趙紫琰,陳倩倩,徐海洋,徐淋香

(1.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222005;2.江蘇海洋大學(xué) 海洋食品與生物工程學(xué)院,江蘇 連云港 222005;3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇連云港 222005;4.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇 連云港 222005)

Levan果聚糖是一種微生物功能性多糖,其主鏈由β-(2,6)果糖苷鍵連接而成,少量支鏈由β-(2,1)果糖苷鍵連接而成,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保濕及益生功能,廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)療領(lǐng)域[1]。Levan果聚糖在食品中充當(dāng)具有益生功能的食品添加劑,在化妝品行業(yè)中用作保濕劑,在醫(yī)療領(lǐng)域中用作各種大分子藥物的載體[2-4]。

Levan果聚糖可通過化學(xué)、微生物發(fā)酵以及酶法合成?；瘜W(xué)方法合成levan多糖過程復(fù)雜,產(chǎn)物難以分離純化且產(chǎn)物種類較單一。微生物發(fā)酵法產(chǎn)levan多糖是一種通過產(chǎn)糖菌株在含有高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵,經(jīng)過醇沉、離心、有機(jī)溶劑去蛋白等多種工藝處理后得到粗多糖產(chǎn)品的方法,該方法操作較簡便,但仍有許多不足之處,如發(fā)酵液容易污染、產(chǎn)物純度及產(chǎn)量較低等。近年來的研究發(fā)現(xiàn),酶法合成在生產(chǎn)levan方面具有更高的效率和產(chǎn)量,因此成為如今最有前景的技術(shù)[5]。酶法合成主要是指LSase在適當(dāng)條件下以高濃度蔗糖溶液為底物,催化形成levan果聚糖的方法。不同溫度、pH、底物濃度、酶液濃度等因素都會(huì)影響levan果聚糖的產(chǎn)量和分子量[6]。目前已有的LSase的活性和穩(wěn)定性無法滿足酶法合成levan的大規(guī)模生產(chǎn),所以尋找活性更強(qiáng)、效率更高的LSase對(duì)levan的產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化至關(guān)重要。

1 左聚糖蔗糖酶的分子結(jié)構(gòu)

左聚糖結(jié)構(gòu)式見圖1,左聚糖蔗糖酶分子結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1 左聚糖結(jié)構(gòu)式[7]Fig.1 Structural formula of levan

圖2 左聚糖蔗糖酶分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of levansucrase

LSase(levansucrase)屬于糖苷酶GH68家族的一類果糖基轉(zhuǎn)移酶,具有水解和轉(zhuǎn)移果糖基雙重活性,后者可生成高聚合度的levan果聚糖[5]。

LSase是一種在細(xì)胞外起作用的酶,其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中通常包括5個(gè)重要結(jié)構(gòu)區(qū)域:信號(hào)肽、N-末端結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)域和C-末端結(jié)構(gòu)域[8]。GH68家族叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box transcription factors,FTFs)都有3個(gè)高度保守的氨基酸序列,分別為共價(jià)催化基團(tuán)、廣義酸/堿催化基團(tuán)和過渡態(tài)穩(wěn)定基團(tuán),形成催化三聯(lián)體[9]。LSase的晶體結(jié)構(gòu)大多相似,催化結(jié)構(gòu)域均由5片折疊的β-螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)組成,形成一個(gè)帶負(fù)電荷、中心凹陷的袋狀結(jié)構(gòu)[10],每個(gè)β鏈都由4股扭曲的鏈組成,外層β股幾乎垂直于內(nèi)股。

2 左聚糖蔗糖酶的反應(yīng)機(jī)制

果糖基轉(zhuǎn)移酶是一種多功能酶,它能夠直接將蔗糖轉(zhuǎn)化為高度聚合的果聚糖。蔗糖可同時(shí)作為果糖基的供體和受體進(jìn)行反應(yīng),果糖、葡萄糖、低聚果糖及水分子都可作為受體結(jié)合由蔗糖產(chǎn)生的果糖基,所以該酶可催化聚合、轉(zhuǎn)移及水解3種不同的反應(yīng),見圖3。該酶的合成產(chǎn)物為菊粉時(shí)被命名為菊糖蔗糖酶,聚合產(chǎn)物為levan時(shí)被命名為LSase,LSase也可以合成由β-(2,1)糖苷鍵連接的菊粉型低聚果糖(FOS),或形成連接聚合物β-(2,6)鏈的分支點(diǎn)。

圖3 左聚糖蔗糖酶的3種反應(yīng)Fig.3 Three reactions of levansucrase

所有的LSase都能夠催化從蔗糖到各種受體分子的果糖殘基轉(zhuǎn)移,如蔗糖、合成的β-(2,6)糖苷鍵連接的低聚果糖以及分解出的單糖葡萄糖和果糖。根據(jù)酶的來源不同,在反應(yīng)過程中其與受體的親和力有顯著差異,來自革蘭氏陽性菌的LSase產(chǎn)生的低聚糖不會(huì)積累中間產(chǎn)物,如枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和唾液鏈球菌[11-13];而來自革蘭氏陰性菌的LSase產(chǎn)生高水平的低聚果糖,導(dǎo)致levan的產(chǎn)量較低,比如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、淀粉芽孢桿菌和丁香假單胞菌等[14-17]。來自革蘭氏陽性菌的β-呋喃果糖苷酶Ms FFase似乎是一個(gè)特例,因?yàn)樵撁讣词乖诟邼舛日崽堑沫h(huán)境下,也主要起水解作用,在蔗糖和乳糖混合物的情況下主要產(chǎn)生乳糖葡萄糖[18]。

雖然所有的LSase都產(chǎn)生高分子量的多糖,但其大小分布會(huì)有一定的差異。隨著酶與底物的反應(yīng),果聚糖鏈也在不斷增長[19],當(dāng)原始底物蔗糖耗盡時(shí),合成的聚合物用來充當(dāng)反應(yīng)供體。然后,具有轉(zhuǎn)移酶活性的LSase以外部切割的方式切割levan鏈的β-(2,6)糖苷鍵,導(dǎo)致末端果糖的連續(xù)釋放,直到反應(yīng)在分支點(diǎn)停止[20]。

LSase具有水解和轉(zhuǎn)移酶活的雙重特性[13],且水解度和轉(zhuǎn)移率在很大程度上取決于初始反應(yīng)條件,但在反應(yīng)過程中會(huì)有所不同。蔗糖最適宜的水解溫度為50～60 ℃,在較低溫度(10～40 ℃)下或初始蔗糖濃度較高時(shí)水解速率會(huì)降低,在蔗糖將近消化完全時(shí),水解會(huì)成為主要反應(yīng)。在反應(yīng)過程中加入氯化鈉或有機(jī)溶劑會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)移酶活性[21-23]。LSase的最適pH為5～7,但在大多數(shù)情況下,pH變化不影響水解酶活及轉(zhuǎn)移酶活[24]。來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的LSase在pH低于6時(shí)幾乎只以不溶性微纖維的形式催化合成的高聚合度levan,但在pH高于7時(shí)主要以可溶性二聚體的形式催化合成高聚合度levan[25]。

3 左聚糖蔗糖酶的分子改造

3.1 基于產(chǎn)物鏈長調(diào)控的分子改造

微生物來源的LSase在以蔗糖為底物合成levan時(shí),具有一定的規(guī)律性。即革蘭氏陽性菌來源的LSase天然合成的產(chǎn)物大多是高分子量的levan多糖,而革蘭氏陰性菌來源的LSase合成的產(chǎn)物多為低分子量levan。在不同微生物來源的LSase間存在5個(gè)高度保守的氨基酸殘基,分別為“-VWD-”、“-EWSG-”、“-RDP-”、“-DQIER-”和“-TISH-”。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn),兩種來源的LSase在殘基“-VWD-”上存在一定的差異,絕大部分的革蘭氏陽性菌 LSase 在該位置上表現(xiàn)為絲氨酸,而革蘭氏陰性菌LSase在該位置上替換成了丙氨酸。經(jīng)過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),在殘基“-TISH-”上也存在著差異,所有的革蘭氏陽性菌來源的 LSase 在該位置上表現(xiàn)為精氨酸,而革蘭氏陰性菌則表現(xiàn)為組氨酸。

將革蘭氏陰性菌來源的Brsp-LSase中的兩個(gè)特殊殘基位點(diǎn)替換成革蘭氏陽性菌來源的LSase中的絲氨酸和精氨酸。結(jié)果表明,改變第一個(gè)特殊位點(diǎn)的LSase轉(zhuǎn)糖苷活力和水解活力明顯下降;而在第二個(gè)特殊位點(diǎn)改變的LSase在以蔗糖為底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)不再合成長鏈和高分子量的levan,只能合成蔗果三糖,并且以6-蔗果三糖為主[26]。

3.2 酶的熱穩(wěn)定性改造

徐煒[27]通過蛋白序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)模擬、基因的定點(diǎn)飽和突變等方法,實(shí)現(xiàn)了Brsp-LSase的熱穩(wěn)定性改造。通過與GenBank登錄號(hào)的所有LSase相比對(duì),發(fā)現(xiàn)在404位氨基酸附近出現(xiàn)了一個(gè)“-TEXP-”的氨基酸保守區(qū)域(其中X代表可變殘基),且在該氨基酸中除了可變殘基“X”外,其余3個(gè)氨基酸殘基均呈現(xiàn)出高度的保守性,于是推斷404位氨基酸殘基對(duì)LSase的熱穩(wěn)定性存在影響。模擬出分子結(jié)構(gòu)后取合適的B-factor(溫度因子或原子位移參數(shù))值較高的區(qū)域,經(jīng)PCR處理得到突變體,之后引入疏水氨基酸,發(fā)生了β結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增強(qiáng)、活性口袋附近疏水環(huán)境的改善以及蛋白結(jié)構(gòu)N端和C端共同形成的“夾具”效應(yīng),從而增強(qiáng)了Brsp-LSase的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

Yu等[28]針對(duì)鏈霉菌Streptomycesdavawensis來源的菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造,通過增強(qiáng)酶催化活性口袋附近的分子間相互作用力,最終顯著提升了該酶的熱穩(wěn)定性,增強(qiáng)了該酶的實(shí)用性。

Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)通過在SacB-T305A中添加TPS-SacB-T305A的額外C端結(jié)構(gòu)域來首次構(gòu)建融合LSaseTPS-SacB-T305A,該結(jié)構(gòu)域涉及酶的熱穩(wěn)定性,將融合酶與游離SacB和SacB-T305A相比,融合酶產(chǎn)生的levan分子量分布表現(xiàn)出良好的改善效果。結(jié)果表明,在levan聚合時(shí),熔融TPS-SacB-T305A的最佳溫度比游離的SacB-T305A高15 ℃,融合酶在40 ℃下的半衰期增加到4倍以上。

4 左聚糖蔗糖酶催化不同分子量的levan果聚糖合成

反應(yīng)條件不僅會(huì)影響多糖的產(chǎn)率,而且會(huì)影響產(chǎn)物levan的平均分子量和支鏈數(shù),雙峰levan的合成是芽孢桿菌LSase的特殊性質(zhì)[30-32]。影響聚合物分子量的因素主要有酶濃度、溫度、離子濃度和可溶性有機(jī)溶劑。低濃度的枯草芽孢桿菌LSase通過促進(jìn)果聚糖鏈的延長有利于高分子量levan的合成,而初始底物濃度的影響可忽略不計(jì)[33-34]。有文獻(xiàn)表明,乙醇、聚乙二醇或乙腈的存在有利于高分子量levan的合成,而離子作用力的增加導(dǎo)致產(chǎn)物從雙峰型levan轉(zhuǎn)變?yōu)閱我坏头肿恿縧evan[35]。在高溫(50 ℃)下,地衣芽孢桿菌RN-01來源的LSase主要合成高分子量levan(612 kDa),但當(dāng)溫度降至30 ℃或加入氯化鈉時(shí),主要合成低分子量 levan(11 kDa)[36]。

近年來有研究報(bào)道,從枯草芽孢桿菌中表達(dá)出的SacB-T305A酶與海藻糖-6-磷酸合酶的C末端融合后產(chǎn)生一種新型酶——TPS-SacB-T305A,它可以將產(chǎn)物低分子量levan逆轉(zhuǎn)為高分子量levan[29]。重組后的酶被證明發(fā)生了糖基化反應(yīng),有助于緊密維持酶與糖鏈的結(jié)合,防止其脫落,以實(shí)現(xiàn)糖鏈的延伸。高分子量levan(約2 000 kDa)占總多糖的比例從約4%(由游離SacB-T305A催化)大幅提高到約91%(由TPS-SacB-T305A催化)。

表1 不同微生物來源LSase催化蔗糖產(chǎn)生levan多糖的研究Table 1 Study on the production of levan polysaccharides catalyzed by LSase from different microbial sources

5 左聚糖蔗糖酶的應(yīng)用

5.1 促進(jìn)levan果聚糖的生產(chǎn)

周穎[39]運(yùn)用水熱法制備出磁性納米粒子Fe3O4MNPs,驗(yàn)證結(jié)果表明該物質(zhì)具有良好的磁吸附性,被EDC-NHS共修飾后可與重組酶Ba-SacB共價(jià)結(jié)合成固定化酶Ba-SacB@Fe3O4MNPs,該固定化酶具有較好的穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該酶溫度和pH的穩(wěn)定性均高于游離酶,并且可以多次重復(fù)使用。實(shí)驗(yàn)測得在最適條件下,該固定化酶以蔗糖為底物的反應(yīng),蔗糖轉(zhuǎn)化率為63.42%,levan果聚糖的產(chǎn)率為37.81%。

5.2 生產(chǎn)低聚糖

在GH68家族里存在β-呋喃果糖苷酶,該酶在以蔗糖為底物時(shí)能夠?qū)Ｒ恍纬傻途厶荹46],因?yàn)?-蔗果三糖較珍貴,Abreu等[47]曾定性改造Schwanniomycesoccidentalis來源的β-Ffase合成6-蔗果三糖的能力,以產(chǎn)出更多的6-蔗果三糖。通過鏈長調(diào)控的手段控制產(chǎn)物的鏈長,使LSase失去形成長鏈levan的能力,可以有效提高其生產(chǎn)低聚果糖的能力。而對(duì)大腸桿菌重組酶Brsp-LSase的第327位基因進(jìn)行突變后得到突變體H327A,該酶在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生以6-蔗果三糖為主的蔗果三糖,其中 6-蔗果三糖的產(chǎn)量為 18.4 g/L,轉(zhuǎn)化率為9.2%。

5.3 調(diào)控不同分子量levan果聚糖的合成

Levan果聚糖的分子量和尺寸分布通常會(huì)涉及到蛋白質(zhì)和反應(yīng)介質(zhì),早于1988年人們就將定點(diǎn)誘變技術(shù)應(yīng)用于LSase的改造[48],通過突變革蘭氏陽性菌來源及革蘭氏陰性菌來源的LSase中的精氨酸或組氨酸,來降低共價(jià)中間產(chǎn)物果糖基的形成速率,使水解活性不受影響[49]。Bs-SacB中的殘基K373構(gòu)成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)被丙氨酸突變時(shí),能夠形成DP>6的低聚果糖;當(dāng)被精氨酸突變時(shí),其形成的產(chǎn)物DP>8。此外,在Y247位置上必須使用芳香族殘基,以確?？梢院铣蒁P>10的產(chǎn)物。

6 總結(jié)及展望

微生物來源的左聚糖具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保濕及益生的作用,LSase是以蔗糖為底物,經(jīng)過水解、轉(zhuǎn)移果糖基及聚合3種反應(yīng)形成不同聚合度的左聚糖。相較于化學(xué)合成及微生物發(fā)酵合成得到的左聚糖,酶法合成的左聚糖純度及產(chǎn)量更高,目前在最優(yōu)條件下,LSase的催化反應(yīng)能從500 g/L蔗糖中提取出(184±3) g/L的levan果聚糖。在此條件下,未來還需解決酶的大量獲取、酶的重復(fù)利用及如何高效快速獲得純凈的產(chǎn)物3個(gè)問題,如優(yōu)化產(chǎn)酶條件及提高酶活力來適應(yīng)市場對(duì)于該酶的需求;利用酶的固定化來實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)使用,提高生產(chǎn)效率,節(jié)約成本;目前大多使用乙醇醇沉的方法沉淀多糖,該方法提取率較低,亟待找尋更高效的產(chǎn)物提取純化的方法。盡管目前還存在著許多挑戰(zhàn),但科學(xué)技術(shù)的發(fā)展必將促進(jìn)該方法的完善,酶法產(chǎn)左聚糖也會(huì)在未來成為一種新的趨勢。