婁純彪 蔡武勝 呂浩 魏傳付 李志超 曹慧*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250000

2.菏澤市第三人民醫(yī)院,山東 菏澤 274000

3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種慢性全身性骨骼疾病,由正常情況下嚴(yán)格調(diào)節(jié)的骨穩(wěn)態(tài)失衡所引起,其特征是源自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨細(xì)胞(osteoblasts,OB)骨形成減少與源自造血干細(xì)胞的破骨細(xì)胞(osteoclasts,OC)骨吸收增加,導(dǎo)致骨密度降低以及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。目前,診斷OP的首選技術(shù)是雙能X射線吸收測(cè)定法(dualenergy X-ray absorptiometry,DXA)掃描[2],雖然DXA很有價(jià)值,但由于特異性和敏感性有限,只能揭示已經(jīng)確定的骨骼結(jié)構(gòu)變化,而無(wú)法區(qū)分導(dǎo)致相同骨病理狀況的不同潛在原因[3]。同時(shí),目前可用的抗再吸收和合成代謝藥物僅導(dǎo)致骨礦物質(zhì)密度適度增加和非椎體骨折率適度降低,未滿(mǎn)足患者對(duì)更有效抗OP方法的需求[4]。因此,盡管OP的管理策略在過(guò)去幾年中取得了一些進(jìn)展,但導(dǎo)致OP的復(fù)雜分子機(jī)制以及潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的缺乏阻礙了其預(yù)防和治療的改進(jìn)[5]。

外泌體是直徑為40～100 nm的圓盤(pán)狀囊泡,作為細(xì)胞間天然高效的運(yùn)輸載體,通過(guò)配體-受體相互作用、內(nèi)吞作用、直接膜融合或信號(hào)通路傳導(dǎo)將其包含的多種生物活性分子遞送至靶細(xì)胞[6-7]。值得注意的是,非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)也存在于外泌體中,其主要由微小RNAs(micro RNAs,miRNAs)、長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)和環(huán)狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)組成,作為骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子在OP中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[8]。鑒于外泌體ncRNAs在眾多疾病中發(fā)揮出的治療潛力,外泌體ncRNAs可能成為探索OP發(fā)病機(jī)制和治療方法的新型生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。因此,本文總結(jié)了外泌體ncRNAs在OP中調(diào)控BMSCs成骨分化、OB骨基質(zhì)礦化、OC骨吸收、骨相關(guān)細(xì)胞活性和凋亡以及血管生成方面所發(fā)揮的作用,以確定與OP相關(guān)的外泌體ncRNAs的最新研究成果、潛在應(yīng)用和挑戰(zhàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 外泌體ncRNAs在OP中的調(diào)控機(jī)制

1 外泌體ncRNAs調(diào)控成骨分化

作為OB和脂肪細(xì)胞的共同祖細(xì)胞,BMSCs在骨穩(wěn)態(tài)、組織再生和整體能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。在衰老過(guò)程中,BMSCs會(huì)降低分化為OB的能力,但會(huì)增加分化為脂肪細(xì)胞的能力,這會(huì)造成骨質(zhì)流失從而導(dǎo)致OP[10]。因此,促進(jìn)BMSCs成骨分化,恢復(fù)骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡是OP防治研究的方向之一。Li等[11]發(fā)現(xiàn)源自正常BMSCs的外泌體在體內(nèi)改善了卵巢切除術(shù)(OVX)大鼠OP癥狀,在體外則促進(jìn)了OVX大鼠BMSCs的增殖和成骨分化,其機(jī)制與miR-186在外泌體中高表達(dá)并靶向抑制單極紡錘體結(jié)合蛋白1(mps one binder kinase activator protein 1,Mob1)表達(dá)有關(guān)。與之相反,Jiang等[12]發(fā)現(xiàn)從OP患者中提取的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來(lái)源的外泌體中miR-21表達(dá)明顯高于健康成人,用來(lái)自O(shè)P患者的外泌體處理的MSCs中成骨分化標(biāo)志物Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)表達(dá)顯著降低。同時(shí),Smad同源物7(SMAD7)被證實(shí)為miR-21直接靶點(diǎn),在OP患者中下調(diào),而SMAD7的過(guò)表達(dá)抑制ALP、OCN和Runx2表達(dá),證明了從OP患者中提取的MSCs衍生的外泌體miR-21通過(guò)靶向SMAD7從而抑制BMSCs成骨分化。

此外,Feng等[13]觀察到絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)患者血清中分離的外泌體中circ_0006859表達(dá)較健康患者明顯上調(diào),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circ_0006859過(guò)表達(dá)可以抑制OCN和ALP水平,促進(jìn)脂肪形成標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPα)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的水平,其作用機(jī)制是通過(guò)作為miR-431-5p的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA),促進(jìn)miR-431-5p靶基因Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,表明外泌體circ_0006859是PMOP的潛在生物標(biāo)志物,并通過(guò)海綿化miR-431-5p調(diào)節(jié)BMSCs中成骨和脂肪形成之間的平衡。

2 外泌體ncRNAs調(diào)控OB骨基質(zhì)礦化

OB是來(lái)自BMSCs的長(zhǎng)方體細(xì)胞,負(fù)責(zé)產(chǎn)生并維持骨骼結(jié)構(gòu),為骨基質(zhì)產(chǎn)生膠原蛋白(主要是Ⅰ型膠原),并調(diào)節(jié)隨后的基質(zhì)礦化,在體內(nèi)合成與礦化基質(zhì)相關(guān)的非膠原蛋白(包括唾液酸蛋白、OPN、OCN),而且通過(guò)分泌細(xì)胞因子或通過(guò)直接細(xì)胞接觸對(duì)OC的分化和活性造成影響[14-16]。OB譜系的發(fā)育和功能受到多種因素影響,ncRNAs作為主要因素之一,被認(rèn)為在OB增殖、分化、骨基質(zhì)礦化、活性和凋亡方面發(fā)揮重要作用[8]。最新的幾項(xiàng)研究探討了不同細(xì)胞衍生的外泌體和其攜帶的ncRNAs在調(diào)節(jié)OB骨基質(zhì)礦化中的作用。Zhang等[17]報(bào)道了攜帶miR-935的BMSCs衍生的外泌體與OVX大鼠的相關(guān)性,其通過(guò)將miR-935遞送到人成骨細(xì)胞系hFOB1.19中從而靶向并抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)水平,促進(jìn)hFOB1.19細(xì)胞增殖、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成。此外,OVX大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,抑制miR-935顯著降低骨密度(bone mineral density,BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)并增加骨小梁間隙(Tb.Sp),證明了BMSCs衍生的外泌體miR-935通過(guò)靶向STAT1促進(jìn)hFOB1.19細(xì)胞的增殖、分化和礦化。同樣,Yang等[18]證明了攜帶lncRNA MALAT1的BMSCs衍生的外泌體促進(jìn)了hFOB1.19細(xì)胞增殖、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成,其機(jī)制是作為miR-34c的ceRNA以促進(jìn)特異AT序列結(jié)合蛋白2(SATB2)表達(dá),OVX小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明miR-34c逆轉(zhuǎn)了MALAT1的作用,SATB2逆轉(zhuǎn)了miR-34c的作用,證明了BMSCs衍生的外泌體lncRNA MALAT1通過(guò)介導(dǎo)miR-34c/SATB2軸促進(jìn)hFOB1.19細(xì)胞增殖、分化和礦化并有效減輕OP癥狀。

慢性炎癥是OP的直接誘因[19]。巨噬細(xì)胞是一類(lèi)免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,分為M1促炎表型和M2抗炎表型。據(jù)報(bào)道,巨噬細(xì)胞向M1表型的極化會(huì)導(dǎo)致小鼠骨溶解[20],以及在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程中分泌外泌體[21]。Yu等[22]在OVX小鼠中觀察到BMD降低和Tb.N減少,在用M1巨噬細(xì)胞衍生的外泌體處理后則進(jìn)一步加重了骨質(zhì)流失,進(jìn)一步的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M1巨噬細(xì)胞衍生的外泌體處理的MC3T3-E1細(xì)胞中miR-98水平顯著上調(diào),通過(guò)靶向雙特異性磷酸酶-1(DUSP1)激活其介導(dǎo)的JNK信號(hào)通路,降低MC3T3-E1細(xì)胞中成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)、Runx2、ALP表達(dá)和減少礦化結(jié)節(jié)形成,從而推動(dòng)骨質(zhì)流失和OP的發(fā)展。

3 外泌體ncRNAs調(diào)控OC介導(dǎo)的骨吸收

骨骼的重塑是一個(gè)緊密耦合的過(guò)程,OC作為人體唯一的骨吸收細(xì)胞,對(duì)骨重塑至關(guān)重要。OC是由破骨前體細(xì)胞融合產(chǎn)生的多核細(xì)胞,具有溶解骨基質(zhì)的能力,通過(guò)在吸收區(qū)分泌H+、Cl-、組織蛋白酶K和基質(zhì)金屬蛋白酶以響應(yīng)巨噬細(xì)胞集落來(lái)刺激因子和NF-κB配體的受體激活劑[23]。OC性骨吸收增強(qiáng)是PMOP、糖皮質(zhì)激素性O(shè)P和炎癥相關(guān)OP等疾病快速骨質(zhì)丟失的主要原因[24]。因此,通過(guò)外泌體ncRNAs調(diào)節(jié)OC生成和功能從而抑制骨吸收可能是減少快速骨丟失和防治OP的有效手段。

促炎細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等,可以增加OC生成,促進(jìn)骨吸收,從而導(dǎo)致OP[25]。Zhang等[26]通過(guò)建立細(xì)胞和糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型,評(píng)估攜帶miR-146a的脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)衍生的外泌體的抗炎作用,發(fā)現(xiàn)外泌體miR-146a給藥可有效抑制高糖誘導(dǎo)的OC中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及骨吸收,并恢復(fù)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病性O(shè)P大鼠的骨丟失,其機(jī)制是外泌體miR-146a通過(guò)抑制TNF-α、IL-18和IL-1β的表達(dá),誘導(dǎo)NLRP3炎性體失活,最終降低OC骨吸收能力并恢復(fù)骨丟失。

骨髓微環(huán)境中年齡相關(guān)分子的改變是OP的驅(qū)動(dòng)力之一,這些分子通過(guò)調(diào)節(jié)OB和OC的活性來(lái)抑制骨形成并促進(jìn)骨吸收,從而導(dǎo)致與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失[27]。Xu等[28]觀察到來(lái)自老年大鼠的BMSCs中衰老相關(guān)分泌表型和成脂分化的增加以及成骨分化和干性的減少,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-31a-5p隨著B(niǎo)MSCs的衰老而顯著增加,并通過(guò)外泌體分泌到細(xì)胞外微環(huán)境中,然后使用外泌體作為載體的miR-31a-5p不僅通過(guò)靶向SATB2和E2F轉(zhuǎn)錄因子2(E2F2)分別調(diào)節(jié)BMSCs在成骨和細(xì)胞衰老中的功能,而且通過(guò)靶向RAS同源基因家族成員A(RhoA)正向調(diào)節(jié)OC分化,證明了外泌體miR-31a-5p可作為OB和OC生成的重要調(diào)節(jié)因子,在調(diào)節(jié)衰老骨髓微環(huán)境中的骨形成和骨吸收方面發(fā)揮重要作用。此外,他們還發(fā)現(xiàn)在骨髓中應(yīng)用antagomiR-31a-5p可減少與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失,為年齡相關(guān)性骨丟失提供了一項(xiàng)潛在的生物治療策略。

4 外泌體ncRNAs調(diào)控骨相關(guān)細(xì)胞活性和凋亡

OB數(shù)量的維持有利于骨重塑過(guò)程中骨的形成,而OB的數(shù)量不僅取決于成熟細(xì)胞的生產(chǎn),還與OB的存活率密切相關(guān)。因此,在OP防治中不僅需要促進(jìn)OB增殖、分化和基質(zhì)礦化功能的發(fā)揮,還需要保持OB活性并抑制其凋亡,以維持其正常數(shù)量。Qiu等[29]在OVX大鼠血清中發(fā)現(xiàn)miR-150-3p、Runx2、OSX明顯減少,通過(guò)注射BMSCs衍生的外泌體可有效改善大鼠OP癥狀,其治療效果受到外泌體中miR-150-3p水平的正向調(diào)控,同時(shí)在體外觀察到外泌體可有效促進(jìn)OVX大鼠中OBs的增殖、分化,增加OB活力并抑制其凋亡,并同樣受到外泌體中miR-150-3p水平的正向調(diào)控,證明了BMSCs衍生的外泌體攜帶的miR-150-3p在OP中的積極治療效果。Peng等[30]發(fā)現(xiàn)從BMSCs中提取的外泌體顯著促進(jìn)了HFOB1.19向成骨細(xì)胞的分化,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BMSCs衍生的外泌體中富含miR-196a,并可將miR-196a傳遞到HFOB1.19細(xì)胞,靶向并抑制Wnt通路抑制因子(Dickkopf-1)從而激活Wnt/β-catenin通路以促進(jìn)成骨分化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率明顯降低,同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-6表達(dá)明顯下降,而抑制miR-196a時(shí)外泌體將無(wú)法發(fā)揮作用,證明了BMSCs衍生的外泌體傳遞的miR-196a通過(guò)靶向Dickkopf-1激活Wnt/β-catenin通路,在促進(jìn)OB分化,抑制OB凋亡中發(fā)揮重要作用。

在OP的發(fā)病機(jī)制中,TNF-α作為一種促炎細(xì)胞因子,已被證實(shí)可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和凋亡抑制OB分化和骨形成[31-32]。Wang等[33]將TNF-α誘導(dǎo)的OB與ADSCs衍生的外泌體或經(jīng)lncRNA KCNQ1OT1修飾的ADSCs衍生的外泌體共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)TNF-α劑量依賴(lài)性地增加miR-141-5p表達(dá),抑制OB活力并促進(jìn)其凋亡,ADSCs衍生的外泌體可以減弱TNF-α誘導(dǎo)的OB的細(xì)胞毒性和凋亡,與之相比,lncRNA KCNQ1OT1修飾的ADSCs衍生的外泌體通過(guò)海綿化miR-141-5p發(fā)揮更顯著的抑制作用。類(lèi)似的,Cao等[34]發(fā)現(xiàn)用TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞可降低細(xì)胞活力并以劑量依賴(lài)性方式增加凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、切割型caspase-3(c-caspase-3)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增加miR-146a表達(dá),而與源自circ-Rtn4修飾的BMSCs的外泌體共培養(yǎng)則通過(guò)海綿化miR-146a,抑制了TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞caspase-3、c-caspase-3和Bax表達(dá),減弱了細(xì)胞毒性和凋亡。

廢用性骨質(zhì)疏松癥(disuse osteoporosis,DOP)是由于缺乏機(jī)械應(yīng)力刺激而導(dǎo)致的,與PMOP和老年性骨質(zhì)疏松癥(senile osteoporosis,SOP)具有共同的特征,包括低骨量和骨組織的微結(jié)構(gòu)退化,同時(shí)使人的骨折易感性增加[35]。Yang等[36]研究了源自MSCs的外泌體在DOP中的功能,發(fā)現(xiàn)來(lái)自DOP大鼠模型的BMSCs中Bax和c-caspase-3表達(dá)水平顯著升高,而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)衍生的外泌體處理后表達(dá)水平明顯受到抑制,高通量miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-1263的水平在差異表達(dá)的miRNAs中最為豐富,同時(shí)外泌體miR-1263可以直接靶向并抑制Mob1從而抑制Hippo信號(hào)通路的激活,逆轉(zhuǎn)了體外DOP中BMSCs的凋亡。同時(shí),他們還在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠DOP的改善和骨量的增加,證明了源自HUCMSCs的外泌體miR-1263可有效抑制BMSCs凋亡和預(yù)防DOP的發(fā)生發(fā)展。

5 外泌體ncRNAs調(diào)控血管生成

考慮到成骨和血管生成之間的聯(lián)系,越來(lái)越多的研究開(kāi)始研究OP的發(fā)生發(fā)展與血管生成之間的關(guān)系[37]。這兩者之間被廣泛接受的關(guān)系是血管生成減少引起OP,促進(jìn)局部血管生成則會(huì)減輕OP[38]。Lu等[39]探索了衰老OB衍生的外泌體中miRNAs如何影響衰老過(guò)程中的人血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs),發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在衰老的OB及其外泌體中高表達(dá),將HUVECs和衰老OB共培養(yǎng)后,miR-139-5p在HUVECs中也上調(diào),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p可以通過(guò)靶向T盒轉(zhuǎn)錄因子1(TBX1)促進(jìn)HUVECs的凋亡和衰老,抑制其增殖和遷移,證明了衰老OB衍生的外泌體介導(dǎo)的miR-139-5p通過(guò)外泌體途徑靶向TBX1調(diào)控HUVECs功能。同樣,Liu等[40]報(bào)道了BMSCs衍生的外泌體可以被HUVECs攝取并促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BMSCs衍生的外泌體中miR-29a水平較高,并通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)到HUVECs中以靶向血管生成抑制因子1(VASH1)的方式調(diào)節(jié)血管生成。此外,載有miR-29a的外泌體在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出很強(qiáng)的促進(jìn)血管生成和成骨的能力,表現(xiàn)為顯著增加的BMD、BV/TV、Tb.N和較低的Tb.Sp,最終證明了BMSCs衍生的外泌體攜帶的miR-29a通過(guò)靶向VASH1調(diào)節(jié)血管生成和成骨,可作為OP的潛在治療靶點(diǎn)。詳見(jiàn)表1。

表1 外泌體ncRNAs在OP中的調(diào)控機(jī)制

6 總結(jié)和展望

本綜述重點(diǎn)關(guān)注了外泌體的ncRNAs在OP中調(diào)控BMSCs成骨分化、OB骨基質(zhì)礦化、OC骨吸收、骨相關(guān)細(xì)胞活性和凋亡以及血管生成方面所發(fā)揮的作用,這些ncRNAs都具有特定的特性,控制著其靶基因的表達(dá)和mRNA的穩(wěn)定,影響著一個(gè)或多個(gè)骨代謝過(guò)程中的關(guān)鍵基因表達(dá)。更重要的是,它們經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)富集在外泌體中,而且?guī)缀跛械募?xì)胞類(lèi)型都可以分泌外泌體。因此,這些包裹著豐富ncRNAs的外泌體滿(mǎn)載貨物穿梭在BMSCs、OBs、OCs之間,在骨重塑過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來(lái),不同來(lái)源的外泌體攜帶的ncRNAs被不斷鑒別和研究,并被認(rèn)可為OP的新型生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。當(dāng)然,由于這一研究領(lǐng)域的涉足時(shí)間較短,也不可避免地存在一些不足。首先,目前的研究?jī)H限于體外細(xì)胞和動(dòng)物模型展開(kāi),而未有作為治療手段進(jìn)入臨床應(yīng)用的報(bào)道出現(xiàn)。其次,lncRNAs和circRNAs都可以通過(guò)海綿化miRNAs來(lái)影響OP進(jìn)程,而有關(guān)lncRNAs和circRNAs的研究相對(duì)較新較少,例如外泌體circRNAs在OC中的調(diào)節(jié)作用至今未有報(bào)道,但作為重要的調(diào)節(jié)因子,其治療潛力是毋庸置疑的。同時(shí),ncRNAs在不同疾病中也同時(shí)發(fā)揮著不同的調(diào)控作用,因此,有必要探索它們與OP及其他疾病之間的聯(lián)系機(jī)制,例如尋找骨相關(guān)疾病之間的共性,這可能有助于使用外泌體ncRNAs進(jìn)行治療。最后,實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?biāo)準(zhǔn)、外泌體分離純化方法的標(biāo)準(zhǔn)、樣本量的標(biāo)準(zhǔn)等一系列標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題也等待明確?？傊?外泌體ncRNAs的研究仍然存在挑戰(zhàn),但具有一定的潛力,外泌體ncRNAs的深入研究在幫助開(kāi)發(fā)新的OP診斷和治療策略中具有重要意義。