張孟雨，彭嘉屹，韋錦源，楊靜賢，鐘青萍

（廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

食源性致病菌（foodborne pathogen）是指以食物為載體而導(dǎo)致人類發(fā)生疾病的一大類細(xì)菌，包括致病性大腸桿菌、沙門氏菌、致病性金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌等。近年來，國(guó)內(nèi)外食源性致病菌引起的食源性疾病事件層出不窮，引起了各界廣泛關(guān)注。常規(guī)的食源性致病菌檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)法和化學(xué)分析法（如化學(xué)發(fā)光分析法和化學(xué)傳感器法）等[1]，傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，使用較廣，但操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度較低[2]；化學(xué)分析法需要高純度樣品，輕微污染將導(dǎo)致假陽性結(jié)果[3]。隨著科技的發(fā)展，許多相對(duì)較新的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如分子生物學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)、生物傳感器檢測(cè)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法等，這些技術(shù)具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度較高和快速等優(yōu)勢(shì)，但由于通常需要較昂貴的儀器，前處理過程也比較復(fù)雜，因此大多無法滿足實(shí)時(shí)快速和便攜化檢測(cè)的要求[4]。近年來，一種基于微芯片的高通量檢測(cè)篩選技術(shù)—微流控技術(shù)發(fā)展起來。

微流控技術(shù)是目前發(fā)展迅猛的新興技術(shù)，又名芯片實(shí)驗(yàn)室（lab-on-a-chip），主要是依托微電子技術(shù)[5]，采用特殊工藝，將生化領(lǐng)域所涉及到的多種分析程序集成到單一平臺(tái)-芯片上[6]，將樣品處理、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等與分析相關(guān)的基本操作單元集成在一起，利用其微型、耗樣量少、快速分析、靈敏度和分辨率高等顯著優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)快速高效、小型化、集成化的檢測(cè)[7]，迅速成為當(dāng)前分析領(lǐng)域的焦點(diǎn)。將微流控技術(shù)與數(shù)字化核酸擴(kuò)增相結(jié)合應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)，進(jìn)一步提升了檢測(cè)性能與水平，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本文介紹了液滴微流控技術(shù)的原理、芯片材料和應(yīng)用范圍，重點(diǎn)對(duì)液滴微流控技術(shù)結(jié)合三種數(shù)字化核酸擴(kuò)增方式的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析總結(jié)，展望了其發(fā)展前景和在應(yīng)用中存在的問題，為液滴微流控?cái)?shù)字化核酸擴(kuò)增技術(shù)的進(jìn)一步普及和應(yīng)用提供借鑒。

1 液滴微流控芯片技術(shù)

1.1 概述

隨著現(xiàn)代科技發(fā)展越來越趨向于微型化和集成化，微流控技術(shù)也逐漸走入大家視野，甚至被美國(guó)Business 2.0 雜志封面列為“改變世界的七種技術(shù)之一”[8]。上世紀(jì)90 年代，Manz 等[9]最早提出了微流控芯片的概念，從2001 年至今，微流控技術(shù)得到了廣泛的關(guān)注和長(zhǎng)足發(fā)展。

近些年來，在微流控芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來了一種利用微量液體作為微反應(yīng)器的技術(shù)—液滴微流控技術(shù)，該技術(shù)以連續(xù)液滴進(jìn)樣為特征，是芯片實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域的一個(gè)重要分支。液滴微流控技術(shù)主要包括液滴產(chǎn)生、液滴分散、液滴融合，在極小的體系中實(shí)現(xiàn)高通量的分析，并探索大量小至納升體積液滴的合成條件[10]。數(shù)字微流控技術(shù)和連續(xù)微流控技術(shù)是目前液滴微流控技術(shù)的兩個(gè)分支[11]。連續(xù)微流控以低雷諾數(shù)流態(tài)為特點(diǎn)，兩互不相溶的流體在結(jié)構(gòu)化的微通道中混合和輸送，基本上所有流體都是層流；數(shù)字微流控技術(shù)是利用電壓對(duì)圖案化電極陣列中的微小液滴進(jìn)行操控[12]。液滴微流控技術(shù)結(jié)合微流控和液滴的特點(diǎn)，具有體積微小、反應(yīng)快速、節(jié)省試劑、防止污染等優(yōu)點(diǎn)。

液滴微流控技術(shù)因其自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在DNA 的提取和純化、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)集成全自動(dòng)芯片的發(fā)展和應(yīng)用、DNA 測(cè)序的集成式發(fā)展等方面，液滴微流控技術(shù)都顯示了卓越的性能和優(yōu)勢(shì)[13]。在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，利用微流控芯片自動(dòng)快速的提取蛋白質(zhì)，提高了檢測(cè)靈敏度和集成程度。在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面[14]，液滴數(shù)字微流控技術(shù)可在很大程度上克服傳統(tǒng)分析的長(zhǎng)耗時(shí)、高成本、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。在細(xì)胞分析方面[15]，液滴數(shù)字微流控技術(shù)可進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，在一個(gè)設(shè)備上完成細(xì)胞的培養(yǎng)和分析等過程。

1.2 基本原理

微流控技術(shù)主要利用微電子加工技術(shù)，通過設(shè)計(jì)微通道，利用電場(chǎng)或磁場(chǎng)結(jié)合各種微流控器件來控制流體，使其能夠流通于微流控系統(tǒng)中的微通道網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而在芯片上將各個(gè)反應(yīng)操作單元集成，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程的一體化和自動(dòng)化[16]。與此同時(shí)，還可以加快反應(yīng)速度、提高反應(yīng)效率、降低反應(yīng)成本，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的可控性[17]。

液滴微流控技術(shù)的基本原理是利用不相溶兩個(gè)流動(dòng)相碰撞接觸形成乳化液滴，在液滴內(nèi)部依靠湍流實(shí)現(xiàn)不同試劑之間的充分混合，通過獨(dú)立控制每個(gè)液滴，形成可以單獨(dú)反應(yīng)、混合和分析的微反應(yīng)器，避免彌散現(xiàn)象發(fā)生[6]。液滴的生成是通過芯片的幾何結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的，主要有T 型結(jié)構(gòu)、流動(dòng)聚集結(jié)構(gòu)和共軸流聚焦結(jié)構(gòu)等（圖1a）。如圖1b 所示，當(dāng)油相與水相按照合適比例和速率進(jìn)行混合進(jìn)樣時(shí)，在T 形交叉口可以形成連續(xù)穩(wěn)定液滴，當(dāng)液滴經(jīng)過S 形通道時(shí)，樣品中各組分得以混合均勻[7]。以液滴作為微反應(yīng)器，具有體積小、反應(yīng)條件穩(wěn)定、混合迅速且均勻、防止樣品擴(kuò)散和交叉污染等優(yōu)點(diǎn)。并且此技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)形成多個(gè)相同的微反應(yīng)器單元，因此可以很容易地實(shí)現(xiàn)并行處理和實(shí)驗(yàn)，從而有效地獲得大數(shù)據(jù)集[18-19]。

1.3 芯片的制備及其集成化

微流控技術(shù)的核心是芯片，芯片材料的選擇十分關(guān)鍵，一般常用的材料有玻璃、石英、單晶硅片以及包含聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）、聚碳酸酯（polycarbonate，PC）和聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）在內(nèi)的有機(jī)聚合物。目前研究熱點(diǎn)是紙質(zhì)芯片，主要是應(yīng)用3D 和2D 技術(shù)，利用紙張纖維素為基質(zhì)材料制備微流控芯片[20]。李露等[21]系統(tǒng)論述了微流控紙基芯片的制備方法和其中流體智能化操縱技術(shù)，以及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用和前景。而在食源性致病菌快速檢測(cè)上常用的芯片材料有硅、聚二甲基硅氧烷和聚甲基丙烯酸甲酯。這三種材料具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：制備較為簡(jiǎn)單，工藝相對(duì)成熟，無毒，成本較低。

芯片制備是微流控技術(shù)的基礎(chǔ)，即在芯片材料上利用微細(xì)加工技術(shù)構(gòu)建通道和相應(yīng)組件，微細(xì)加工技術(shù)主要有光刻和蝕刻技術(shù)，工藝流程一般包括預(yù)處理、涂膠、前烘、曝光、顯影、腐蝕和去膠等。不同類型的芯片制備在具體工藝流程上可根據(jù)實(shí)際情況有所增減。微細(xì)加工技術(shù)成本低，工藝較為簡(jiǎn)單，密封的芯片可以在很大程度上減少污染和損失，因此應(yīng)用較為廣泛。

微流控芯片的作用是將分析實(shí)驗(yàn)室中包括取樣、進(jìn)樣、預(yù)處理、反應(yīng)、分離和檢測(cè)在內(nèi)的所有操作集成在一個(gè)芯片上[22]，目前一些微流控芯片仍需外源驅(qū)動(dòng)裝置或檢測(cè)儀器，未能實(shí)現(xiàn)高度集成化，沒有實(shí)現(xiàn)真正意義上的Lab-on-a-chip[23]。為滿足便攜、集成化和自動(dòng)化程度高的微流控芯片發(fā)展要求，許多學(xué)者對(duì)此做出研究，周文超[24]針對(duì)微流控芯片高靈敏度光學(xué)檢測(cè)及其系統(tǒng)集成化進(jìn)行相關(guān)研究，設(shè)計(jì)了一種新型濾光片，實(shí)現(xiàn)光學(xué)檢測(cè)器件在微流控芯片上的陣列化和集成化，并基于導(dǎo)模共振原理提出一種可以進(jìn)一步提高光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)與微流控芯片的集成度的新型結(jié)構(gòu)。陳琛[25]為將核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)整合在同一塊芯片上，擺脫對(duì)泵和注射器等額外裝置的依賴，設(shè)計(jì)了一種紙-聚二甲基硅氧烷（PDMS）雜合芯片，這種基于膠體金試紙條的核酸檢測(cè)紙芯片，利用比色方法即可裸眼觀察擴(kuò)增結(jié)果，整個(gè)芯片具有采樣-反饋的完整功能。鄒晶晶等[26]設(shè)計(jì)和制作了一種集成式微流控芯片，可將基于液滴的核酸提取、樣本分散以及核酸等溫?cái)U(kuò)增等過程集成于一個(gè)芯片上，實(shí)現(xiàn)從樣品輸入到結(jié)果輸出的全流程檢測(cè)。隨著微流控芯片的普及和深入研究，其必然朝著微型化、集成化與便攜化的趨勢(shì)發(fā)展。

2 液滴微流控結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)

為防止待檢樣品中核酸含量低而無法被特異性檢出，一般檢測(cè)過程需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）等變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Recombinase polymerase amplification，RPA）、滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）、解旋酶依賴擴(kuò)增（Helicase-dependent amplification，HDA）和核酸序列依賴擴(kuò)增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）等[27]。數(shù)字化液滴核酸擴(kuò)增技術(shù)是將核酸樣品分散至成千上萬個(gè)獨(dú)立液滴中進(jìn)行大規(guī)模的平行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，利用熒光信號(hào)的泊松分布，實(shí)現(xiàn)精確定量[28]。滾環(huán)擴(kuò)增、解旋酶依賴擴(kuò)增和核酸序列依賴擴(kuò)增等核酸擴(kuò)增方式與液滴微流控結(jié)合在食源性致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)用極少，故本文不進(jìn)行介紹，下面分別針對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和重組酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合液滴微流控技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)行闡述。

2.1 微流控-數(shù)字PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)從常規(guī)PCR（第一代PCR）經(jīng)由第二代PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）發(fā)展至第三代PCR（數(shù)字PCR）。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)因其高靈敏度、特異性和精確性，已成為研究的熱點(diǎn)并逐漸推廣應(yīng)用[29]。

dPCR 是近年來發(fā)展迅速的一種核酸分子絕對(duì)定量檢測(cè)技術(shù)。最早是由Sykes 等[30]在1992 年提出。液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)的原理示意圖如圖2，主要是將PCR 反應(yīng)體系高度稀釋并分配至上萬個(gè)獨(dú)立反應(yīng)中（理論上每個(gè)反應(yīng)含有1 或0 個(gè)目標(biāo)分子），然后進(jìn)行單分子的PCR 擴(kuò)增，通過統(tǒng)計(jì)反應(yīng)室中陽性單元和陰性單元的熒光信號(hào)，借助泊松分布精確得出樣品中目標(biāo)分子濃度，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子核酸絕對(duì)定量[28]。根據(jù)分液方式的不同，數(shù)字PCR 主要分為微流體數(shù)字PCR（microfluidic digital PCR，mdPCR）、微滴數(shù)字PCR、以及芯片數(shù)字PCR（chip digital PCR，cdPCR）[31]。dPCR 技術(shù)有效避免了前兩代PCR 技術(shù)的弊端：常規(guī)PCR 技術(shù)不能進(jìn)行定量檢測(cè)，且樣品容易發(fā)生污染問題；與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)相比，數(shù)字PCR不需要依賴Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可絕對(duì)定量檢測(cè)，而且在靈敏度和準(zhǔn)確性方面均有很大突破[32]。

圖2 液滴微流控?cái)?shù)字PCR[29]Fig.2 Droplet microfluidic digital PCR [29]

在致病菌檢測(cè)方面，趙新等[33]根據(jù)沙門氏菌invA毒力基因序列，建立沙門氏菌ddPCR 的快速定量檢測(cè)方法，有較好的特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到102CFU/mL。ddPCR 技術(shù)在單增李斯特菌的檢測(cè)上也發(fā)揮了作用，趙麗青等[34]建立了一種ddPCR 技術(shù)對(duì)食品中單增李斯特菌定量檢測(cè)的方法，以hlyA為靶序列，該方法的特異性和重復(fù)性均較好，檢出限可達(dá)90 CFU/mL。另外，Bian 等[35]建立了一種基于礦物油飽和PDMS 微流控芯片和雙色熒光探針的double ddPCR 平臺(tái)，可同時(shí)檢測(cè)致病性大腸桿菌O157 和單增李斯特菌，此方法對(duì)兩種病原菌的檢出限低至10 CFU/mL，兩種菌的回收率均在90%左右。鄧雪蕾等[36]采用聚二甲基硅氧烷和玻璃（PDMSGlass）為材料設(shè)計(jì)制作了一款多功能集成式ddPCR芯片，成功地對(duì)副溶血弧菌基因組DNA 進(jìn)行了絕對(duì)定量。方佩佩等[37]利用ddPCR 技術(shù)快速定量檢測(cè)副溶血弧菌，檢測(cè)菌懸液的濃度范圍為50～4.86×105CFU/mL。Lei 等[38]根據(jù)副溶血弧菌的特異性基因，建立了基于完整單細(xì)胞的多重ddPCR 方法，高效精準(zhǔn)地對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)，還能區(qū)分不同致病性的副溶血弧菌。dPCR 技術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)，靈敏度和準(zhǔn)確性均較高，在多種致病菌檢測(cè)及同時(shí)檢測(cè)方面顯示出實(shí)用性和良好的發(fā)展前景。

2.2 微流控-數(shù)字LAMP

dPCR 技術(shù)雖然應(yīng)用廣泛，但是由于仍然需要高溫變性-低溫退火-升溫延伸等溫度變化的過程，這樣的溫度循環(huán)過程使得擴(kuò)增過程復(fù)雜且費(fèi)時(shí)，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。LAMP 技術(shù)于2000 年由Notomi等[39]提出，其基本原理是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異引物，利用鏈置換DNA 聚合酶在60～65 ℃恒溫條件下擴(kuò)增30～60 min，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸109～1010倍的擴(kuò)增[40]。

液滴數(shù)字LAMP（droplet digital LAMP，ddLAMP）技術(shù)即是在微流控芯片上進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，原理如圖3 所示：通過微流控系統(tǒng)將反應(yīng)體系分隔在大量大小均一的液滴中，每一滴即為一個(gè)反應(yīng)單元，根據(jù)泊松分布在60～65 ℃進(jìn)行獨(dú)立的單分子等溫?cái)U(kuò)增，從而達(dá)到絕對(duì)定量的目的。ddLAMP 可以在等溫條件下高效快速的完成擴(kuò)增反應(yīng)[42]，特異性、靈敏度和擴(kuò)增效率都得到了提高，試劑消耗少，便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)也較為突出。

圖3 液滴微流控?cái)?shù)字化LAMP[41]Fig.3 Droplet microfluidic digital LAMP[41]

近年來ddLAMP 的應(yīng)用逐漸廣泛。王珍等[43]建立了一種檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的ddLAMP 方法，對(duì)菌液的檢出限為1.70×102CFU/mL，靈敏度是傳統(tǒng)LAMP 方法的10 倍；對(duì)米飯樣品中蠟樣芽胞桿菌的檢出限為57 CFU/mL，優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（檢出限為1.04×102CFU/mL）。Tao 等[44]應(yīng)用一個(gè)集離心富集、自動(dòng)DNA 提取和基于界面乳化的ddLAMP 于一體的自動(dòng)化系統(tǒng)對(duì)全脂牛奶中牛分歧桿菌進(jìn)行絕對(duì)定量，該方法簡(jiǎn)化了牛奶中牛分歧桿菌超低濃度檢測(cè)的操作和快速定量，并且無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可在2 h內(nèi)完成，檢出限為14 CFU/mL。Sayad 等[45]開發(fā)了一種將微流控技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合的沙門氏菌檢測(cè)平臺(tái)裝置，該裝置將試劑制備、LAMP 檢測(cè)等步驟集成在一個(gè)微流控光盤上，檢測(cè)樣品中沙門氏菌的最低檢出限為3.4×104CFU/mL。鞠鶴鵬等[46]建立了一種ddLAMP 技術(shù)，可同時(shí)快速檢測(cè)沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌三種食源性致病菌，方法的特異性較好，三種致病菌的檢測(cè)限均可達(dá)到1×102CFU/mL。針對(duì)不同的檢測(cè)樣品和目標(biāo)菌，ddLAMP 技術(shù)的檢測(cè)靈敏度存在一定的差異，可進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)體系。ddLAMP 特異性、靈敏性和擴(kuò)增效率高，且在恒溫條件下進(jìn)行，已成為致病菌檢測(cè)的重要工具和手段，未來也將會(huì)得到更為廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

2.3 微流控-數(shù)字RPA

LAMP 技術(shù)有明顯的優(yōu)勢(shì)，但因其擴(kuò)增所需要的恒定溫度是60～65 ℃，這就意味著仍然需要加熱設(shè)備，而且引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、特異性擴(kuò)增容易出現(xiàn)假陽性，成本也相對(duì)較高，因此另一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)—重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)隨之映入人們視野。RPA技術(shù)自2006 年被Piepenburg 等[47]提出以來，即受到研究人員的廣泛關(guān)注。RPA 技術(shù)擴(kuò)增核酸所需要的溫度僅為37～42 ℃，甚至在室溫下即可反應(yīng)，突破了環(huán)境和設(shè)備的限制，使得RPA 技術(shù)雖然目前在應(yīng)用中還不如LAMP 技術(shù)，但已經(jīng)成為最近發(fā)展最快的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[48]。RPA 技術(shù)是利用重組酶促進(jìn)寡核苷酸引物在DNA 雙鏈互補(bǔ)序列中的插入，單鏈DNA 結(jié)合蛋白（Single-stranded DNA-binding protein，SSB）用于與置換出的DNA 序列結(jié)合，以及使用類似于PCR 的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA 特定區(qū)域進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，RPA 技術(shù)只需要兩個(gè)引物，不需加熱，擴(kuò)增時(shí)間20～40 min[49-52]。而且，由于該方法溫度較低，可在很大程度上減少液滴蒸發(fā)的問題。

數(shù)字化重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（digital RPA，dRPA）的原理如圖4 所示[53]，即將RPA 檢測(cè)食源性致病菌的過程集中在單個(gè)微流控芯片上，根據(jù)泊松分布原理，將核酸模板分散成單分子反應(yīng)單元，通過對(duì)反應(yīng)室中陽性反應(yīng)單元計(jì)數(shù)即可達(dá)到絕對(duì)定量的目的[54-55]，實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)結(jié)果出”的快速檢測(cè)[56]。

圖4 液滴微流控?cái)?shù)字化RPA[53]Fig.4 Droplet microfluidic digital RPA[53]

Schuler 等[57]首次建立液滴數(shù)字RPA（droplet digital RPA，dd RPA）方法以定量檢測(cè)單增李斯特菌DNA，檢測(cè)時(shí)間不超過30 min。目前ddRPA 技術(shù)發(fā)展迅速，Chio 等[58]開發(fā)了一種同時(shí)快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7、副溶血弧菌和沙門氏菌的集成多重ddRPA 芯片，該芯片集核酸提取、多重ddRPA 和熒光檢測(cè)于一體，在30 min 內(nèi)即可完成檢測(cè)，并且每種菌的檢測(cè)限為4 CFU/3.2 μL。Kersting 等[59]建立了一種ddRPA 芯片技術(shù)檢測(cè)淋球菌、腸道沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，該方法可在20 min 內(nèi)完成酶反應(yīng)，對(duì)淋球菌檢出限為100 CFU/mL，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌檢出限為10 CFU/mL。RPA 技術(shù)具有不需高溫即可反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，與液滴微流控技術(shù)相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)超靈敏和精準(zhǔn)的定量檢測(cè)，在便攜設(shè)備和現(xiàn)場(chǎng)診斷上具有廣泛的應(yīng)用前景[60]。

液滴微流控結(jié)合三種核酸擴(kuò)增技術(shù)在集成化程度顯著提高的前提下，檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度也不亞于傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法。表1 列出了這三種技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)用實(shí)例，如檢測(cè)食品中的沙門氏菌，ddPCR 技術(shù)檢測(cè)實(shí)際樣品的結(jié)果與國(guó)標(biāo)法相符，檢測(cè)限為102CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間24 h[33]；ddLAMP技術(shù)靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)LAMP，檢出限為100 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間30 min～3 h[46,65-66]；ddRPA 技術(shù)的檢出限為10 CFU/mL，檢出時(shí)間20 min[59]。與本文其他兩種技術(shù)相比，ddRPA 技術(shù)極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，一般可在30 min 完成檢測(cè)，適合高通量快速檢測(cè)。

表1 微流控技術(shù)結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)在致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)用Table 1 Application of microfluidic technology combined with nucleic acid amplification technology in detecting pathogenic bacteria

續(xù)表1

3 總結(jié)及展望

微流控技術(shù)因其高通量、高效率和易操作等優(yōu)點(diǎn)，在微生物檢測(cè)上應(yīng)用廣泛。利用微流控技術(shù)進(jìn)行數(shù)字化核酸擴(kuò)增，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，為食源性致病菌檢測(cè)提供了準(zhǔn)確、高效的平臺(tái)。

與目前應(yīng)用較為廣泛的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相比，dPCR 技術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量，并在靈敏度和檢測(cè)時(shí)間上顯示出較大的優(yōu)勢(shì)；而dLAMP 技術(shù)可以解決dPCR 技術(shù)溫度循環(huán)所帶來的能量消耗大、操作復(fù)雜等問題，將病原菌的核酸提取步驟集成在微流控芯片上，達(dá)到單分子基因檢測(cè)水平，可以進(jìn)一步提高準(zhǔn)確度和靈敏度；dRPA 技術(shù)突破了前兩者溫度的限制，在室溫下即可進(jìn)行核酸擴(kuò)增，進(jìn)一步降低了對(duì)儀器的依賴性，且可無需破碎細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。但是目前由于技術(shù)限制，仍然存在一些亟待解決的問題，例如這幾種檢測(cè)方法在對(duì)復(fù)雜樣品檢測(cè)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)準(zhǔn)確性下降等問題；數(shù)字LAMP 和數(shù)字RPA 技術(shù)的引物和探針設(shè)計(jì)需要耗費(fèi)較多的時(shí)間和精力，非特異性擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

隨著科技的進(jìn)一步發(fā)展，微流控技術(shù)將會(huì)在溫度控制、流體控制以及傳感分析方面實(shí)現(xiàn)更新更快的突破，芯片的體積也將會(huì)越來越小，核酸擴(kuò)增的操作會(huì)更加準(zhǔn)確和高效；數(shù)字PCR 芯片、數(shù)字LAMP芯片和數(shù)字RPA 芯片在質(zhì)量得到顯著提高的同時(shí)，將成本更低，檢測(cè)更準(zhǔn)確，將會(huì)與目前的智能設(shè)備緊密結(jié)合，朝著更加智能化的方向發(fā)展，具有良好的市場(chǎng)前景。