■ 夏光浩 孫文濤 吳長榮 張鳴珠 楊 豐 陳 超,4 郝 俊,4*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.北京博農(nóng)利生物科技有限公司，北京 100085；3.貴州省草地技術(shù)試驗推廣站，貴州貴陽 550025；4.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽 550025)

植物單寧(plant tannins)，是一種相對分子質(zhì)量為500～3 000 的多酚類次生代謝產(chǎn)物，在植物根、莖、葉及果實中普遍存在，大多數(shù)具有生物學(xué)活性，對植物自身及植食性動物的生存有著重要作用[1]。早期研究把單寧視為植物飼料中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，因為單寧具有的廣譜抑菌性，以及可與消化酶和激素等結(jié)合的特性，高濃度植物單寧會降低反芻動物對飼料的吸收率[2]。然而，目前研究發(fā)現(xiàn)植物單寧除了上述負(fù)面影響外，還具有抑制青貯飼料蛋白質(zhì)降解、提高過瘤胃蛋白含量、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗氧化、抗炎等多功能積極作用[3-4]。因此，文章通過綜述植物單寧的理化性質(zhì)及其對青貯飼料品質(zhì)和瘤胃發(fā)酵的影響，以期為植物單寧作為一種環(huán)境友好型青貯添加劑在改善青貯飼料品質(zhì)及提高反芻動物健康方面提供理論支撐。

1 植物單寧的理化性質(zhì)

植物單寧又被稱為植物多酚，依據(jù)其化學(xué)組成可分為水解單寧（hydrolyzable tannins，圖1a[5]）和縮合單寧（condensed tannins，圖1b[5]）兩類[6]。水解單寧是由鞣花酸、沒食子酸、咀嚼酸等羧酸與葡萄糖通過酯化產(chǎn)生的化合物，化學(xué)活性較強(qiáng)，易在酸、堿、酶的作用下發(fā)生水解[7-8]。水解單寧在瘤胃發(fā)酵過程中可被反芻硒單胞菌（Selenomonas ruminantium）和鏈球菌屬（Streptococcus）等瘤胃微生物產(chǎn)生的酯酶、單寧?；饷噶呀鉃闆]食子酸和鞣花酸[9]。沒食子酸在瘤胃中脫羧產(chǎn)生鄰苯三酚，并轉(zhuǎn)化為間苯二酚和間苯三酚[10]?？s合單寧是由黃酮類物質(zhì)通過碳-碳雙鍵縮合而成的聚合物，化學(xué)活性較弱，難以水解[11]。盡管Simpson 等[12]早期研究發(fā)現(xiàn)，縮合單寧可被瘤胃微生物群落降解，但是目前關(guān)于縮合單寧自身在瘤胃發(fā)酵過程中的降解途徑及產(chǎn)物的信息較少，游離縮合單寧受瘤胃微生物的降解機(jī)制仍尚待研究[13]。

圖1 水解單寧(a)與縮合單寧(b)的結(jié)構(gòu)

縮合單寧具有較強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用, 且在成熟的豆科牧草、喬木及灌木中含量較高。飼喂含大量縮合單寧的飼料對反芻動物是有害的[14]。一方面，單寧苦澀且具收斂性，大量單寧與反芻動物唾液蛋白發(fā)生反應(yīng)會產(chǎn)生具有苦澀味的難溶物，降低飼料適口性，進(jìn)而減少采食量。有研究表明，當(dāng)縮合單寧含量超過飼草干物質(zhì)質(zhì)量的6%就會導(dǎo)致反芻動物的采食量嚴(yán)重下降[15]。另一方面，基于單寧-蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的性質(zhì)，單寧會與酶結(jié)合沉淀，從而抑制動物腸胃消化酶的活性[16]。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，單寧并非總對酶活性起到抑制作用。當(dāng)單寧濃度較低時，單寧使酶結(jié)構(gòu)變得更加卷曲，提高了酶的催化活性；當(dāng)單寧濃度較高時，則會抑制酶的催化活性[17]。

2 植物單寧對飼料青貯品質(zhì)的影響

2.1 植物單寧對青貯飼料蛋白質(zhì)降解的影響

青貯是利用植物表面微生物厭氧發(fā)酵的過程，能夠提高飼料適口性并使之長期保存[18]。然而，青貯過程中往往伴隨著大量蛋白質(zhì)水解，這是由植物本身及微生物的蛋白水解酶所造成的[19]。青貯完成后，飼料真蛋白含量相較于新鮮植物會損失80%，大量的真蛋白轉(zhuǎn)化為非蛋白氮，造成飼料營養(yǎng)價值嚴(yán)重降低[20]。蛋白質(zhì)含量是衡量青貯飼料營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)，青貯過程中蛋白質(zhì)降解大致分為兩個階段，即植物蛋白酶催化肽鍵水解產(chǎn)生游離氨基酸和肽，隨后被微生物進(jìn)一步脫氨形成氨或胺類化合物[21-22]。其中，青貯發(fā)酵前期蛋白質(zhì)降解最為嚴(yán)重，主要是植物蛋白酶（如羧肽酶、氨基肽酶、酸性蛋白酶）造成的[23]。

大量研究表明，植物單寧能有效減少青貯過程中氨態(tài)氮、肽氮、游離氨基酸等非蛋白氮的產(chǎn)生，對青貯飼料真蛋白具有良好的保護(hù)效果[24-27]。這是因為植物單寧通過抑制植物及微生物蛋白酶活性，從而減少對蛋白質(zhì)的水解[28]。例如，Guo等[29]研究發(fā)現(xiàn)，添加單寧導(dǎo)致了青貯苜蓿羧基肽酶及氨基肽酶活性的降低。此外，已有研究證明，即使在pH 3.5～7.0的青貯酸性環(huán)境下，單寧仍可與植物蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)保護(hù)蛋白質(zhì)[30]。例如，F(xiàn)itri 等[31]發(fā)現(xiàn)，青貯飼料的中性洗滌不溶蛋白含量和酸性洗滌不溶蛋白含量隨著單寧含量的增加而增加。中性洗滌不溶蛋白含量和酸性洗滌不溶蛋白含量的增加表明單寧與蛋白質(zhì)在青貯過程形成了具穩(wěn)定氫鍵的復(fù)合物，從而抵抗植物和微生物蛋白酶的降解。

由于水解單寧與縮合單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)上的不同，導(dǎo)致了其對青貯過程中蛋白質(zhì)降解的影響也有所區(qū)別。水解單寧具酚羥基，有較強(qiáng)的結(jié)合細(xì)胞膜蛋白及蛋白酶的親和力，其生物活性及沉淀蛋白質(zhì)能力較強(qiáng)，更有利于促進(jìn)過瘤胃蛋白含量的提高[32]。Jayanegara等[33]證明添加水解單寧對青貯過程中蛋白質(zhì)降解的抑制效果強(qiáng)于縮合單寧。此外，研究表明，植物單寧添加量與青貯飼料蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)[34-35]。結(jié)合蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，合理利用植物單寧，探索其對青貯過程中蛋白降解的作用效果，是長期以來飼料加工領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[36]。

2.2 植物單寧對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

除抑制蛋白質(zhì)降解外，植物單寧對青貯飼料pH、有機(jī)酸含量、有氧穩(wěn)定性及霉菌毒素含量等方面可起到調(diào)控作用，在畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展背景下有著巨大的應(yīng)用潛力[37-38]。植物單寧對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響是復(fù)雜的，添加不合適的單寧可能會導(dǎo)致青貯飼料乳酸及乙酸減少，降低青貯飼料的緩沖能力，從而抑制青貯飼料正常發(fā)酵[39]?？s合單寧與水解單寧對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響是不同的。盡管縮合單寧與水解單寧都能抑制蛋白質(zhì)降解，但縮合單寧提高了青貯飼料乳酸的含量，降低了pH；而水解單寧則導(dǎo)致了乳酸含量降低，并造成pH 升高[5]。然而，也有研究表明，水解單寧與縮合單寧混合添加比單獨(dú)添加一種單寧能更好地抑制青貯苜蓿干物質(zhì)損失，降低pH 以及減少氨態(tài)氮的產(chǎn)生[40]。氨態(tài)氮含量降低進(jìn)一步表明水解單寧與縮合單寧混合添加對青貯過程中微生物降解短肽及氨基酸的抑制作用。單寧最適添加量對不同青貯原料的影響也是不一致的。相較于添加1%干物質(zhì)質(zhì)量的單寧酸，2%的單寧酸更能提高桑葉及柱花草青貯飼料的抗氧化性，增加乳酸與乙酸含量，對青貯飼料品質(zhì)的改善效果更強(qiáng)[4]。而木薯植株青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)卻隨著添加縮合單寧濃度的增加而降低，添加縮合單寧延長了發(fā)酵時間，迫使木薯植株直到發(fā)酵56 d后才進(jìn)入穩(wěn)定儲存期[26]?？梢?，植物單寧的來源、化學(xué)組成結(jié)構(gòu)及添加量對不同植物原料都可能導(dǎo)致青貯發(fā)酵品質(zhì)差異。

2.3 植物單寧對青貯飼料微生物群落的影響

發(fā)酵過程中青貯飼料微生物群落的組成結(jié)構(gòu)影響發(fā)酵品質(zhì)，是決定青貯飼料品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵[41]。乳酸菌是青貯發(fā)酵過程中最重要的有益菌，在厭氧環(huán)境下以碳水化合物為發(fā)酵底物，產(chǎn)生有機(jī)酸降低環(huán)境pH，從而抑制如梭菌、大腸桿菌、芽孢桿菌等耐酸性較差的有害微生物[42]。近年來，植物單寧對青貯飼料細(xì)菌群落、真菌群落的影響已逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究報道，單寧對青貯飼料厭氧發(fā)酵期及有氧暴露期細(xì)菌群落多樣均有抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致乳酸及總揮發(fā)性脂肪酸濃度降低，但同時抑制了蛋白質(zhì)水解以及霉菌毒素的產(chǎn)生，提高了青貯飼料有氧穩(wěn)定性[43]。在細(xì)菌群落中，單寧可抑制大腸桿菌、梭菌、片球菌等細(xì)菌的生長；在真菌群落中，單寧可降低酵母菌、曲霉菌、青霉屬、鐮刀菌屬等真菌的豐度[44-45]。單寧避免了這些有害微生物在發(fā)酵前期大量消耗營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)干物質(zhì)的保存。尤其是大腸桿菌及梭菌發(fā)酵會產(chǎn)生丁酸，造成青貯飼料蛋白質(zhì)大量水解[46]。此外，添加單寧減少了由某些特定真菌代謝產(chǎn)生的黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素對飼料的污染，保證了飼料安全及促進(jìn)了反芻動物健康生長。

近期研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌與單寧的復(fù)合添加劑不僅能有效改善青貯飼料的品質(zhì)，還能緩解單獨(dú)添加高濃度單寧導(dǎo)致的負(fù)面作用[47]。Gao 等[48]篩選了4 株具較強(qiáng)耐單寧及產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌，分別與單寧混合添加到柱花草與全株大豆兩種植株中進(jìn)行青貯，結(jié)果表明，單寧+植物乳桿菌可降低青貯飼料pH、丁酸含量、氨態(tài)氮含量并能抑制有害微生物增殖。Chen等[49]添加植物乳桿菌與單寧到紫花苜蓿中進(jìn)行青貯，有利于植物乳桿菌主導(dǎo)發(fā)酵進(jìn)程，降低非蛋白氮含量，提高果膠酶活性，并促進(jìn)生黃瘤胃球菌（Rumincoccus flavefaciens）、棲瘤胃普雷沃氏菌（Prevotella ruminicola）等瘤胃微生物的生長，從而減少單寧對飼料消化的抑制作用。以上研究表明，植物單寧可通過調(diào)控青貯過程中微生物群落結(jié)構(gòu)影響飼料發(fā)酵品質(zhì)，但其中的代謝機(jī)制尚待探索。目前，植物乳酸菌與單寧混合添加效果較為良好，進(jìn)一步篩選耐單寧乳酸菌并與單寧混合添加是未來應(yīng)當(dāng)深入討論的重點(diǎn)。

3 植物單寧對青貯飼料瘤胃發(fā)酵的影響

3.1 植物單寧對青貯飼料瘤胃消化率的影響

青貯飼料在反芻動物體內(nèi)的消化吸收主要分為兩大部分：先經(jīng)過瘤胃微生物厭氧發(fā)酵分解，后進(jìn)入消化道被各種酶水解。青貯飼料在瘤胃的發(fā)酵產(chǎn)物（揮發(fā)性脂肪酸）可滿足反芻動物超過70%的能量需求，瘤胃發(fā)酵還能合成品質(zhì)上乘的微生物蛋白，可為反芻動物提供40%以上的蛋白質(zhì)需求量[50]。因此，探討添加植物單寧對青貯飼料瘤胃消化的影響具有重要意義?？偖a(chǎn)氣量、揮發(fā)性脂肪酸濃度及干物質(zhì)消化率等指標(biāo)可表明青貯飼料的營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃被微生物消化利用的狀況[51]。Teixeira 等[52]對比了三種雜交高粱青貯飼喂綿羊效果，發(fā)現(xiàn)不含單寧的青貯高粱有著更高的中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維消化率。Fitri 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，隨著柿子皮（富含植物單寧）添加量的增加，全混合日糧青貯飼料體外瘤胃發(fā)酵的總產(chǎn)氣量線性降低。然而，也有研究表明，添加低水平量(0.6%)的單寧酸可明顯增加紫花苜蓿瘤胃體外發(fā)酵的總產(chǎn)氣量[53]。相似地，添加低水平縮合單寧(0.6%)提高了青貯野火球飼料瘤胃體外干物質(zhì)降解率與瘤胃丙酸含量，減少了瘤胃丁酸含量[54]。由此可見，植物單寧對青貯飼料瘤胃消化的影響可能與單寧添加量有關(guān)，添加較低水平的植物單寧可促進(jìn)青貯飼料瘤胃消化利用。

3.2 植物單寧對過瘤胃蛋白的影響

過瘤胃蛋白在德國蛋白質(zhì)評估系統(tǒng)中指十二指腸可利用粗蛋白，是衡量飼料蛋白質(zhì)飼喂價值的決定性因素。過瘤胃蛋白由瘤胃微生物合成蛋白（MCP）和瘤胃未降解粗蛋白（RUCP）組成，其中MCP 由于含量高且品質(zhì)上乘而更加重要[55]。Kondo 等[56]研究發(fā)現(xiàn)，單寧可降低紅茶及綠茶渣青貯飼料的瘤胃蛋白降解率。Grosse 等[57]報道，紅豆草（富含縮合單寧）單獨(dú)青貯或與紅三葉混合青貯可降低瘤胃蛋白降解率并增加MCP 含量。這可能是通過抑制瘤胃蛋白降解菌[如嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacter amylophilus）、牛型鏈球菌（Streptococcus bovis）及溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）等]的生長，保護(hù)瘤胃蛋白[58]。瘤胃蛋白降解率降低及MCP 含量的增加，表明植物單寧可改善青貯飼料瘤胃蛋白的代謝供應(yīng)，提高氮有效利用率[59]。此外，單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物在瘤胃環(huán)境下（pH為5.0～7.0）結(jié)合能力較強(qiáng)，保護(hù)了部分蛋白免受瘤胃微生物的降解。當(dāng)復(fù)合物流經(jīng)pH＜2.5 的皺胃及pH＞8.0 的小腸時，單寧-蛋白質(zhì)結(jié)合能力迅速降低，蛋白質(zhì)被釋放，并在瘤胃蛋白酶和小腸胰蛋白酶的作用下被吸收利用，有利于提高RUCP 量[60]。Chen 等[34]添加單寧到紫花苜蓿中青貯，發(fā)現(xiàn)單寧在顯著增加MCP含量的同時還減少了飼料瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的溶解態(tài)氮（氮態(tài)氮，NH3-N）。相似地，由黑荊提取的植物單寧提高了青貯玉米的氨基酸供應(yīng)，并減少了瘤胃NH3-N含量[61]。NH3-N 作為瘤胃蛋白降解產(chǎn)物與合成MCP的前體物質(zhì)，其含量的減少與RUCP、MCP 含量的增加均有關(guān)，是影響瘤胃氮代謝效率不可忽視的重要因素。高濃度NH3-N可能會破壞瘤胃能氮平衡，不能有效轉(zhuǎn)化為MCP，最后大部分以尿素氮的形式排泄到外界，對環(huán)境造成污染[62]。

3.3 植物單寧對瘤胃甲烷合成的影響

反芻動物的瘤胃在進(jìn)行厭氧發(fā)酵青貯飼料時，會產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸、二氧化碳及溶解態(tài)氫，其中二氧化碳與溶解態(tài)氫會被瘤胃產(chǎn)甲烷菌利用合成甲烷[63]。甲烷是一種造成全球變暖的溫室氣體，占瘤胃總產(chǎn)氣量的30%～40%，減少反芻動物瘤胃甲烷產(chǎn)量，不僅能緩解氣候變暖趨勢，還能減少青貯飼料能量損失并提高飼料利用率[28]。大量研究表明，添加植物單寧有利于減少反芻動物瘤胃中甲烷的產(chǎn)生，且瘤胃甲烷含量會隨著單寧含量的增加而降低[33，35，49]。這可能是通過促進(jìn)瘤胃丙酸發(fā)酵消耗溶解態(tài)氫，從而造成甲烷合成底物不足，減少甲烷合成[64]。此外，甲烷含量與纖維消化率是負(fù)相關(guān)的，單寧通過與青貯飼料纖維結(jié)合或與微生物纖維消化酶結(jié)合，降低了纖維的可消化性，也會減少溶解態(tài)氫的釋放和甲烷的形成[65]。事實上，植物單寧抑制瘤胃甲烷產(chǎn)生的關(guān)鍵在于調(diào)控瘤胃微生物群落的組成結(jié)構(gòu)。瘤胃微生物主要包括細(xì)菌、原生動物和真菌，反芻動物與瘤胃微生物在長期進(jìn)化過程中建立了牢靠的共生關(guān)系。瘤胃是瘤胃微生物適宜的增殖場所，瘤胃微生物則是瘤胃發(fā)酵功能的重要執(zhí)行者。植物單寧對瘤胃原生動物有抑制作用，這是因為單寧所具有的酚類結(jié)構(gòu)破壞了原蟲細(xì)胞膜，絡(luò)合原蟲細(xì)胞代謝所必需的陽離子，并剝奪其生長所需底物[66]。單寧可通過抑制與產(chǎn)甲烷菌共生的瘤胃原蟲間接減少產(chǎn)甲烷菌[67]。Witzig 等[68]添加栗子樹單寧（chestnut tannins）到青貯飼草中，直接抑制了產(chǎn)[甲烷菌甲烷短桿菌（Methanosphaera）與斯氏甲烷球形菌（M.stadtmanae）]的生長，降低了瘤胃甲烷的產(chǎn)量。綜上所述，植物單寧可通過減少甲烷合成底物及調(diào)控瘤胃微生物群落，從而抑制甲烷的排放。

4 結(jié)論

植物單寧對青貯飼料發(fā)酵及瘤胃發(fā)酵階段都具有調(diào)控作用。其與蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，可減少青貯過程中蛋白質(zhì)的損失，降低瘤胃蛋白降解率，促進(jìn)瘤胃MCP 的合成，提高氮有效利用率。此外，植物單寧還可減少甲烷合成底物及調(diào)控瘤胃微生物群落減少甲烷合成，有利于畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展。不同來源、化學(xué)組成結(jié)構(gòu)及添加量的植物單寧對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響機(jī)制仍需加強(qiáng)研究。利用乳酸菌與單寧混合添加可能是改善青貯品質(zhì)的良好選擇，未來應(yīng)進(jìn)一步篩選耐單寧乳酸菌，并將其與植物單寧混合添加，以實現(xiàn)植物單寧在畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展中的科學(xué)應(yīng)用。