莊夢(mèng)弟 李濤 辛騫祎 周夢(mèng)瑤 張海霞 馬輝 錢稷 張玉星 亓寶秀 許建鋒

摘要：【目的】建立梨懸浮細(xì)胞體系，并利用懸浮細(xì)胞體系獲得高質(zhì)量懸浮細(xì)胞，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體的分離?！痉椒ā恳孕吕? 號(hào)花藥為試材，誘導(dǎo)獲得梨花藥愈傷組織，研究了細(xì)胞懸浮系建立和影響懸浮細(xì)胞增殖的主要因子?！窘Y(jié)果】花藥在1/2 MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.4 mg·L-1 NAA + 30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂（pH值為5.8～6.0）培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)4～5 次繼代得到了黃白色、顆粒狀，狀態(tài)相對(duì)較好的愈傷組織；將愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，200 r·min-1的黑暗條件下懸浮振蕩培養(yǎng)，經(jīng)4～5次懸浮繼代培養(yǎng)建立了懸浮細(xì)胞系，適宜的啟動(dòng)和增殖培養(yǎng)基為：MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，活細(xì)胞率達(dá)81.98%，近圓細(xì)胞率達(dá)83.66%，可作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，轉(zhuǎn)化率為20.00%。也可直接用于原生質(zhì)體的分離，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)3.67×106 個(gè)·mL-1，活力可達(dá)92.00%?！窘Y(jié)論】建立了梨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，利用所建體系獲得了高質(zhì)量的懸浮細(xì)胞，可直接用于遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體的分離。

關(guān)鍵詞：梨；愈傷組織；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；生長(zhǎng)曲線

中圖分類號(hào)：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）03-0577-11

梨是薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus）植物，是中國(guó)三大果樹之一，在農(nóng)村區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民脫貧致富、鄉(xiāng)村振興等方面起了重要作用[1]。

梨自花結(jié)實(shí)率低，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、影響因素復(fù)雜多樣，基因組高度雜合[2]。這些特性給梨遺傳轉(zhuǎn)化和品種改良帶來(lái)嚴(yán)重障礙?；ㄋ幣囵B(yǎng)是由花粉小孢子產(chǎn)生單倍體植株的一種重要途徑，可以有效地縮短育種年限，加快新品種選育進(jìn)程，其在遺傳育種中的意義重大。因此，非常有必要開展梨花藥培養(yǎng)的研究?；ㄋ幣囵B(yǎng)是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將發(fā)育到特定階段的花藥取出轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而改變花藥內(nèi)部的生理狀態(tài)，使其在離體條件下分化成胚狀體或形成無(wú)分化的愈傷組織。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于梨樹花藥離體培養(yǎng)的研究比較少。1975 年，Jordan[3]在西洋梨花藥培養(yǎng)上獲得小原胚；1978 年，山東農(nóng)學(xué)院梨花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織[4]；1996 年，薛光榮等[5]在錦豐梨的花藥培養(yǎng)上誘導(dǎo)出胚狀體，但誘導(dǎo)率不穩(wěn)定。

花藥的細(xì)胞全能性較高，由其誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織具有較強(qiáng)的分裂和分化能力；以花藥愈傷組織為材料進(jìn)行植物懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，具有材料均一、重復(fù)性好、條件易于控制、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)[6]。植物懸浮細(xì)胞是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體之一，用懸浮細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化受體可提高轉(zhuǎn)化率，因此，穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化起到了巨大的促進(jìn)作用。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體的條件下，將愈傷組織或者其他易于分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，通過振蕩的方式得到分散的細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，使其保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)且可以不斷增殖的技術(shù)。1958 年，美國(guó)的Steward等[7]建立了胡蘿卜的懸浮體系，隨后懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于草本植物。對(duì)木本植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究起步較晚，1975 年，Wilson 等[8]建立了橡膠懸浮體系。1991 年，王影等[9]建立了小葉楊的懸浮細(xì)胞體系。此后，經(jīng)過20 多年的發(fā)展，中國(guó)在木本植物的研究中也取得了一系列的進(jìn)展，如荔枝、葡萄、花椒樹等也建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，但關(guān)于梨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面未見報(bào)道[10-13]。

筆者在本研究中以新梨7 號(hào)花藥為試材，對(duì)花藥愈傷組織的獲得、增殖及懸浮培養(yǎng)等條件進(jìn)行了研究，以期獲得高質(zhì)量的梨細(xì)胞懸浮系，懸浮培養(yǎng)獲得的小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞可以直接用于原生質(zhì)體的分離，也可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的直接受體，為梨大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)以及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園栽植的新梨7 號(hào)花藥為試材。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代 選取處于“緊湊期”（花蕾橫徑為2.7～3.0 mm，縱徑為8.0～8.5 mm）的花蕾，將花蕾表面用清水沖洗3～5 次洗去灰塵，然后在無(wú)菌工作臺(tái)上按照先75%乙醇浸泡25 s，再用0.1%HgCl2消毒8 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～4 次。剝開花蕾取出花藥，將獲得的無(wú)菌花藥接種于1/2 MS +1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.4 mg·L-1 NAA + 30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂（pH 值5.8～6.0）培養(yǎng)基中，（24±1）℃暗培養(yǎng)30 d。

選取黃白色、較松散且活性較高的愈傷組織，接種于6-BA（0.5、1.0、1.5 mg · L- 1）與2，4-D（1.0、1.5、2.0 mg·L- 1）的激素配比組合（基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS +30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂）中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，完全隨機(jī)組合，共9 個(gè)處理。每個(gè)處理3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)培養(yǎng)條件相同。

1.2.2 懸浮細(xì)胞系的初代培養(yǎng) 細(xì)胞懸浮無(wú)菌培養(yǎng)基以MS + 30 g·L-1蔗糖為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D、6-BA（表1），以不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的為對(duì)照，pH值5.8～6.0。

將分散性好、疏松的愈傷組織，用鑷子夾碎將其轉(zhuǎn)移到裝有40 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行懸浮振蕩培養(yǎng)。28 ℃，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為8 d，接種量為1.5 g，搖床轉(zhuǎn)速為200 r ·min-1，進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.3 懸浮細(xì)胞增殖培養(yǎng) 取出裝有懸浮物質(zhì)的三角瓶，靜置15～20 min，倒掉2/3 的液體培養(yǎng)基，然后加入與倒掉液體相同體積的新鮮培養(yǎng)基并用無(wú)菌玻璃棒將里面的大塊愈傷組織壓碎。以后每隔7 d 繼代1 次，21 d 后用150 μm的細(xì)胞篩過濾，獲得的細(xì)小均勻的懸浮物質(zhì)繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，得到顆粒分散、穩(wěn)定性好的懸浮細(xì)胞系。全過程無(wú)菌操作，培養(yǎng)條件同1.2.2。

1.2.4 懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定 自穩(wěn)定懸浮系被繼代的當(dāng)天起，每隔1 d 取懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)量測(cè)定。每隔1 d 取2 mL懸浮物質(zhì)，離心稱質(zhì)量，即為鮮質(zhì)量。60 ℃下烘干12 h 后稱質(zhì)量，即為干質(zhì)量。

取懸浮液2 mL， 放入2 mL 刻度的離心管中，4500 r · min-1 下離心5 min，得到的細(xì)胞體積即為細(xì)胞密實(shí)體積（PCV）。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.5 懸浮細(xì)胞死亡率的測(cè)定 選取生長(zhǎng)穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞，每隔1 d 取1 mL 進(jìn)行懸浮細(xì)胞死亡率測(cè)定。用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色3 min， 蒸餾水洗滌3 次，于20倍顯微鏡下觀察其死亡個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.3 懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

將經(jīng)懸浮培養(yǎng)后獲得的活力較強(qiáng)的愈傷組織材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，浸染流程參照王林蘋果愈傷浸染方法并對(duì)浸染液濃度、浸染時(shí)間等稍作修改[14]。具體流程為將活化好含有pROK2-GFP 質(zhì)粒的GV3101 農(nóng)桿菌液離心重懸，重懸后的浸染液（OD600為0.5）與愈傷組織置于28 ℃恒溫?fù)u床（100 r·min-1）在黑暗條件培養(yǎng)浸染15 min；將浸染后的愈傷吸干水分后置于共生培養(yǎng)基（MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-16-BA），黑暗條件下共培養(yǎng)3 d，然后將其接種到篩選培養(yǎng)基（MS +1.5 mg·L- 1 2，4-D + 1.0 mg·L- 1 6-BA +20 mg·L- 1 Basta + 300 mg·L- 1 Cef + 200 mg·L- 1 Timentin），黑暗條件下培養(yǎng)20 d。用手持熒光蛋白觀測(cè)燈（LUYOR-3415 RG Hand-Held Lamp，路陽(yáng)，美國(guó)）拍照，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.4 原生質(zhì)體的分離及產(chǎn)量、活力測(cè)定

生長(zhǎng)穩(wěn)定懸浮細(xì)胞系，取其第4 天時(shí)懸浮細(xì)胞為材料，6000 r ·min-1離心5 min。酶解液成分為：纖維素酶（1.0%）、離析酶（0.5%）、1 mL MES pH 5.7（20 mmol · L- 1）、5 mL 甘露醇（0.5 mol · L- 1）、2.5 mLKCl（20 mmol·L-1）、無(wú)菌水定容到10 mL。55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫25 ℃，加10 mmol·L- 1 CaCl2，0.1%牛血清蛋白（BSA）用0.45 μm的濾頭過濾。25 ℃黑暗條件下30 r·min-1恒溫振蕩12 h。將酶解后的材料進(jìn)行純化，加入W5 solution[其成分為2 mmol?L-1MES（pH 5.7）+ 154 mmol?L- 1 NaCl+125 mmol?L- 1CaCl2 + 5 mmol?L-1 KCl]，120 r·min-1離心4 min，離心3次。

用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量。檢測(cè)活力采用FDA染色法：FDA溶于丙酮，用蔗糖稀釋，4 ℃保存。使用時(shí)取1 滴母液與1 滴原生質(zhì)體懸浮液混合到一起，室溫下靜置5～10 min后熒光下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013 和SPSS 24 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的獲得及增殖培養(yǎng)

接種10 d 后，開始從花藥中部慢慢長(zhǎng)出愈傷組織，沒有長(zhǎng)出愈傷組織的花藥慢慢褐化死亡。

花藥接種30 d 后形成的愈傷組織塊，一部分愈傷組織微褐化，呈柔軟水漬狀為濕軟型愈傷；一部分愈傷為黃白色，結(jié)構(gòu)緊密，含水量少，此類愈傷經(jīng)過4 個(gè)月的繼代培養(yǎng)后即可獲得表面有顆粒狀突起結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織，可用來(lái)作為懸浮培養(yǎng)的材料。

新梨7 號(hào)花蕾（圖1-A）在“緊湊期”愈傷誘導(dǎo)率達(dá)45.80%，此時(shí)期的花藥（圖1-B）顏色為粉白色，花藥難以剝離。在6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著2，4-D質(zhì)量濃度的增加，結(jié)構(gòu)由緊湊型（圖1-C）向疏松型（圖1-D）轉(zhuǎn)變，愈傷組織狀態(tài)相對(duì)較好，增殖較多；反之，在2，4-D質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加愈傷組織狀態(tài)相對(duì)較差，質(zhì)地堅(jiān)硬增殖較少或基本不增殖（表2）。最終在MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D +1.0 mg·L-1 6-BA的激素質(zhì)量濃度配比下經(jīng)過4～5 次的繼代即可得到生長(zhǎng)旺盛且活性強(qiáng)的疏松愈傷，可用來(lái)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

2.2 激素對(duì)梨愈傷懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同質(zhì)量濃度的2，4-D 與6-BA 的組合對(duì)梨懸浮細(xì)胞狀態(tài)存在較大影響（表3）。在2，4-D質(zhì)量濃度為1.0～1.5 mg·L-1時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的提高活細(xì)胞率及近圓細(xì)胞率數(shù)值均有所升高，懸浮液狀態(tài)也達(dá)到好的狀態(tài)；而在2，4-D質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的提高其圓細(xì)胞及活細(xì)胞率數(shù)值均有所下降，但兩者均顯著高于對(duì)照（圖2-B～C）。在2，4-D 質(zhì)量濃度為1.5 mg · L- 1，6-BA 為1.0 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞活細(xì)胞（圖2-F）率達(dá)到81.98%，近圓細(xì)胞（圖2-E）率達(dá)到83.66%，此時(shí)懸浮液狀態(tài)也達(dá)到最好（圖2-D）。綜上所述，L6培養(yǎng)基為最適合梨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

2.3 懸浮細(xì)胞系的建立及細(xì)胞學(xué)觀察

將上述經(jīng)繼代培養(yǎng)得到的疏松愈傷組織，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。愈傷組織在懸浮培養(yǎng)1 周后出現(xiàn)長(zhǎng)形細(xì)胞（圖3-D），細(xì)胞多為空的且活力不高，在以后的繼代過程中逐步淘汰。2～3 周散出來(lái)的既有長(zhǎng)形細(xì)胞又有圓形小細(xì)胞團(tuán)（圖3-E），但長(zhǎng)細(xì)胞占比相對(duì)較大。4 周后長(zhǎng)形細(xì)胞消失，多為圓形小細(xì)胞團(tuán)，單細(xì)胞少量存在。最終建立起來(lái)的細(xì)胞懸浮系（圖3-F）基本沒有長(zhǎng)形細(xì)胞，都是由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成，也會(huì)時(shí)常出現(xiàn)多細(xì)胞聚集現(xiàn)象，大多數(shù)細(xì)胞呈圓球形且含有豐富的內(nèi)含物質(zhì)（圖3-C）。故在前三次繼代時(shí)，應(yīng)待懸浮系沉淀后倒去上層2/3 的培養(yǎng)液，去除死細(xì)胞和空細(xì)胞。

2.4 懸浮細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線和死亡率的測(cè)定

由圖4 可知，梨懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量呈“S”型生長(zhǎng)曲線，0～2 d 懸浮物質(zhì)生長(zhǎng)量小為遲滯期，細(xì)胞死亡率維持在13.97%～22.50%；2～4 d 以后細(xì)胞體積、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量明顯增加即為進(jìn)入對(duì)數(shù)期，是細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)發(fā)育最明顯的時(shí)期，該時(shí)期的細(xì)胞死亡率最低，為13.97%～15.40%；4～6 d 細(xì)胞生長(zhǎng)較平穩(wěn)，生長(zhǎng)速度逐漸降低，此時(shí)鮮質(zhì)量為0.22 g，干質(zhì)量為0.05 g，均達(dá)到最大值進(jìn)入了靜止期，這一時(shí)期的細(xì)胞死亡率為15.40%～19.14%；6 d 以后開始進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞鮮質(zhì)量、密實(shí)體積逐漸趨于下降趨勢(shì)，此時(shí)則認(rèn)為是懸浮培養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入了衰亡期，細(xì)胞死亡率為19.14%～19.18%；同時(shí)觀察到厚厚一層的衰敗細(xì)胞堆集在瓶壁上，不利于懸浮細(xì)胞系的生長(zhǎng)。在0～8 d的繼代周期內(nèi)，以花藥為外植體獲得的愈傷組織細(xì)胞懸浮系存活率均超過77.50%，細(xì)胞的死亡率均維持在22.5%以下（圖4），說明懸浮細(xì)胞的活性較強(qiáng)，絕大數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

綜上，細(xì)胞懸浮系生長(zhǎng)曲線、懸浮細(xì)胞死亡率之間存在著一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，建立了梨懸浮細(xì)胞系，并且確定了2～4 d 內(nèi)的懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好，活力最高，這一時(shí)期的細(xì)胞分裂速度很快。因此，可以選擇此時(shí)期的懸浮液來(lái)開展后續(xù)工作。

2.5 懸浮細(xì)胞系生長(zhǎng)情況

將經(jīng)懸浮培養(yǎng)后的愈傷組織接種于固體培養(yǎng)基中，得到了活性很強(qiáng)的愈傷組織，分裂速度快，狀態(tài)良好，一般15～20 d 即可達(dá)到試驗(yàn)所需生長(zhǎng)量；而未經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織15～20 d 才進(jìn)入快速生長(zhǎng)期（圖5）。光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)1 個(gè)月后，愈傷組織的狀態(tài)基本相同，光培養(yǎng)下顏色稍微偏深乳黃色一點(diǎn)并且經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織繼代后分裂速度也比未經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織分裂速度快，顏色差異也較明顯（圖6）。經(jīng)懸浮培養(yǎng)得到的愈傷組織呈乳黃色（圖6-C），活力以及分裂能力均較強(qiáng)；而未經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織呈黃白色（圖6-D），生長(zhǎng)量和活性均不如經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織（圖5）。

2.6 梨懸浮細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將35S：：GFP 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至經(jīng)懸浮培養(yǎng)的梨愈傷組織。熒光觀察結(jié)果表明，愈傷組織呈現(xiàn)綠色（圖7），表明35S：：GFP 已轉(zhuǎn)化至其中，轉(zhuǎn)化率為20.00%。

2.7 原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力鑒定

用1%的纖維素酶+0.5%離析酶組合提取的原生質(zhì)體（圖8-A）產(chǎn)量達(dá)到3.67×106個(gè)·mL-1，用FDA染色（圖8-B）進(jìn)行活力鑒定，原生質(zhì)體活力為92.00%。

3 討論

懸浮細(xì)胞懸浮液狀態(tài)、活細(xì)胞率及近圓細(xì)胞率、懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量以及后期生長(zhǎng)情況是確定懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常和懸浮培養(yǎng)體系是否建立成功的重要指標(biāo)[15]。筆者在本文中研究了不同質(zhì)量濃度激素對(duì)梨愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響，并通過對(duì)梨懸浮培養(yǎng)條件的研究，建立了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，結(jié)果表明除要選擇疏松狀態(tài)的愈傷組織為材料進(jìn)行培養(yǎng)外，還要考慮到培養(yǎng)基的滲透壓、激素種類及質(zhì)量濃度，以及合適的轉(zhuǎn)速、繼代周期及繼代比例等，才能最終得到一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系。

前人研究表明，適宜的培養(yǎng)基激素種類及配比是愈傷組織以及細(xì)胞懸浮系快速增殖的關(guān)鍵因素[16-17]。本研究結(jié)果表明，2，4-D質(zhì)量濃度對(duì)愈傷的誘導(dǎo)與增殖起著關(guān)鍵作用，增殖量隨2，4-D質(zhì)量濃度升高而升高[18-20]，這與前人研究結(jié)果一致。李艷敏等[21]將2，4-D與NAA、KT 組合使用，作為芍藥花藥愈傷組織培養(yǎng)基。在適宜的增殖質(zhì)量濃度下，經(jīng)過4～5 次繼代后即可得到表面有顆粒狀突起結(jié)構(gòu)的疏松愈傷，與前人研究結(jié)果一致。2，4-D和6-BA搭配為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳組合，因此本試驗(yàn)采用MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-1 6-BA建立了懸浮細(xì)胞體系。還有其他文獻(xiàn)研究表明在懸浮細(xì)胞的長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)過程中添加KT（細(xì)胞分裂素），KT以一個(gè)較低質(zhì)量濃度，一般選擇為0.1 mol·L-1為宜，較高質(zhì)量濃度會(huì)造成褐化現(xiàn)象[22]。

在整個(gè)懸浮培養(yǎng)的過程中植物懸浮細(xì)胞開始培養(yǎng)時(shí)的接種量以及繼代周期、新舊培養(yǎng)基比例等是重要的影響因子，對(duì)于不同發(fā)育時(shí)期生長(zhǎng)周期的長(zhǎng)短及細(xì)胞生長(zhǎng)增殖周期有顯著影響。張正雪等[23]認(rèn)為起始接種量為3 g時(shí)生長(zhǎng)速率可達(dá)到最高，本研究起始接種量為1.5 g，究其原因可能是因?yàn)椴煌参锼枰淖畹团R界生長(zhǎng)密度不同。其新舊培養(yǎng)基比例為2∶1，梨懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈“S”型[24]，與前人研究一致。0～2 d為遲滯期，2～4 d為對(duì)數(shù)期，4～6 d為靜止期。在一個(gè)繼代周期內(nèi)，細(xì)胞的死亡率維持在23%以下，表明懸浮細(xì)胞狀態(tài)良好，活性很強(qiáng)。王磊等[25]研究表明接種15 d 是懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)的較佳時(shí)期。本文適宜繼代周期為7 d，與前人研究不同，這可能是因?yàn)槔嬗鷤M織在適宜的懸浮培養(yǎng)條件下分裂能力較強(qiáng)，導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分被過早的消耗殆盡，從而縮短了繼代周期。2～4 d 內(nèi)的細(xì)胞分裂最快，可以以此階段的細(xì)胞來(lái)開展各項(xiàng)研究。

細(xì)胞壁的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)因品種不同而不同，所以不同外植體的最佳酶液組合和濃度也不同。張寧等[26]研究表明如果酶液濃度過高，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體中毒和破裂；反之，如果濃度過低，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體成團(tuán)。杜小云等[27]用1%纖維素酶+0.5%離析酶+0.01%半纖維素酶組合，得到草莓懸浮系原生質(zhì)體；本文懸浮細(xì)胞酶液組合為1%纖維素酶+0.5%離析酶。

經(jīng)懸浮培養(yǎng)后的愈傷組織增殖快，活力強(qiáng)是良好的遺傳轉(zhuǎn)化的受體，但受品種、染液濃度和時(shí)間的影響，愈傷組織轉(zhuǎn)化率較低。李亞梅等[28]表明在浸染液濃度OD600為0.6～0.8 和浸染時(shí)間30 min 時(shí)，酸棗愈傷組織轉(zhuǎn)化效率超過20%。本文中，以O(shè)D600為0.5，浸染時(shí)間15 min 為最好，浸染30 min 的愈傷組織會(huì)在后期培養(yǎng)過程中被菌吞沒，造成褐化死亡。

4 結(jié)論

本研究以無(wú)菌的新梨7 號(hào)花藥為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，將其接種到1/2 MS+1.0 mg· L-1 2，4-D+0.4 mg·L-1 NAA+30 g ·L-1蔗糖+7 g ·L-1瓊脂的固體培養(yǎng)基上即可誘導(dǎo)出愈傷組織。將得到的疏松愈傷組織接種到MS+1.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+30 g ·L- 1 蔗糖的液體培養(yǎng)基中，在（26±1）℃，200 r ·min-1的黑暗條件下懸浮振蕩培養(yǎng)，每隔7 d 繼代1 次，新舊培養(yǎng)基比例2∶1，經(jīng)30 d 后獲得了良好的懸浮細(xì)胞系，懸浮液的顏色澄清透明，分散性及均一性好，生長(zhǎng)分裂速度快，活細(xì)胞率可達(dá)81.98%，近圓細(xì)胞率達(dá)83.66%；用懸浮細(xì)胞系提取的原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)3.67×106個(gè)·mL-1，活力可達(dá)92.00%，愈傷組織轉(zhuǎn)化率達(dá)20.00%。本研究結(jié)果為建立一套穩(wěn)定優(yōu)良的梨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系提供了理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。

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