周陳平 楊敏 郭金菊 鄺瑞彬 李慶萌 楊護(hù) 黃炳雄 魏岳榮

摘要：【目的】探索番木瓜兩性株高溫條件下花性轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，篩選花性調(diào)控相關(guān)基因，為培育耐高溫番木瓜新品種提供理論依據(jù)。【方法】以在高溫環(huán)境（39～40 ℃）下采集的番木瓜兩性株的雄花（雌蕊退化）和兩性花（完全花）為試驗(yàn)材料，利用高效液相色譜法測(cè)定兩者內(nèi)源激素含量，利用RNA-seq 技術(shù)分析兩者間的差異表達(dá)基因，并通過(guò)qRTPCR進(jìn)行驗(yàn)證，用Plant CARE在線軟件分析花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子順式元件。【結(jié)果】?jī)尚曰ㄒ蚁┖铣汕绑w1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）、吲哚-3-乙酸（IAA）、反式玉米素（tZ）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）含量顯著高于雄花，兩者脫落酸（ABA）和赤霉素A3（GA3）含量無(wú)顯著差異。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共獲得27 793 個(gè)表達(dá)基因，篩選到517 個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），其中214 個(gè)基因在雄花中上調(diào)表達(dá)，303 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。這些差異表達(dá)基因主要富集到轉(zhuǎn)錄與調(diào)控、植物激素響應(yīng)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化與器官生長(zhǎng)調(diào)控、質(zhì)膜組分、氧化應(yīng)激等GO條目和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原體相互作用、促絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路等KEGG通路上。通過(guò)基因功能注釋?zhuān)Y選到70 個(gè)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、響應(yīng)、生物合成及代謝相關(guān)差異表達(dá)基因，其中52 個(gè)基因在雄花中下調(diào)表達(dá)，18 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。鑒定到ANT、ANT2、CIB1、HHO5、ZIP21、SAP 等6 個(gè)花發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)基因，均在雄花中下調(diào)表達(dá)，其中SAP 基因在兩性花中特異表達(dá)。除ANT2未查找到相應(yīng)啟動(dòng)子序列外，ANT、CIB1、HHO5、SAP、ZIP21啟動(dòng)子含植物激素和逆境相關(guān)順式作用元件。

選取17個(gè)花發(fā)育和植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致?！窘Y(jié)論】番木瓜兩性株在高溫條件下花性轉(zhuǎn)變可能與花芽ACC、IAA、tZ、SA、JA含量下降及ANT、ANT2、CIB1、HHO5、SAP基因下調(diào)表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：番木瓜；兩性株；高溫；性別轉(zhuǎn)變；基因差異表達(dá)；植物激素

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）03-0457-14

番木瓜（Carica papaya L.）植株性別分為雄株、雌株和兩性株3 種類(lèi)型，其中兩性株果肉厚、品質(zhì)優(yōu)，與雌果相比，具有更高的商品價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-4]。番木瓜的性別由一對(duì)性染色體控制，即：雌株基因型為XX，雄株基因型為XY，兩性株基因型為XYh[5-6]。與遺傳性較穩(wěn)定的X染色體相比，雄性特異的Y 染色體（MSY）和兩性特異的Yh 染色體（HSY）被高度甲基化或異染色質(zhì)化，核酸多態(tài)性較高[7-8]。HSY 和MSY 染色體大約8.1 Mb，是番木瓜最大的1 號(hào)染色體，98.9%～99.6%的序列具有相似性，在非同源區(qū)段有1887 個(gè)插入缺失和21 088 個(gè)SNP，包含27 個(gè)差異基因，但大部分都不是性別決定基因[9-12]。其中，SVP-like 被認(rèn)為是雌性抑制基因，在MSY染色體上含MADS-box 和K-box，而在HSY染色體上只含K-box，但至今尚無(wú)足夠證據(jù)表明SVP-like參與番木瓜性別分化[3，13-14]。

植物性別決定存在兩種機(jī)制，第一是遺傳型性別決定，第二是環(huán)境型性別決定[15]。遺傳因子主導(dǎo)番木瓜株性，外界環(huán)境影響花性轉(zhuǎn)變，而花性轉(zhuǎn)變主要決定于溫度[16-17]。番木瓜的花性分化是在性別決定遺傳因子的基礎(chǔ)上進(jìn)行雄性、雌性或兩性性狀的分化和發(fā)育，與外界因素有關(guān)，當(dāng)內(nèi)外因素有利于某一性別的發(fā)育時(shí)，就有可能產(chǎn)生跟性別決定遺傳物質(zhì)不一致的結(jié)果，在高溫、干旱和缺氮等外界壓力下，會(huì)導(dǎo)致番木瓜雌性不育[18]。番木瓜最適生長(zhǎng)溫度為26～32 ℃，當(dāng)外界環(huán)境溫度高于最適生長(zhǎng)溫度5 ℃以上時(shí)，就會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)形成高溫脅迫[1]。隨外界環(huán)境由低溫到高溫，番木瓜兩性株的花型從雌型兩性花（雄蕊心皮化）轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)圓形兩性花（完全花），再轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌蛢尚曰ǎù迫锇l(fā)育不全）和雄花（雌蕊完全退化），當(dāng)環(huán)境溫度過(guò)低時(shí)，番木瓜雄株也會(huì)形成兩性花[2-3，19]。這可能與番木瓜花芽分化過(guò)程中植物激素濃度變化及穩(wěn)態(tài)有關(guān)[20-21]。

中國(guó)番木瓜主產(chǎn)區(qū)屬熱帶、南亞熱帶地區(qū)，高溫季節(jié)時(shí)間長(zhǎng)。番木瓜兩性株在高溫條件下性別轉(zhuǎn)變導(dǎo)致間斷結(jié)果和產(chǎn)量下降是制約番木瓜高效生產(chǎn)的主要因素之一。目前，有關(guān)高溫導(dǎo)致番木瓜兩性株性別轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制尚未完全闡明。筆者在本研究中基于番木瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選番木瓜兩性株雄花和兩性花的差異表達(dá)基因，并分析兩者的內(nèi)源激素含量差異，為探索番木瓜兩性株在高溫條件下花性轉(zhuǎn)變的分子調(diào)控機(jī)制提供新視角，為培育耐高溫番木瓜新品種奠定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及取樣

以廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所自主選育的番木瓜品種GZY3-6 兩性株為研究對(duì)象。選取25 株長(zhǎng)勢(shì)相近的組培苗，2019 年3 月15 日定植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所番木瓜資源圃，常規(guī)栽培管理，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。2019 年7 月16 日11：00—13：00（氣溫39～40 ℃）采集長(zhǎng)度＜5 mm的主花芽，利用體視鏡區(qū)分雌蕊退化的雄花和有功能性雌蕊的兩性花（圖1），用液氮速凍后貯存于-80 ℃超低溫冰箱備用。樣品委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析。

1.2 內(nèi)源激素含量測(cè)定

取25 mg 樣品，加入1 mL 在-40 ℃下預(yù)冷的50%乙腈水溶液，勻漿4 min，冰水浴超聲5 min，勻漿超聲步驟重復(fù)3 次，4 ℃下12 000 r · min-1 離心15 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，加?0 μL 10%乙腈水溶液復(fù)溶，移至帶濾膜的EP管中，4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，利用EXIONLC System 超高效液相色譜儀和SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質(zhì)譜儀測(cè)定內(nèi)源激素含量。設(shè)4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)5～10個(gè)花芽。

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm × 2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相A：0.01%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.01%甲酸乙腈溶液。柱溫40 ℃，樣品盤(pán)4 ℃，進(jìn)樣量5 μL。離子源參數(shù)：溫度475 ℃，離子噴霧電壓4 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負(fù)離子模式），離子源氣體1、氣體2 和簾氣分別設(shè)置為30、30 和40 psi。通過(guò)SCIEX Analyst Work StationSoftware 1.6.3 和Sciex MultiQuant 3.0.3 軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)和定量分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析

用TRIzol 提取番木瓜花芽總RNA，NanoDROPND-1000 對(duì)總RNA的濃度與純度進(jìn)行質(zhì)控。使用Oligo（dT）磁珠富集帶多聚腺苷酸mRNA，NEBFragmentation Module對(duì)mRNA隨機(jī)打斷，將片段化的mRNA 合成cDNA 第一條鏈，隨后加入RNaseH和DNA polymerase Ⅰ合成cDNA 第二條鏈。加入dUTP Solution，將雙鏈cDNA末端補(bǔ)齊為平末端，加A尾、連接測(cè)序接頭。cDNA經(jīng)消化后，在95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性15 s，共8個(gè)循環(huán)，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，形成300 bp 左右的cDNA 文庫(kù)。使用Illumina Novaseq 6000 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序模式為PE150。設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)5～10 個(gè)花芽。

測(cè)序后獲得原始序列（raw reads），通過(guò)cutadapt軟件去除接頭、重復(fù)序列、低質(zhì)量序列，獲得過(guò)濾序列（clean reads）。使用HISAT2 v2.0.4 將得到的過(guò)濾序列比對(duì)到番木瓜參考基因組（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！bulk？org=Org_Cpapaya）上，用String Tie 軟件對(duì)基因或轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行初組裝，用gffcompare 軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測(cè)和組裝注釋。

利用FPKM（指每百萬(wàn)堿基對(duì)測(cè)序的轉(zhuǎn)錄本序列片段的每千堿基片段的預(yù)期數(shù)量）計(jì)算基因表達(dá)水平。通過(guò)p 值＜ 0.05 且|log2（fold change）| ≥ 1 為閾值篩選差異表達(dá)基因（DEG）。

1.4 差異表達(dá)基因的功能注釋與富集分析

利用R包GOseq 軟件進(jìn)行GO（Gene Ontology）富集分析，獲得生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能的GO注釋結(jié)果。利用KOBAS 軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。以p 值＜0.05 定義為GO項(xiàng)或KEGG通路顯著富集。

1.5 花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

從番木瓜參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載花發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列（ATG 上游2000 bp 序列），用PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列的順式作用元件，利用TBtools 軟件對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行可視化繪圖[22]。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

選取17 個(gè)花發(fā)育和植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因，用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)特異引物（表1）。

參照周陳平等[23]的方法，使用天根RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，用EvoM-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR 試劑盒合成cDNA 作為PCR 模板，使用Bio-Rad CFX96儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序參照SYBR Green ProTaq HS實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒方法進(jìn)行，以番木瓜肌動(dòng)蛋白基因（CpActin）為內(nèi)參基因。用2- ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)5～10 個(gè)花芽。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄花和兩性花中ACC和內(nèi)源激素含量分析

在番木瓜兩性花中，乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）、吲哚-3-乙酸（IAA）、反式玉米素（tZ）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）含量分別是雄花的2.08、1.40、1.81、4.07、1.93 倍，兩者的脫落酸（ABA）和赤霉素A3（GA3）含量無(wú)顯著差異（圖2）。

2.2 雄花和兩性花轉(zhuǎn)錄組分析

對(duì)番木瓜兩性株雄花和兩性花樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得45.17 Gb 原始數(shù)據(jù)，過(guò)濾后，樣品的平均序列數(shù)量為7.41 Gb，Q20＞99.9%，Q30＞98.7%，與參考基因組比對(duì)率超過(guò)88.9%，其中約78.2%比對(duì)到基因組唯一序列（表2）。說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠性和精準(zhǔn)性較好，可進(jìn)一步分析。

為分析雄花和兩性花不同表達(dá)水平基因數(shù)量的分布情況，將基因表達(dá)水平劃分為4 個(gè)等級(jí)，2 組樣品在4 個(gè)等級(jí)中的基因數(shù)量分布情況相近（圖3-A）。在2 組樣品轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共組裝拼接得到27 793 個(gè)基因，不表達(dá)（FPKM＜1）的基因數(shù)量約占33.9%，在100＞FPKM ≥ 10 區(qū)間的基因數(shù)量最多，占比為39.2%，其次是10＞FPKM ≥ 1 區(qū)間，占比為20.3%，F(xiàn)PKM ≥ 100 占比最少。在p 值＜0.05 且|log2（fold change）| ≥ 1 的閾值條件下，在雄花和兩性花中共鑒定得到517 個(gè)差異表達(dá)基因，其中214 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，303 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖3-B）。

2.3 雄花和兩性花中差異表達(dá)基因GO 注釋與KEGG功能富集分析

對(duì)番木瓜兩性株雄花和兩性花中517 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，主要涉及生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能。顯著富集（p 值＜0.05）在生物學(xué)過(guò)程的有85 項(xiàng)、細(xì)胞組成有11 項(xiàng)、分子功能有49 項(xiàng)。選擇富集最顯著的前50 項(xiàng)條目進(jìn)行展示（表3）。在生物學(xué)過(guò)程中，大多數(shù)基因主要富集到轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、植物激素響應(yīng)與信號(hào)調(diào)控、細(xì)胞分化與器官生長(zhǎng)調(diào)控、脅迫響應(yīng)與調(diào)控等相關(guān)的GO條目中。在細(xì)胞組分中，以質(zhì)膜、胞外區(qū)為主。在分子功能中，以轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA特異序列結(jié)合為主。

將番木瓜兩性株雄花和兩性花中差異表達(dá)基因比對(duì)到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中，共富集到66 個(gè)KEGG 通路。以p 值＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因顯著富集的通路，包括植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、α-亞麻酸代謝、單萜類(lèi)生物合成、亞麻酸代謝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、植物-病原體相互作用、谷胱甘肽代謝和促絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路等8 個(gè)KEGG 通路（表4）。顯著富集基因最多的是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其次是植物-病原體相互作用、促絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路等。

2.4 雄花和兩性花中植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因分析

植物激素在花器官發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為分析番木瓜雄花和兩性花中植物激素相關(guān)基因的表達(dá)情況，通過(guò)差異表達(dá)基因的功能注釋?zhuān)茶b定到70 個(gè)植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因（表5）。在這些基因中，有13 個(gè)基因參與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)生物學(xué)過(guò)程，其中10 個(gè)基因在雄花中下調(diào)表達(dá)，包括脫落酸受體基因PYL4；3 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，包括在雄花中特異表達(dá)基因RGGA。

有20 個(gè)差異表達(dá)基因參與生長(zhǎng)素運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，除生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)基因WAG1 和生長(zhǎng)素響應(yīng)基因SUR48 外，其余18 個(gè)基因在雄花中均下調(diào)表達(dá)。在兩性花中，生長(zhǎng)素合成基因ILL3、GH3.1 和GH3.9 表達(dá)量分別是雄花的9.32、2.17、3.36 倍，4 個(gè)參與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)的SAUR家族基因表達(dá)量是雄花的2.27～5.78倍。

細(xì)胞分裂素是細(xì)胞分化的重要植物激素。有9個(gè)差異表達(dá)基因參與細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、響應(yīng)和生物合成等生物學(xué)過(guò)程。在兩性花中，細(xì)胞分裂素生物合成基因LOG3、LOG5、LOG5.1 表達(dá)量分別是雄花的2.39、2.06、34.06倍。

另外，參與乙烯、赤霉素、茉莉酸、水楊酸相關(guān)差異表達(dá)基因分別有8、4、13、3 個(gè)。在雄花中，赤霉素生物合成基因GA20OX1 和水楊酸代謝基因SAMT1的表達(dá)量分別是兩性花的2.33 和5.78 倍。而在兩性花中，茉莉酸生物合成基因LOX2、OPR3 和乙烯生物合成基因ACO1 表達(dá)量分別是雄花的4.17、5.54、2.20 倍。

2.5 雄花和兩性花中花發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)基因分析

在番木瓜雄花和兩性花中，共鑒定到6 個(gè)參與花發(fā)育相關(guān)基因。在兩性花中，ANT、ANT2、CIB1、HHO5、ZIP21 基因表達(dá)量分別是雄花的2.27、2.08、2.17、2.22、2.08 倍，而參與花和胚珠發(fā)育的SAP基因在兩性花中特異表達(dá)（表6）。

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

為驗(yàn)證番木瓜雄花和兩性花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和有效性，選取17 個(gè)花發(fā)育和植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，其中4 個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因（SAP、ANT、HHO5、ZIP21）、5 個(gè)植物激素生物合成基因（ILL3、LOG5、LOX2、OPPR3、ACO1）、2 個(gè)生長(zhǎng)素運(yùn)輸基因（SAUR66、SAUR67）、5 個(gè)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與響應(yīng)基因（JAZ6、JAZ8、JAZ10、bHLH13、WOX9）在雄花中下調(diào)表達(dá)，1 個(gè)水楊酸代謝基因（SAMT1）上調(diào)表達(dá)（圖4）。將所得的基因相對(duì)表達(dá)量值轉(zhuǎn)化為log2（fold change），與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的log2（fold change）進(jìn)行比較，兩者上、下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)一致，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠。

2.7 雄花和兩性花中花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

為了分析花發(fā)育相關(guān)基因ANT、ANT2、CIB1、HHO5、SAP、ZIP21（表6）的啟動(dòng)子元件的組成及可能的調(diào)控作用。除ANT2 基因未查找到相應(yīng)啟動(dòng)子序列外，從番木瓜參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其余5個(gè)基因啟動(dòng)子序列，采用PlantCARE 預(yù)測(cè)基因啟動(dòng)子順式作用元件（圖5）。這5 個(gè)基因啟動(dòng)子均含脫落酸響應(yīng)和脅迫響應(yīng)元件，此外，ANT 和CIB1 啟動(dòng)子含生長(zhǎng)素響應(yīng)、無(wú)氧誘導(dǎo)、茉莉酸甲酯響應(yīng)、水楊酸誘導(dǎo)及響應(yīng)元件，HHO5 啟動(dòng)子含茉莉酸甲酯響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)與誘導(dǎo)元件，SAP啟動(dòng)子含無(wú)氧誘導(dǎo)、低溫響應(yīng)和赤霉素響應(yīng)元件，ZIP21啟動(dòng)子含無(wú)氧誘導(dǎo)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)和赤霉素響應(yīng)元件。

3 討論

性別分化除受遺傳物質(zhì)的調(diào)控外，環(huán)境條件也可以影響性別轉(zhuǎn)變。高溫是導(dǎo)致番木瓜兩性株的花性向雄花轉(zhuǎn)變的重要環(huán)境因素之一，但其分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。筆者在本研究中對(duì)在高溫環(huán)境下采集的番木瓜兩性株雄花和兩性花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝拼接得到27 793 個(gè)基因，共鑒定到517 個(gè)差異表達(dá)基因。KEGG 富集分析表明，植物激素響應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集最顯著，說(shuō)明植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因可能在番木瓜兩性株高溫趨雄過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

植物激素通過(guò)相互作用和串?dāng)_，直接或間接參與性別分化和組織形態(tài)發(fā)生，生長(zhǎng)素、乙烯、細(xì)胞分裂素在植物性別分化中起到促進(jìn)雌性化的作用，而赤霉素起到促雄作用[24-27]。孫思瓊等[28]研究表明，外施赤霉素會(huì)增加甜瓜雄花兩性株的雄花數(shù)量。然而，Han 等[29]對(duì)番木瓜兩性株和雌株的花芽外施GA3，并未觀察到花性轉(zhuǎn)雄，反而增加花梗長(zhǎng)度和花序分枝數(shù)量。在本研究中，番木瓜雄花和兩性花GA3含量無(wú)顯著差異，與前人的研究結(jié)果一致。說(shuō)明赤霉素對(duì)不同物種間花性轉(zhuǎn)變的作用存在差異。

而外施生長(zhǎng)素（萘乙酸）[21]或乙烯利[30]可促進(jìn)番木瓜雄株雌蕊的形成。在本研究中，生長(zhǎng)素-氨基酸水解酶基因（ILL3）、吲哚乙酸氨基化合成酶基因（GH3.1、GH3.9）和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因（ACO1）在雄花中下調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致雄花中生長(zhǎng)素和乙烯的合成量減少。在擬南芥中，ANT是調(diào)控胚珠生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因，受生長(zhǎng)素調(diào)控，同時(shí)介導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)通路相關(guān)基因參與花器官形成[31-32]；CIB1 基因編碼蛋白則直接調(diào)控FT 基因表達(dá)，調(diào)節(jié)植物成花[33]。對(duì)ANT 和CIB1 基因啟動(dòng)子的順式元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子含生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，番木瓜兩性株雄花中生長(zhǎng)素積累量的減少，可能降低ANT、CIB1 基因表達(dá)量，導(dǎo)致雄花雌蕊發(fā)育不全。也有研究報(bào)道，外施細(xì)胞分裂素（氯吡苯脲）可促進(jìn)獼猴桃雄株雌蕊的形成[34]。本研究中，雄花細(xì)胞分裂素核苷5-單磷酸鹽磷酸核糖水解酶基因（LOG3、LOG5、LOG5.1）的下調(diào)表達(dá)，降低了雄花細(xì)胞分裂素的積累量，減緩雌蕊的分化。說(shuō)明在高溫環(huán)境下番木瓜兩性株雌性不育的加劇與花芽生長(zhǎng)素、乙烯和細(xì)胞分裂素合成量下降有關(guān)。

茉莉酸和水楊酸在植物生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)高溫、干旱、過(guò)量光、機(jī)械損傷等非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[35-37]。在番茄中，JAI-1 基因功能缺失，導(dǎo)致雌性不育，防御反應(yīng)能力下降[38]。在小麥和擬南芥中，opr3 突變體幼苗受高溫脅迫后，成活率顯著低于野生型[39]。外施水楊酸可明顯提高番茄、馬鈴薯、小麥、水稻、葡萄等作物的耐高溫能力[40-41]。在本研究中，參與茉莉酸合成的脂氧合酶2 基因（LOX2）、12-氧代植二烯酸還原酶3 基因（OPR3）在雄花中下調(diào)表達(dá)，而參與水楊酸代謝的水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶基因（SAMT1）在雄花中上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致雄花中茉莉酸和水楊酸積累的減少，從而降低雄花對(duì)高溫耐受能力。番木瓜HHO5 基因啟動(dòng)子含茉莉酸甲酯響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)元件，雄花中茉莉酸和水楊酸含量下降，可能減弱HHO5 基因的表達(dá)，影響雌蕊的發(fā)育。

SAP 轉(zhuǎn)錄因子屬于F-box 蛋白，是E3 泛素連接酶復(fù)合物SKP1/Cullin/F-box 的組成部分，通過(guò)降解PPD蛋白來(lái)調(diào)節(jié)胚珠、花和花序發(fā)育[42]。SAP功能缺失會(huì)導(dǎo)致擬南芥胚珠、花和花序嚴(yán)重畸變[43]。干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫會(huì)促使菠蘿SAP 基因高效表達(dá)，影響花器官的大小[44]。龍眼SAP可能參與生長(zhǎng)素和赤霉素等激素應(yīng)答及非生物脅迫響應(yīng)[45]。在本研究中，番木瓜SAP 基因在雄花中不表達(dá)（FPKM ＜1）。啟動(dòng)子順式元件分析結(jié)果表明，SAP基因啟動(dòng)子含低溫響應(yīng)元件，說(shuō)明SAP基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，而在高溫脅迫下，SAP基因轉(zhuǎn)錄活性可能被抑制，可能導(dǎo)致番木瓜雌蕊敗育，促進(jìn)雄花形成。

4 結(jié)論

對(duì)番木瓜兩性株雄花和兩性花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，篩選到70 個(gè)植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因和6 個(gè)花發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)基因。番木瓜兩性株在高溫條件下的花性轉(zhuǎn)變可能與花芽中植物激素生物合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量的改變，導(dǎo)致ACC、IAA、tZ、SA、JA 積累的減少，從而降低花發(fā)育相關(guān)基因ANT、CIB1、HHO5 的表達(dá)量，以及高溫抑制SAP基因的表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)References：

[1] 熊月明，郭林榕，黃雄峰，張麗梅，林旗華. 不同栽培技術(shù)措施

對(duì)番木瓜兩性株高溫變性的抑制效應(yīng)[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，

2011，26（6）：981-984.

XIONG Yueming，GUO Linrong，HUANG Xiongfeng，ZHANG

Limei，LIN Qihua. Effect of cultivation conditions on high temperature

gender alteration of hermaphroditic papaya （Carica papaya

L.） [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，2011，26

（6）：981-984.

[2] 李亞麗，沈文濤，言譜，周鵬. 番木瓜性別決定的研究進(jìn)展[J].

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（2）：198-202.

LI Yali，SHEN Wentao，YAN Pu，ZHOU Peng. Advance of sex

determination in papaya[J]. Guangxi Agricultural Sciences，

2009，40（2）：198-202.

[3] ARYAL R，JAGADEESWARAN G，ZHENG Y，YU Q，SUNKAR

R，MING R. Sex specific expression and distribution of

small RNAs in papaya[J]. BMC Genomics，2014，15（1）：20.

[4] ARYAL R，MING R. Sex determination in flowering plants：papaya

as a model system[J]. Plant Science，2014，217/218：56-62.

[5] LIU Z Y，MOOR P H，MA H，ACKERMAN C M，RAGIBA M，

YU Q Y，PEARL H M，KIM M S，CHARLTON J W，STILES J

L，ZEE F T，PATERSON A H，MING R. A primitive Y chromosome

in papaya marks incipient sex chromosome evolution[J].

Nature，2004，427（6972）：348-352.

[6] MING R，YU Q Y，MOORE P H. Sex determination in papaya[J].

Seminars in Cell & Developmental Biology，2007，18（3）：401-

408.

[7] ZHANG W L，WANG X，YU Q Y，MING R，JIANG J M. DNA

methylation and heterochromatinization in the male-specific region

of the primitive Y chromosome of papaya[J]. Genome Research，

2008，18（12）：1938-1943.

[8] BERGERO R，CHARLESWORTH D. Preservation of the Y

transcriptome in a 10- million- year- old plant sex chromosome

system[J]. Current Biology，2011，21（17）：1470-1474.

[9] VANBUREN R，WAI C M，ZHANG J S，HAN J，ARRO J，LIN

Z C，LIAO Z Y，YU Q Y，WANG M L，ZEE F，MOORE R C，

CHARLESWORTH D，MING R. Extremely low nucleotide diversity

in the X-linked region of papaya caused by a strong selective

sweep[J]. Genome Biology，2016，17（1）：230.

[10] VANBUREN R，ZENG F C，CHEN C X，ZHANG J S，WAI C

M，HAN J，ARYAL R，GSCHWEND A R，WANG J P，NA J K，

HUANG L X，ZHANG L M，MIAO W J，GOU J Q，ARRO J，

GUYOT R，MOORE R C，WANG M L，ZEE F，CHARLESWORTH

D，MOORE P H，YU Q Y，MING R. Origin and domestication

of papaya Yh chromosome[J]. Genome Research，

2015，25（4）：524-533.

[11] WANG J P，NA J K，YU Q Y，GSCHWEND A R，HAN J，ZENG

F C，ARYAL R，VANBUREN R，MURRAY J E，ZHANG W L，

NAVAJAS- P?REZ R，F(xiàn)ELTUS F A，LEMKE C，TONG E J，

CHEN C X，WAI C M，SINGH R，WANG M L，MIN X J，

ALAM M，CHARLESWORTH D，MOORE P H，JIANG J M，

PATERSON A H，MING R. Sequencing papaya X and Yh chromosomes

reveals molecular basis of incipient sex chromosome

evolution[J]. Proceedings of the National Academy of Siences

of the United States of America，2012，109（34）：13710-13715.

[12] YU Q Y，NAVAJAS- P?REZ R，TONG E，ROBERTSON J，

MOORE P H，PATERSON A H，MING R. Recent origin of dioecious

and gynodioecious Y chromosomes in papaya[J]. Tropical

Plant Biology，2008，1（1）：49-57.

[13] LIAO Z Y，YU Q Y，MING R. Development of male- specific

markers and identification of sex reversal mutants in papaya[J].

Euphytica，2017，213（2）：53.

[14] UENO H，URASAKI N，NATSUME S，YOSHIDA K，TARORA

K，SHUDO A，TERAUCHI R，MATSUMURA H. Genome

sequence comparison reveals a candidate gene involved in

male- hermaphrodite differentiation in papaya （Carica papaya）

trees[J]. Molecular Genetics and Genomics，2015，290（2）：661-

670.

[15] PIFERRER F. Epigenetics of sex determination and gonadogenesis[

J]. Developmental Dynamics，2013，242（4）：360-370.

[16] BARNAB?S B，J?GER K，F(xiàn)EH?R A. The effect of drought

and heat stress on reproductive processes in cereals[J]. Plant，

Cell and Environment，2008，31（1）：11-38.

[17] REZAEI E E，WEBBER H，GAISER T，NAAB J，EWERT F.

Heat stress in cereals：Mechanisms and modelling[J]. European

Journal of Agronomy，2015，64：98-113.

[18] 李惠華，何健，蘇明華，賴瑞云. 番木瓜性別分化研究進(jìn)展（綜

述）[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，2008，37（4）：64-68.

LI Huihua，HE Jian，SU Minghua，LAI Ruiyun. Review of studies

on sex differentiation in Carica papaya[J]. Subtropical Plant

Science，2008，37（4）：64-68.

[19] LIN H，LIAO Z Y，ZHANG L M，YU Q Y. Transcriptome analysis

of the male- to- hermaphrodite sex reversal induced by low

temperature in papaya[J]. Tree Genetics & Genomes，2016，12

（5）：94.

[20] 廖芬，唐文忠，周主貴，黃茂康，崔素芬，何全光. 番木瓜株性轉(zhuǎn)

變與葉片內(nèi)源激素平衡關(guān)系[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（2）：

713-717.

LIAO Fen，TANG Wenzhong，ZHOU Zhugui，HUANG Maokang，

CUI Sufen，HE Quanguang. Endogenous hormonal balance

in papaya leaf during sex conversion of hermaphrodite papaya

（Carica papaya L.）[J]. Southwest China Journal of Agricultural

Scieneces，2013，26（2）：713-717.

[21] ZHOU P，F(xiàn)ATIMA M，MA X Y，LIU J，MING R. Auxin regulation

involved in gynoecium morphogenesis of papaya flowers[J].

Horticulture Research，2019，6（1）：119.

[22] CHEN C J，CHEN H，ZHANG Y，THOMAS H R，F(xiàn)RANK M

H，HE Y H，XIA R. TBtools：An integrative toolkit developed

for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular

Plant，2020，13（8）：1194-1202.

[23] 周陳平，楊敏，郭金菊，鄺瑞彬，楊護(hù)，黃炳雄，魏岳榮. 番木瓜

成熟過(guò)程中全基因組DNA 甲基化和轉(zhuǎn)錄組變化分析[J]. 園

藝學(xué)報(bào)，2022，49（3）：519-532.

ZHOU Chenping，YANG Min，GUO Jinju，KUANG Ruibin，

YANG Hu，HUANG Bingxiong，WEI Yuerong. Dynamic changes

in DNA methylome and transcriptome patterns during papaya

fruit ripening[J]. Acta Horticulturae Sinica，2022，49（3）：519-532.

[24] 周賡，陳宸，劉曉虹，盧向陽(yáng)，田云，陳惠明. 黃瓜性別決定研究

進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2019，55（7）：902-914.

ZHOU Geng，CHEN Chen，LIU Xiaohong，LU Xiangyang，

TIAN Yun，CHEN Huiming. Research progress of sex determination

in cucumber[J]. Plant Physiology Journal，2019，55（7）：

902-914.

[25] HAMAD H，GEWAILY E，GHONEIM A，SHEHAB M，ELKHOLLY

N. Improvement ability of male parent by gibberellic

acid application to enhancing the outcrossing of cytoplasmic

male sterility rice lines[J]. Acta agriculturae Slovenica，2021，

117（3）：1-11.

[26] LIU J，CHEN L Y，ZHOU P，LIAO Z Y，LIN H，YU Q Y，

MING R. Sex biased expression of hormone related genes at early

stage of sex differentiation in papaya flowers[J]. Horticulture

Research，2021，8（1）：147.

[27] SHIRLEY N J，AUBERT M K，WILKINSON L G，BIRD D C，

LORA J，YANG X，TUCKER M R. Translating auxin responses

into ovules，seeds and yield：Insight from Arabidopsis and the

cereals[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2019，61（3）：

310-336.

[28] 孫思瓊，王惠林，王志文，徐寶林. 赤霉素和乙烯利對(duì)甜瓜4

種性型分化的影響[J]. 中國(guó)瓜菜，2021，34（11）：68-73.

SUN Siqiong，WANG Huilin，WANG Zhiwen，XU Baolin. Effects

of gibberellin and ethephon on sex differentiation in four

sex types of melon[J]. Chinese Cucurbits and Vegetables，2021，

34（11）：68-73.

[29] HAN J，MURRAY J E，YU Q Y，MOORE P H，MING R. The

effects of gibberellic acid on sex expression and secondary sexual

characteristics in papaya[J]. HortScience，2014，49（3）：378-

383.

[30] KUMAR A，JAISWAL V S. Sex reversal and fruit formation on

male plants of Carica Papaya L. by ethrel and chlorflurenol[J].

Proceedings Plant Sciences，1984，93（6）：635-641.

[31] YAMAGUCHI N，JEONG C W，NOLE-WILSON S，KRIZEK B

A，WAGNER D. AINTEGUMENTA and AINTEGUMENTALIKE6/

PLETHORA3 induce LEAFY expression in response to

auxin to promote the onset of flower formation in Arabidopsis[J].

Plant Physiology，2016，170（1）：283-293.

[32] KRIZEK B A，BLAKLEY I C，HO Y Y，F(xiàn)REESE N，LORAINE

A. The Arabidopsis transcription factor AINTEGUMENTA orchestrates

patterning genes and auxin signaling in the establishment

of floral growth and form[J]. Plant Journal，2020，103（2）：

752-768.

[33] LIU Y W，LI X，MA D B，CHEN Z R，WANG J W，LIU H T.

CIB1 and CO interact to mediate CRY2-dependent regulation of

flowering[J]. EMBO Reports，2018，19（10）：e45762.

[34] AKAGI T，HENRY I M，OHTANI H，MORIMOTO T，BEPPU

K，KATAOKA I，TAO R. A Y- encoded suppressor of feminization

arose via lineage- specific duplication of a cytokinin response

regulator in kiwifruit[J]. Plant Cell，2018，30（4）：780-795.

[35] 陳金煥，田玉如，李艾佳，夏新莉，尹偉倫. 茉莉酸信號(hào)及其在

木本植物中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)科學(xué)（生命科學(xué)），2020，50

（2）：215-226.

CHEN Jinhuan，TIAN Yuru，LI Aijia，XIA Xinli，YIN Weilun.

Jasmonic acid signaling and its research progress in woody

plants[J]. Scientia Sinnica Vitae，2020，50（2）：215-226.

[36] BALFAG?N D，SENGUPTA S，G?MEZ-CADENAS A，F(xiàn)RITSCHI

F B，AZAD R K，MITTLER R，ZANDALINAS S I. Jasmonic

acid is required for plant acclimation to a combination of

high light and heat stress[J]. Plant Physiology，2019，181 （4）：

1668-1682.

[37] KHAN F S，GAN Z M，LI E Q，REN M K，HU C G，ZHANG J

Z. Transcriptomic and physiological analysis reveals interplay

between salicylic acid and drought stress in citrus tree floral initiation[

J]. Planta，2021，255（1）：24.

[38] LI L，LI C Y，HOWE G A. Genetic analysis of wound signaling

in tomato. Evidence for a dual role of jasmonic acid in defense

and female fertility[J]. Plant Physiology，2001，127（4）：1414-

1417.

[39] TIAN X J，WANG F，ZHAO Y，LAN T Y，YU K Y，ZHANG L

Y，QIN Z，HU Z R，YAO Y Y，NI Z F，SUN Q X，ROSSI V，

PENG H R，XIN M M. Heat shock transcription factor A1b regulates

heat tolerance in wheat and Arabidopsis through OPR3 and

jasmonate signalling pathway[J]. Plant Biotechnology Journal，

2020，18（5）：1109-1111.

[40] 孫軍利，趙寶龍，郁松林. 外源水楊酸對(duì)高溫脅迫下葡萄幾種

抗氧化酶活性和抗氧化物含量的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，

2014，50（7）：1014-1018.

SUN Junli，ZHAO Baolong，YU Songlin. Effect of exogenous

salicylic acid on antioxidant enzymes activities and antioxidants

contents in grape seedlings under high temperature stress[J].

Plant Physiology Journal，2014，50（7）：1014-1018.

[41] JHA U C，NAYYAR H，SIDDIQUE K H M. Role of phytohormones

in regulating heat stress acclimation in agricultural

crops[J]. Journal of Plant Growth Regulation，2022，41（3）：1041-

1064.

[42] WANG Z B，LI N，JIANG S，GONZALWZ N，HUANG X H，

WANG Y C，INZ? D，LI Y H. SCFSAP controls organ size by targeting

PPD proteins for degradation in Arabidopsis thaliana[J].

Nature Communications，2016，7（1）：11192.

[43] BYZOVA M V，F(xiàn)RANKEN J，AARTS M G，DE ALMEIDAENGLER

J，ENGLER G，MARIANI C，VAN LOOKEREN C

M M，ANGENENT G C. Arabidopsis STERILE APETALA，a

multifunctional gene regulating inflorescence，flower，and ovule

development[J]. Genes & Development，1999，13（8）：1002-1014

[44] 夏楊，周佳煒，蘇初連，葉子，蒲金基，陳華蕊，張賀. 菠蘿Ac-

SAP 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)非生物脅迫和生物脅迫的應(yīng)答響應(yīng)[J]. 分子

植物育種，2019，17（3）：739-745.

XIA Yang，ZHOU Jiawei，SU Chulian，YE Zi，PU Jinji，CHEN

Huarui，ZHANG He. Response of SAP transcription factor to

abiotic and biotic stress in Ananas comosus[J]. Molecular Plant

Breeding，2019，17（3）：739-745.

[45] 韓婕，陳曉慧，申序，李曉斐，林玉玲，吳鵬飛，賴鐘雄. 龍眼

SAP-PPD-KIX-TPL 信號(hào)途徑基因家族的全基因組鑒定與表

達(dá)模式[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2022，28（2）：440-450.

HAN Jie，CHEN Xiaohui，SHEN Xu，LI Xiaofei，LIN Yuling，

WU Pengfei，LAI Zhongxiong. Genome-wide identification and

expression pattern of gene family of SAP-PPD-KIX-TPL signal

pathway in Dimocarpus longan Lour.[J]. Chinese Journal of Applied

and Environmental Biology，2022，28（2）：440-450.