張志慧，李雨凝，張光耀，周大勇，2，宋亮，2*，邵振文

（1.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.青島海智源生命科技有限公司，山東 青島 266200）

火麻仁分離蛋白（hemp seed protein isolate，HPI）具有豐富的必需氨基酸，是公認的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)資源。雖然我國工業(yè)火麻種植量以及火麻仁產(chǎn)量巨大，但缺乏對火麻仁的精深研究與開發(fā)利用，市場上火麻仁的高附加值產(chǎn)品也相對匱乏，造成火麻仁資源極大浪費[1]。HPI 中含量較高的二硫鍵易形成分子間二硫鍵，能使蛋白質(zhì)分子在中性條件下聚集沉淀，從而導致其溶解性、持水性、起泡性等功能性較差，限制其在食品工業(yè)中的應用[2]。因此，通過對HPI 進行結(jié)構(gòu)修飾以提高其功能性質(zhì)，有益于HPI 資源在食品工業(yè)中的應用。

乳液凝膠體系作為一種典型的食品體系，在食品領(lǐng)域的應用前景廣闊。許多常見食品，例如蛋黃醬、冰淇淋、酸奶等均屬于乳液凝膠體系[3]。已有文獻報道，基于大分子復合物穩(wěn)定的乳液凝膠，其復合物分子間的靜電相互作用有助于形成致密的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[4]。丁儉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，天然的大豆蛋白與大豆可溶性多糖結(jié)合后乳化性較差，但通過超聲預處理可以提高乳化性，同時增強乳液的凍融穩(wěn)定性。耿肖倩[6]研究發(fā)現(xiàn)，天然米渣蛋白溶解性較差，需要先通過酶解的方法得到改性蛋白，再與黃原膠進行復合，所得到的復合物具有較好的穩(wěn)定乳濁液得能力。Cabezas 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，加熱預處理（90 ℃，15 min）后得到的乳清蛋白與可溶性大豆多糖復合形成的乳液具有更高的凍融穩(wěn)定性和耐酸穩(wěn)定性。

動態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microflu idization，DHPM）是一種新興的高壓物理技術(shù)，具有處理時間短、處理溫度低、營養(yǎng)損失少、外源物質(zhì)添加少的優(yōu)點[8]，近年來常被應用于改善蛋白質(zhì)等生物大分子的理化性質(zhì)和功能特性。Ge 等[9]研究發(fā)現(xiàn)DHPM 可顯著提高杜仲籽粕蛋白的溶解度和乳化特性；敬思群等[10]利用DHPM 對大豆分離蛋白/多糖復合溶液進行處理，發(fā)現(xiàn)DHPM 產(chǎn)生的超高壓有利于蛋白質(zhì)與多糖有效結(jié)合，形成復合物。目前，基于DHPM 技術(shù)修飾改性蛋白質(zhì)以構(gòu)建乳液凝膠體系的研究鮮見報道。

本研究采用DHPM 技術(shù)對HPI 進行改性，將改性后的蛋白與黃原膠（xanthan gum，XG）進行復配得到HPI/XG 復合物，并將復合物作為乳化劑，以亞麻籽油為油相構(gòu)建Pickering 乳液凝膠。通過質(zhì)地、微觀結(jié)構(gòu)、流變特性等指標考察HPI/XG 不同復配質(zhì)量比對所得乳液凝膠理化性質(zhì)的影響，并進一步揭示乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性與貯藏穩(wěn)定性的變化規(guī)律，為植物蛋白基乳液凝膠的構(gòu)建及其在食品體系的應用提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂火麻蛋白粉（純度≥75%）：遼寧俏牌生物科技有限公司；亞麻籽油（α-亞麻酸含量約53%）：青島海智源生命科技有限公司；黃原膠（生物試劑）：上海源葉生物科技有限公司；硫酸亞鐵（分析級）：天津市大茂化學試劑廠；硫氰酸銨、硫代巴比妥酸（均為分析級）：國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇、異丙醇、異辛烷、甲醇、三氯甲烷（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

納米對撞機（NCJJ7/200）：廊坊通用機械制造有限公司；均質(zhì)分散機（T25）：德國IKA 公司；高速冷凍離心機（CR22N）：日本HITACHI 公司；多功能酶標儀（M200）：瑞士TECAN 公司；熒光倒置顯微鏡（Ti-s）：日本Nikon 公司；流變儀（Discovery HR-2）：美國TA公司；紫外可見分光光度計（UV-2100B）：美國安捷倫公司；電熱恒溫干燥箱（PH-05A）：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPI 的制備

HPI 的制備參照Feng 等[11]的方法。脫脂火麻蛋白粉以1∶20（g/mL）的料液比分散于蒸餾水中，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)懸浮液的pH 值至10.0，40 ℃水浴攪拌2 h，室溫下8 000×g 離心15 min 收集上清液。用1 mol/L HCl 將收集的上清液調(diào)至pH5.0，于4 ℃、8 000×g離心15 min，分離沉淀蛋白。最后將所得樣品收集并凍干，待用。

1.3.2 DHPM 處理

將HPI 凍干粉分散于去離子水中（50 mg/mL），室溫攪拌過夜，使蛋白質(zhì)充分水化。利用均質(zhì)分散機以10 000 r/min 對蛋白溶液進行5 min 預處理，將得到的HPI 懸浮液通過動態(tài)高壓微射流60 MPa 處理3 個循環(huán)。將DHPM 處理后的HPI 樣品存放于4 ℃，備用。

1.3.3 HPI/XG 復合物的制備

HPI/XG 復合物的制備參照沈可潔等[12]的方法。DHPM 處理后的HPI 樣品配制成5%的懸浮液，將pH值調(diào)為3，充分攪拌2 h，保證蛋白質(zhì)充分水合。用pH值為3 的蒸餾水，配制1%的XG 溶液，室溫下攪拌2 h。將充分水合的HPI（60 MPa，5%）溶液與XG（1%）分別按質(zhì)量比5∶1、2∶1、1∶1、1∶2 混合，于25 ℃、500 r/min攪拌2 h。

1.3.4 Pickering 乳液凝膠的制備

HPI（經(jīng)DHPM 處理）與XG 質(zhì)量比分別為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2，純XG 為乳化劑，添加26%的油相，采用均質(zhì)分散機（10 000 r/min，2 min）制備乳液凝膠[12]。

1.3.5 乳液凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

采用熒光倒置顯微鏡觀察乳液凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。取少量乳液樣品滴至載玻片，放置好蓋玻片，倒置于載物臺，用20 倍物鏡觀察乳液液滴的形態(tài)。

1.3.6 乳液凝膠流變特性的測定

參照Zhang 等[13]的方法對乳液凝膠流變特性進行測定。

1.3.7 乳液凝膠凍融穩(wěn)定性的測定

凍融穩(wěn)定性的測定參考黃子璇等[14]的方法進行。將制得的乳液樣品均放置于密閉玻璃管中，進行3 次同樣的冷凍-融化循環(huán)，并對每次復溫樣品的微觀形態(tài)（同1.3.5）及流變特性（同1.3.6）進行測定。

1.3.8 乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性的測定

參照Zeng 等[15]的方法對乳液凝膠的貯藏穩(wěn)定性進行測定。取10 mL 乳液凝膠置于玻璃管中，60 ℃烘箱中貯藏7 d，取樣測定貯藏0、3、5、7 d 的脂肪的過氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）含量、共軛二烯烴（conjugated diolefine，CD）含量、共軛三烯烴（conjugated triene，CT）含量來確定乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性。

1.3.8.1 過氧化值（POV）的測定

參照Zeng 等[15]的方法，測定貯藏過程中POV。

1.3.8.2 硫代巴比妥酸值（TBARS）含量的測定

參照Wang 等[16]的方法測定貯藏期間TBARS 的含量。

1.3.8.3 共軛二烯烴與共軛三烯烴含量的測定

參照Koh 等[17]的方法測定貯藏期間共軛二烯烴（CD）、共軛三烯烴（CT）的含量。0.15 g 乳液樣品于5 mL異丙醇中稀釋，12 000 ×g 離心5 min，取1 mL 上清液加入到2 mL 異丙醇中，使用紫外可見分光光度計測定233（CD）、268 nm（CT）處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標的測定均重復進行3 次，試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用ANOVA 分析和Tukey's 檢驗進行統(tǒng)計學分析。不同英文字母表示存在顯著性差異（p<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳液凝膠的形貌

圖1 為DHPM 處理后的HPI（60 MPa）、HPI/XG 復合物和純XG 制備的油相含量為26%的乳液凝膠的直觀圖。

圖1 乳液凝膠外觀Fig.1 Appearance of emulsion gel

由圖1 可知，HPI 與5∶1 試驗組乳液均呈現(xiàn)較強的流動性。HPI/XG 復合物與純XG 的乳液凝膠均可觀察到固體狀外觀和良好的自持性能，倒置不流動。

采用熒光倒置顯微鏡觀察乳液凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，如圖2 所示。

圖2 乳液凝膠的微觀形貌Fig.2 Microscopic images of emulsion gel

由圖2 可以看出，在酸性條件下，DHPM 處理后的HPI 不具備凝膠形態(tài)，且液滴絮凝不穩(wěn)定；純XG 穩(wěn)定的乳液凝膠雖具備凝膠特征，但易發(fā)生聚集；然而，酸性條件下HPI 與XG 可以通過靜電吸引形成復合物，從而極大程度地降低了乳液凝膠的粒徑、提高了乳液凝膠穩(wěn)定性[18]。在HPI 與XG 質(zhì)量比為5∶1 時，可觀測到較大的聚集體，可能是由于XG 與HPI 表面電荷完全中和，形成聚集體。但隨XG 添加量增加，視野中的液滴尺寸明顯減小、分布更加均勻，原因可能是電荷完全中和后，繼續(xù)增加XG 添加量，溶液中與HPI 作用的電荷增加，沉淀減少，過量XG 會再次破壞復合物重新形成團聚體[19]。

2.2 乳液凝膠的流變特性分析

乳液凝膠的流變特性如圖3 所示。

圖3 乳液凝膠的流變特性Fig.3 Rheological properties of emulsion gel

由圖3A 可知，隨XG 添加量的增加G′明顯增大，隨著振幅的增加，結(jié)構(gòu)被破壞，表現(xiàn)為儲能模量G′和損耗模量G″產(chǎn)生交叉點，主要是應力破壞乳液液滴結(jié)構(gòu)使液滴重排[20]。由圖3B 可知，當頻率為0.1～10 Hz時，所有樣品G′大于G″，說明所有樣品均具有以彈性為主導的黏彈性能。隨著XG 添加量的增加，乳液樣品G′增加，表明乳液凝膠的黏彈性增強，可能是因為XG的加入使液滴減小，單位接觸面積增加，增強了液滴間的作用力[21]，促進了乳滴之間形成更強的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由圖3C 可知，所有乳液的表觀黏度均隨著剪切速率的增大而降低，呈現(xiàn)典型的剪切變稀現(xiàn)象?？赡苁怯捎谳^高的剪切速率破壞了乳滴之間的非共價相互作用[22]。XG 添加量的增加，增強了乳滴之間相互作用，增強了乳液凝膠的表觀黏度和抗剪切的能力。

2.3 乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性分析

圖4 為乳液凝膠凍融后的直觀圖。

圖4 乳液凝膠凍融后外觀Fig.4 Appearance of freeze-thaw emulsion gel

由圖4 可知，HPI 與XG 以不同質(zhì)量比（5∶1、2∶1、1∶1、1∶2）和純XG 制備的乳液凝膠3 次凍融循環(huán)后均未發(fā)生明顯的破乳或油析現(xiàn)象，仍具備自支撐的凝膠特性，說明添加XG 有助于提升乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性，而純HPI 制備的乳液1 次凍融循環(huán)后即出現(xiàn)了嚴重的破乳與相分離現(xiàn)象。結(jié)果表明，XG 與HPI 復配可以增強乳液凝膠的黏彈性，同時提高乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性。

圖5 為乳液凝膠動凍融后的微觀形貌。

圖5 乳液凝膠動凍融后的微觀形貌Fig.5 Microscopic images of dynamic freeze-thaw emulsion gel

由圖5 可知，凍融前后HPI 與XG 復合物（質(zhì)量比5∶1、2∶1、1∶1、1∶2）穩(wěn)定乳液凝膠的微觀結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，乳滴排列緊密，未出現(xiàn)較大油滴聚集體。主要的原因有以下3 個方面，首先，隨著XG 添加量的增加，分子間靜電相互作用和空間相互作用增強，使乳滴粒徑減小，有助于提高乳液的凝聚穩(wěn)定性；其次，由于XG自身具備的黏度，促進油水界面處形成了更致密的界面膜，減小了凍融過程中晶體對界面膜的破壞[23]；最后，XG 含量的增加會提高水相黏度，降低水相結(jié)晶速率并減少冰晶的生成數(shù)量[24]，HPI 與XG 在酸性條件下的分子間非共價相互作用（靜電相互作用、空間相互作用）進一步阻礙了冷凍過程中產(chǎn)生的結(jié)晶對自身及相鄰乳滴的破壞，減少了乳液的絮凝[25]。

2.4 乳液凝膠凍融后的流變特性分析

由于在凍融過程中純HPI 組與HPI∶XG=5∶1（質(zhì)量比）試驗組發(fā)生了破乳，因此不對這兩個試驗組進行流變特性分析，凍融后得乳液凝膠的流變特性如圖6 所示。

圖6 凍融后乳液凝膠的流變特性Fig.6 Rheological properties of freeze-thaw emulsion gel

由圖6A 可知，在應力掃描模式中，經(jīng)過3 次凍融循環(huán)處理后，1∶2 試驗組的G′和G″交叉點（即臨界應力）左移，表明凍融處理后1∶2 試驗組抵抗應力變化的能力減弱，推測可能是由于過量的XG 會破壞HPI/XG 復合物，導致穩(wěn)定性下降。由圖6B 可知，所有樣品G′仍大于G″，表明凍融后能較好地維持彈性為主導的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凍融后，添加XG 的試驗組仍能保持良好黏彈性的原因與XG 的加入降低了水的結(jié)冰點、增強了分子間非共價作用并且形成的致密的界面膜、減少了結(jié)晶對液滴和界面膜的破壞有關(guān)[23-25]。結(jié)果表明，質(zhì)量比為1∶1 的HPI 與XG 對維持黏彈性結(jié)構(gòu)效果影響明顯。由圖6C 可知，所有樣品均呈現(xiàn)剪切變稀現(xiàn)象，凍融處理后，XG 與HPI 復合物組穩(wěn)定的乳液凝膠仍具備較高黏度。

2.5 乳液凝膠的貯藏過程外觀

乳液凝膠貯藏期間的外觀如圖7 所示。

圖7 貯藏期間的乳液凝膠外觀Fig.7 Appearance of emulsion gel during storage

由圖7 可知，純HPI 組穩(wěn)定的乳液凝膠，在貯藏第3 天發(fā)生明顯的相分離現(xiàn)象，隨著貯藏時間的延長，頂部顏色逐漸加深，氧化程度不斷增加。但隨著XG 的添加，乳液凝膠貯藏期間仍保持穩(wěn)定，不會發(fā)生相分離，且隨XG 添加量的增加，乳液顏色變化不明顯，表明氧化程度逐漸降低。

2.6 乳液凝膠貯藏過程穩(wěn)定性分析

為了提高乳液凝膠的營養(yǎng)價值，采用富含多不飽和脂肪酸的亞麻籽油作為油相，但過于豐富的多不飽和脂肪酸會加速脂質(zhì)氧化。因此測定乳液凝膠貯藏過程中的氧化穩(wěn)定性具有重要意義。通過檢測乳液凝膠貯藏過程中初級氧化產(chǎn)物和次級氧化產(chǎn)物變化，以監(jiān)測乳液凝膠中脂質(zhì)的氧化速率[26]。以純亞麻籽油組作為對照，乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性結(jié)果見圖8。

圖8 乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of emulsion gel

由圖8 可知，隨著貯藏時間的延長，所有樣品中的POV、TBARS 含量、CD 含量和CT 含量明顯增加。與純亞麻籽油相比，乳液凝膠表現(xiàn)出明顯的脂質(zhì)氧化抑制作用。隨著XG 添加量的增加，乳液凝膠的抗氧化性增強。當HPI∶XG=1∶1（質(zhì)量比）時，氧化速率最低，貯藏期間產(chǎn)生POV、TBARS、CD、CT 的速率最慢，乳液凝膠的抗氧化性最強?？赡艿脑虬? 個方面：1）DHPM處理后的HPI 本身具有自由基清除能力，可清除油水界面的自由基[27]，阻斷脂質(zhì)氧化鏈式反應，有效抑制脂質(zhì)氧化；2）當HPI∶XG=1∶1（質(zhì)量比）時，所形成的乳液凝膠液滴尺寸更小、分布更加均勻，增強了凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成了致密的界面層，可以防止油滴與連續(xù)相中促氧化劑如金屬離子之間的接觸[28]；3）游離的XG可以提高連續(xù)相的黏度并誘導凝膠網(wǎng)絡的形成，降低促氧化劑的轉(zhuǎn)移速率，減少脂質(zhì)的氧化[29]。隨著XG 添加量的增加，致密的物理屏障和更高的連續(xù)相黏度，有效地阻止氧自由基的傳遞和轉(zhuǎn)移，進而明顯抑制了乳液凝膠貯藏過程中初級氧化產(chǎn)物、次級氧化產(chǎn)物、共軛二烯烴和酮類物質(zhì)的產(chǎn)生速率。

3 結(jié)論

HPI 與XG 通過靜電吸引作用結(jié)合，當HPI 與XG復配質(zhì)量比為1∶1 時，所構(gòu)建的乳液凝膠具有良好的黏彈性、凍融穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。結(jié)果表明，HPI 與XG 分子間相互作用增強有助于維持乳液液滴的穩(wěn)定性、提高乳液凝膠黏彈性；XG 在HPI 表面形成致密的界面膜，阻礙了凍融過程中脂質(zhì)結(jié)晶對自身和相鄰乳液液滴的破壞，有效維持凍融后乳液凝膠的黏彈性，而致密的界面膜又可以阻礙脂質(zhì)與連續(xù)相中存在的金屬離子等促氧化劑接觸，降低自由基的擴散速率以提高乳液氧化穩(wěn)定性。具備高凍融穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性的乳液凝膠的成功制備為蛋白質(zhì)-多糖復合提供理論基礎(chǔ)，為拓展低脂乳液凝膠在食品體系中的應用提供新的思路。