，n=10）Table 3 Effects of PSE on serum biochemical indexes in aging mice induced by D-gal (±SD, n=10)

表3 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠血清生化指標(biāo)的影響（±SD，n=10）Table 3 Effects of PSE on serum biochemical indexes in aging mice induced by D-gal (±SD, n=10)

組別心臟肝臟CK（U/L）CK-MB（U/L）ALP（U/L）AST（U/L）ALT（U/L）Control486.5±226185.67±28.3455.88±7.6463.29±8.9230.17±3.98 D-gal1316.17±221.58**310.50±45.55**84.57±13.03**88.57±10.76**38.83±2.54**L-PSE438.67±55.15##178.71±57.86#57.38±15.76#68.71±19.54#31.00±4.00#M-PSE414.17±142.46##160.38±23.45##53.25±15.01##67.43±12.83#28.33±6.77#H-PSE412±180.78##156.14±18.943##48.88±13.03##56.43±10.29##25.83±5.76##

血清中ALP、AST 和ALT 水平是評(píng)價(jià)肝損傷的重要指標(biāo)，連續(xù)8 周的D-gal 治療會(huì)導(dǎo)致肝功能障礙，引起血清中ALP、AST 和ALT 水平顯著升高[31-32]。ALT 和AST 是催化氨基酸和酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的酶，主要位于肝細(xì)胞。當(dāng)肝功能受損，例如葡萄糖和脂質(zhì)代謝異常時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，它們會(huì)釋放到血液中，導(dǎo)致血清中ALT 和AST 水平升高。因此，血清ALT 和AST 水平是評(píng)估肝功能的重要且敏感的生化指標(biāo)，可提示早期肝損傷，其異常升高可引起肝細(xì)胞損傷和壞死[33-34]。ALP 是一種酸性水解酶，廣泛存在于人體各組織細(xì)胞中，包括肝細(xì)胞。當(dāng)肝組織發(fā)生病變壞死時(shí)，病變周圍組織中肝細(xì)胞合成過度釋放引起ALP 排泄障礙，導(dǎo)致血清中ALP 含量增加。因此ALP 表達(dá)增多，提示機(jī)體肝臟功能受損[35]。如表3 所示，與Control 組相比，D-gal 組小鼠血清中ALP、AST 和ALT 水平顯著上升（P＜0.01），分別升高了51.34%、39.95%、28.72%，表明D-gal 誘導(dǎo)肝臟發(fā)生損傷。與模型組相比，PSE 低中高劑量組均能顯著降低小鼠血清中ALP、AST 和ALT 水平（P＜0.01，P＜0.05），L-PSE、M-PSE、H-PSE 組的ALP活性分別降低了32.16%、37.04% 和42.20%；AST活性分別降低了22.41%、23.87%和36.29%；ALT活性分別降低了20.17%、27.04% 和33.47%。結(jié)果表明PSE 對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，用D-gal 治療會(huì)導(dǎo)致腎臟損傷以及功能障礙，隨后血清酶的活性或水平升高[36]，UA、UREA、CREA、BUN/Scr、eGFR 通常被認(rèn)為是腎臟的關(guān)鍵損傷指標(biāo)，其水平可以評(píng)估衰老腎臟的功能性和器質(zhì)性損傷[37]。UREA 是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物，是由腎臟排泄，其含量的高低由蛋白質(zhì)的分解代謝與腎臟的排泄功能決定。在機(jī)體穩(wěn)定的情況下，UREA 和腎小球?yàn)V過率（eGFR）功能成反比關(guān)系,UREA 升高，則eGFR 降低，提示腎小球?yàn)V過功能減退[38]。血清UA 過度生成/或排泄不足導(dǎo)致血清UA過度積累可能會(huì)加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)而干擾腎功能[39]。CREA、BUN/Scr 水平明顯異常時(shí)，引起機(jī)體內(nèi)含氮化合物的代謝和腎小球?yàn)V過功能的異常改變，進(jìn)而導(dǎo)致腎功能異常[40]。如表4 所示，本研究表明，與對(duì)照組相比，D-gal 組小鼠的UA、UREA、CREA、BUN/Scr水平較高（P＜0.01，P＜0.05），eGFR 水平較低（P＜0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[41]。然而PSE 灌胃治療后小鼠血清中UA、UREA、CREA、BUN/Scr 水平降低（P＜0.01，P＜0.05），eGFR 水平升高（P＜0.05），表明PSE 對(duì)D-gal 誘導(dǎo)的腎損傷具有保護(hù)作用。

表4 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠血清生化指標(biāo)的影響（±SD，n=10）Table 4 Effects of PSE on serum biochemical indexes in aging mice induced by D-gal (±SD, n=10)

表4 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠血清生化指標(biāo)的影響（±SD，n=10）Table 4 Effects of PSE on serum biochemical indexes in aging mice induced by D-gal (±SD, n=10)

組別腎臟UA（mg/dL）UREA（mg/dL）CREA（mg/dL）eGFR（mg/dL）BUN/Scr（mg/dL）Control106.67±34.666.13±0.5211.92±1.33245.38±31.53121.88±8.91 D-gal167.5±17.52**7.50±0.94**13.90±0.37*236.88±6.28*150.50±18.85*L-PSE124.33±15.77#5.59±0.83##10.95±1.04#244.25±12.91#123.88±13.68#M-PSE116.67±16.39##5.54±0.88##10.77±1.50#244.25±11.21#120.63±13.31##H-PSE112.67±10.03##5.46±0.50##10.63±1.20##251.75±40.41#119.63±25.40##

2.3 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠臟器組織病理和膠原纖維的影響

2.3.1 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠皮膚組織病理和膠原纖維的影響 正常組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)正常完整，表皮厚度正常，皮脂腺副器官結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維束無明顯斷裂和溶解。D-gal 組的皮膚組織厚度不均勻，表皮缺失的部分明顯更薄，纖維組織排列紊亂，有明顯的碎裂。但是，在不同劑量PSE 治療的小鼠中，這些病理改變得到改善（圖1A）。膠原纖維（主要是膠原蛋白）是真皮的重要組成部分，隨著年齡的增長(zhǎng)，膠原纖維的含量會(huì)顯著下降[42]。Control 組膠原纖維排列整齊且膠原沉積面積大，連續(xù)8 周D-gal 治療導(dǎo)致膠原蛋白流失引起皮膚老化，不同劑量PSE 治療組膠原纖維排列整齊且膠原沉積面積較大（圖1B）。說明PSE 可減緩皮膚組織結(jié)構(gòu)的破壞，延緩皮膚組織衰老的進(jìn)程。

圖1 小鼠皮膚的 HE 染色和 Masson 染色結(jié)果Fig.1 HE staining and Masson staining results of mouse skin

2.3.2 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠肝臟組織病理和膠原纖維的影響 由結(jié)果（圖2A）可知，小鼠在給予Dgal 8 周后，其肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。采用不同劑量PSE 治療后，肝組織病理學(xué)改變得到恢復(fù)。此外，Masson 染色顯示D-gal 組肝臟組織纖維組織增生增加，纖維間隔形成；采用不同劑量PSE 治療后，肝組織纖維組織增生減?。▓D2B）。說明PSE 對(duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠肝損傷有一定保護(hù)作用。

圖2 小鼠肝臟的 HE 染色和 Masson 染色結(jié)果Fig.2 HE staining and Masson staining results of mouse liver

2.3.3 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠腎臟組織病理和膠原纖維的影響 由結(jié)果（圖3A）可知，Control 組中，腎臟無任何病理?yè)p傷變化。注射D-gal 可導(dǎo)致正常腎小球數(shù)量減少，腎小管硬化、萎縮、水腫、空泡變性和腎間質(zhì)纖維。經(jīng)過不同劑量PSE 治療，可減輕以上病理?yè)p傷。Control 組腎臟組織膠原沉積面積較??；而衰老模型組腎臟組織可見大量膠原纖維，膠原沉積面積大。經(jīng)過不同劑量PSE 治療，可減輕以上纖維化程度（圖3B）。說明PSE 對(duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠腎損傷有一定保護(hù)作用。

圖3 小鼠腎臟的 HE 染色和 Masson 染色結(jié)果Fig.3 HE staining and Masson staining results of mouse kidney

2.3.4 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠心臟組織病理和膠原纖維的影響 正常組心臟纖維排列整齊，無心臟纖維斷裂。D-gal 治療組心肌組織損傷嚴(yán)重，PSE 改善了心臟病理變化，表現(xiàn)為減少了肌纖維斷裂，核大小不規(guī)則減少，核碎裂減少，心肌細(xì)胞收縮和溶解減少（圖4A）。此外，Masson 染色顯示PSE 能減少老化心臟的膠原沉積和纖維化（圖4B）。說明PSE 對(duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠心臟損傷有一定保護(hù)作用。

圖4 小鼠心臟的 HE 染色和 Masson 染色結(jié)果Fig.4 HE staining and Masson staining results of mouse heart

2.3.5 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠肺組織病理和膠原纖維的影響 對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常。D-gal 注射8 周后，HE 和 Masson 染色顯示與對(duì)照組相比，Dgal 治療組肺泡壁明顯增厚，肺泡間隔塌陷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺結(jié)構(gòu)喪失和膠原蛋白沉積過多，而PSE 治療減輕了D-gal 引起的肺結(jié)構(gòu)損傷和膠原蛋白沉積（圖5）。說明PSE 對(duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠肺損傷有一定保護(hù)作用。

圖5 小鼠肺的 HE 染色和 Masson 染色結(jié)果Fig.5 HE staining and Masson staining results of mouse lung

2.3.6 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠大腦組織病理的影響 對(duì)照組椎體細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯病理改變。D-gal 組錐體細(xì)胞染色濃密，胞漿稀少，呈不規(guī)則三角形，形狀不規(guī)則，核深染，胞漿嗜酸性到空泡化。采用不同劑量PSE 治療后，少部分錐體細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，其余細(xì)胞保持正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)均勻，核仁明顯，空泡化少見（圖6）。說明PSE 對(duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠腦損傷有一定保護(hù)作用。

圖6 小鼠大腦的 HE 染色結(jié)果（40×）Fig.6 HE staining results of mouse brain (40×)

2.4 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠重要臟器組織衰老相關(guān)基因的影響

p53/p21和p16-RB兩條信號(hào)通路與細(xì)胞和組織衰老關(guān)系密切。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞受到刺激后誘導(dǎo)DNA 損傷，使p53上調(diào)，活化的p53誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的上調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期阻遏物（CDK6，CDK4，cyclinD1）的激活，導(dǎo)致去磷酸化和細(xì)胞周期抑制因子視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）的激活，這與細(xì)胞周期停滯引發(fā)的細(xì)胞衰老密切相關(guān)[43-44]。同時(shí)D-半乳糖引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致小鼠體內(nèi)發(fā)生DNA 損傷，從而使p16上調(diào)，被上調(diào)的p16與細(xì)胞周期阻遏物（CDK6，CDK4,cyclinD1）結(jié)合后去抑制RB的磷酸化，從而引起細(xì)胞衰老[45-46]。結(jié)果顯示：與Control 組相比，衰老模型組小鼠肝臟、大腦、腎臟、心臟組織中p53、p16、p21和RBmRNA均增加（P＜0.05，P＜0.01），不同劑量組PSE 治療均抑制了大腦、肝臟、腎臟、心臟組織中p53、p16、p21和RB水平的升高（圖7），其中L-PSE 組大腦組織中p16、p21無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），H-PSE 組大腦組織中p53、p16、p21和RB極顯著降低（P＜0.01）（圖7A）。而在肝臟、腎臟、心臟組織中PSE 三個(gè)劑量組與模型組相比，p53、p16、p21和RB均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。其原因有可能是PSE 對(duì)不同的組織器官具有劑量差異。以上結(jié)果說明PSE 可能通過抑制p53-p21和p16-RB信號(hào)通路的活化，進(jìn)而發(fā)揮其抗衰老和多組織保護(hù)作用。

圖7 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of PSE on the expression of aging related genes in D-gal-induced aging mice

2.5 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠重要臟器組織氧化應(yīng)激相關(guān)基因的影響

研究證明Keap1/Nrf2/HO-1是防止細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要抗氧化途徑之一[47-48]。在正常細(xì)胞中，Nrf2以二聚體的形式與Keap1結(jié)合并且處于低水平狀態(tài)，從而使Nrf2發(fā)生泛素化并被其蛋白酶降解[49]。連續(xù)8 周給小鼠皮下注射D-gal，使小鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，導(dǎo)致磷酸化的Nrf2從Keap1中釋放出來并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核發(fā)揮其功能，最終刺激HO-1活性[50]。本研究結(jié)果表明，與Control 組相比，D-gal 組小鼠心臟組織中Nrf2和HO-1mRNA 降低（P＜0.05），大腦、肝臟、腎臟組織中Nrf2和HO-1mRNA 顯著降低（P＜0.01），大腦組織中Keap1mRNA 顯著升高（P＜0.01），心臟、肝臟、腎臟組織中Keap1mRNA 升高（P＜0.05）。與D-gal 組相比，L-PSE、M-PSE、HPSE 組大腦、肝臟、心臟組織中Keap1mRNA 降低（P＜0.05），Nrf2和HO-1mRNA 升高（P＜0.05），LPSE、M-PSE、H-PSE 組腎臟組織中Keap1mRNA顯著降低（P＜0.01），HO-1mRNA 升高（P＜0.05），Nrf2mRNA 顯著升高（P＜0.01）（圖8）。說明PSE 可能通過激活Keap1-Nrf2-HO-1通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和多組織保護(hù)作用。

圖8 PSE 對(duì)D-gal 致衰老小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effects of PSE on the expression of oxidative stress related genes in D-gal-induced aging mice

3 結(jié)論

本研究利用D-gal 誘導(dǎo)構(gòu)建衰老小鼠模型來研究PSE 抗衰老和對(duì)組織器官的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PSE 可以有效提高衰老模型小鼠肝、腎臟、胸腺、脾臟組織的臟器指數(shù)，還可以有效降低衰老小鼠血清中CK、CK-MB、ALP、AST、ALT、UA、UREA、CREA、BUN/Scr 活性，提高血清中eGFR含量。同時(shí)，PSE 使衰老小鼠的腎臟、肝臟、皮膚、肺、心臟和大腦等組織的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)功能得到明顯改善。這些結(jié)果表明，PSE 能夠有效緩解和改善小鼠衰老。作用機(jī)制研究結(jié)果表明，PSE 可通過降低衰老基因p53、p21、p16、RB和Keap-1 以及增加抗氧化因子Nrf2、HO-1 的表達(dá)，減輕D-gal 所致衰老小鼠多器官損傷，從而達(dá)到抗衰老和多組織保護(hù)作用。綜上所述，本研究報(bào)道了PSE 對(duì)D-gal 誘導(dǎo)的多器官衰老和損傷的有益作用，從而為進(jìn)一步開發(fā)抗衰老及改善多器官功能的藥物和保健食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。但PSE 中發(fā)揮抗衰老和多組織保護(hù)作用的具體物質(zhì)基礎(chǔ)還不明確，還需進(jìn)一步深入研究。