李春燕，張婭楠，薛金濤

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，河南 新鄉(xiāng) 453000；2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453002)

心腦血管疾病指由于高脂血癥、血液黏稠、動脈粥樣硬化、高血壓等引起的心臟、腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性疾病，心腦血管疾病是一類威脅人類健康的常見病[1-4]。課題組前期研究表明參藻籽膠囊對心腦血管疾病具有良好的預(yù)防和治療作用。參藻籽膠囊是由人參、紅球藻和葡萄籽三味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，其中人參的主要活性成分為人參皂苷類，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老和治療心血管疾病等作用[5-6]；紅球藻是一種淡水單胞綠藻，主要藥效成分為蝦青素，具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[7-9]；葡萄籽的主要藥效成分為白藜蘆醇，具有抗自由基損傷、保護(hù)心腦血管、降低膽固醇、防止動脈粥樣硬化等作用[10-11]。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法分別對人參、紅球藻和葡萄籽的活性成分提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，并篩選最佳輔料和制粒工藝，所制備的顆粒劑穩(wěn)定可行，成藥性良好。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司；UV-2700型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；萬分之一電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110754-200822)和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(批號：111535-200502)，中國食品藥品檢定研究院；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：A26M7L11981)，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇(分析純，批號20150907)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉、γ-氨基丁酸、羧甲基纖維素鈉和β-環(huán)糊精等，北京索萊寶科技有限公司；腸溶明膠空心膠囊(批號1387912)，安徽黃山膠囊股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝

人參采用回流提取法，按L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以人參皂苷含量和干膏重為指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對提取效果的影響。紅球藻采用乙醇浸提法，以蝦青素含量和干膏量為評價指標(biāo)，按L9(34)正交實(shí)驗(yàn)考察乙醇濃度、提取溫度和提取時間對提取效果的影響。葡萄籽采用乙醇加熱回流法，以白藜蘆醇含量干膏重為指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)研究乙醇濃度、料液比和提取時間對提取效果的影響。

1.2.2 人參皂苷含量測定

取人參皂苷對照品約16 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，作為對照品母液備用。精密量取對照品溶液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL的對照品溶液置于100 mL容量瓶中，并用50%乙醇溶液進(jìn)行定容，搖勻。以50%乙醇溶液做空白對照，在230 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取人參皂苷提取液0.5 mL至100 mL量瓶中，50%乙醇溶液定容，搖勻，測定吸光度，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算人參皂苷含量。

1.2.3 蝦青素含量測定

取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入無水乙醇振搖溶解，定容，搖勻，作為對照品母液備用。精密吸取0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL的對照品溶液，分別置于10 mL量瓶中，并且用80%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻。以80%乙醇溶液做空白對照，在481 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取提取液2.0 mL于10 mL容量瓶中，80%乙醇溶液定容，搖勻，測定吸光度，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蝦青素含量。

1.2.4 白藜蘆醇含量測定

精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品約10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入無水乙醇振搖溶解，定容，搖勻，作為對照品母液備用。精密吸取0.1 mL、0.15 mL、0.45 mL、0.55 mL、0.65 mL對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，并用90%乙醇溶液定容至刻度，搖勻。以90%乙醇溶液做空白對照，在306 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取提取液1 mL于100 mL容量瓶中，用90% 乙醇定容，搖勻，測定吸光度，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算白藜蘆醇含量。

1.2.5 干膏的制備

將藥液攪拌均勻，精密量取一定體積(人參-10 mL，紅球藻-15 mL，葡萄籽-15 mL)置已干燥并恒重的坩堝中，在105 ℃下干燥，測定干膏重量。

1.2.6 制粒工藝及裝膠囊

將不同種類的輔料(CMC-Na、β-環(huán)糊精和可溶性淀粉)分別與提取物干膏以不同比例(1∶1.5、1∶3和1∶6)研磨均勻，用不同比例的乙醇(60%、70%、85%和95%)做潤濕劑，擠壓顆粒，在60～70 ℃下干燥，干燥后用不同型號膠囊殼(0號、1號和2號)進(jìn)行填裝。

2 結(jié)果和討論

2.1 人參提取工藝的篩選

取人參皂苷線性溶液，在230 nm處測定吸光度，以溶液濃度與紫外吸收繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y= 0.0847x-0.0796，r2=0.9993。結(jié)果表明人參皂苷在3.20～9.61 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

以人參皂苷含量(60%)和干膏重(40%)兩個指標(biāo)加權(quán)分析，如表1所示。根據(jù)極性(R)大小判斷各因素對提取工藝的影響大小，極差越大，影響越大，故提取工藝各因素影響大小次序?yàn)橐掖紳舛?提取次數(shù)>料液比。每個因素下，各水平的比較主要參考均值(K)的大小，均值越大，該因素相應(yīng)的水平提取效果越好，故水提的最佳工藝為使用50%濃度的乙醇，加入10倍量的乙醇，回流提取3次。在大生產(chǎn)中，綜合考慮表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大生產(chǎn)中的時間成本和能源消耗，料液比6倍、8倍和10倍間差別不大，故定為6倍料液比更利于實(shí)際生產(chǎn)。

表1 人參提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental results of extraction process for radix ginseng

2.2 紅球藻提取工藝的篩選

取蝦青素線性溶液，在481 nm處測定吸光度，以溶液濃度與吸收度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.0304x+0.2716，r2=0.9993。結(jié)果表明蝦青素在6.24～14.56 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。以蝦青素含量(60%)和干膏重(40%)兩個評價指標(biāo)兩個指標(biāo)加權(quán)分析，如表2所示。由極性(R)大小可知，各因素影響大小依次為乙醇濃度>提取溫度>提取時間，結(jié)合均值(K)綜合分析，最佳提取工藝為乙醇濃度70%，提取溫度65 ℃，提取時間4.0 h。

表2 紅球藻提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of extraction process for red algae

2.3 葡萄籽提取工藝的篩選

取白藜蘆醇線性溶液，在306 nm處測定吸光度，以溶液濃度與吸收度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.1108x+0.0997，r2=0.9992。結(jié)果表明白藜蘆醇在1.01～6.57 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。以白藜蘆醇含量(60%)和干膏重(40%)兩個評價指標(biāo)兩個指標(biāo)加權(quán)分析，如表3所示。由極性(R)大小可知，各因素影響大小依次為乙醇濃度>提取時間>料液比，結(jié)合均值(K)綜合分析，最佳提取工藝為乙醇濃度80%，加入10倍量的乙醇，回流提取時間1.5 h。

表3 葡萄籽提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of extraction process for grape seed

2.4 制粒工藝及膠囊填裝

通過對輔料種類(CMC-Na、β-環(huán)糊精和可溶性淀粉)、輔料與藥材干膏比例(1∶1.5，1∶3和1∶6)和潤濕劑-乙醇濃度(60%，70%，85%和95%)等工藝的篩選，研究發(fā)現(xiàn)最佳制粒藝為以CMC-Na做為輔料，輔料與藥材干膏比例為1∶6，70%乙醇做潤濕劑。將制備好的顆粒分別填裝不同型號膠囊(0號、1號和2號)，0號膠囊裝量為(0.41±0.01)g，1號膠囊裝量為(0.31±0.04)g，2號膠囊裝量為(0.23±0.01)g。參照本處方的臨床用量，用0號膠囊殼進(jìn)行填裝最合適，劑量為每日3次，每次4粒。

3 結(jié) 論

心腦血管疾病是心血管疾病和腦血管疾病的統(tǒng)稱，一般表現(xiàn)為心臟、大腦以及全身組織發(fā)生缺血性或出血性病變等特征。心腦血管疾病對人們的生命健康造成重大威脅，特別是對50歲以上中老年人健康造成嚴(yán)重威脅，其具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，居各種死因首位，是居民健康的頭號殺手。隨著我國經(jīng)濟(jì)和社會的快速發(fā)展以及人口老齡化加劇，心腦血管疾病已成為影響我國公民健康的重要公共衛(wèi)生問題之一，當(dāng)前即使應(yīng)用先進(jìn)和完善的治療手段，仍可有50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理。國內(nèi)外的經(jīng)驗(yàn)表明，心腦血管疾病高危人群的早期發(fā)現(xiàn)、有效預(yù)防和干預(yù)具有良好的效果，成本效益較好[1-4]。課題組前期研究表明參藻籽膠囊對心腦血管疾病具有良好的預(yù)防和治療作用。

參藻籽膠囊是由人參、紅球藻和葡萄籽三味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，本研究以干膏重及人參皂苷、蝦青素和白藜蘆醇含量為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對對各藥材的提取工藝研究，并根據(jù)活性成分的極性、溶解性和穩(wěn)定性及藥材質(zhì)地，選擇不同的提取方法，對人參采用乙醇回流提取法，紅球藻采用乙醇浸提法，葡萄籽采用乙醇加熱回流法。制劑工藝采用濕法擠壓制粒法分析不同輔料和不同濃度潤濕劑的制粒效果。本制劑工藝可行性較強(qiáng)，科學(xué)合理，顆粒成藥性良好。上述工藝制劑方法可進(jìn)一步推廣到中藥其他生產(chǎn)過程和制劑工藝中，對于發(fā)展中藥現(xiàn)代化制劑方法，提高中藥制藥行業(yè)的技術(shù)水平具有重要意義。