何林蔓,柳宜池,陳莎,高夢(mèng)祥,2,李利,2*
(1.長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025;2.長(zhǎng)江大學(xué)食品研究院,湖北 荊州 434025)
血耳(Tremella sanguinea Peng),又稱血銀耳,是一種生長(zhǎng)于枯木上的藥食兼用大型膠質(zhì)真菌,子實(shí)體以耳片狀叢生,鮮時(shí)呈暗赤褐色,干后黑色,浸水后滲出琥珀紅色色素,故稱血耳[1]。血耳作為食藥兼用真菌,在湖北省西北部山區(qū)具有較長(zhǎng)栽培歷史,具有益氣活血、平肝陽、祛熱毒的功效,常用于肝炎、痢疾以及婦科諸癥的治療[2]。
1990 年彭寅斌根據(jù)血耳的形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行分類,將其歸屬于銀耳綱(Tremellomycetes)、銀耳目(Tremellales)、銀耳科(Tremellaceae)、銀耳屬(Tremella)[1],與常見的食用菌銀耳(T.fuciformis)、金耳(T.aurantialba)同屬,親緣關(guān)系較近。銀耳屬真菌中普遍存在伴生現(xiàn)象[3]。血耳、金耳、腦狀銀耳(T.encephala)、T.spectabilis 和T.steidleri 的伴生菌被鑒定為韌革菌(Stereum sp.)[3-5],銀耳的伴生菌為香灰菌(Hypoxylon sp.)[3],T.mycophaga、T.obscura 和T.giraffa 的伴生菌為花耳屬真菌(Dacrymyces sp.)[4]。銀耳屬的這種伴生現(xiàn)象實(shí)質(zhì)為一種寄生關(guān)系,銀耳屬真菌為寄生菌,伴生菌為宿主菌。伴生菌具有較高的纖維素、半纖維素降解能力,能夠分解木材,為銀耳屬真菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供營養(yǎng)和水分[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),許多銀耳屬的子實(shí)體是一種異質(zhì)復(fù)合體,含有大量的伴生菌菌絲[3-4]。
銀耳屬食用菌中多糖含量極其豐富,被認(rèn)為是其主要的活性成分,其中關(guān)于銀耳多糖和金耳多糖的研究較多,被證實(shí)具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、抗衰老、降血糖、減肥及益生等多種功效[6-7],開發(fā)利用前景十分廣闊。近年來。血耳子實(shí)體多糖的抗氧化、抗炎癥和調(diào)節(jié)免疫功能的活性也已被報(bào)道[8-10]。
食用菌多糖不僅可以從子實(shí)體中提取和分離,還可以從培養(yǎng)的菌絲體、孢子或發(fā)酵液中獲取[11]。目前銀耳屬食用菌多糖的研究主要集中于子實(shí)體多糖和菌絲體、擔(dān)孢子發(fā)酵產(chǎn)生的多糖,對(duì)其伴生菌多糖的研究鮮有報(bào)道[12]。本研究利用血耳伴生菌菌株韌革菌XE02 進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵制備胞外多糖,對(duì)多糖的抗氧化活性及吸濕、保濕性能進(jìn)行研究,以期為血耳伴生菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考。
血耳伴生菌菌株[韌革菌(Stereum sp.)XE02],通過耳木組織培養(yǎng)法從湖北省??悼h馬良鎮(zhèn)水田村采集的血耳子實(shí)體中分離而得[5]。
葡萄糖、濃硫酸、苯酚、水楊酸、鄰苯三酚、甘油、抗壞血酸(vitamin C,VC)、海藻酸鈉(均為分析純)、KBr(光譜純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DEAE-52 纖維素:上海源葉生物科技有限公司。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,定容至1 000 mL;馬鈴薯培養(yǎng)基[13]:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,KH2PO43 g,MgSO41.5 g,定容至1 000 mL,pH6.0;大米培養(yǎng)基[14]:大米粉40 g,大豆粉10 g,KCl 0.15 g,KH2PO40.15 g,NaCl 0.15 g,定容至1 000 mL,pH6.0;葡萄糖培養(yǎng)基:葡萄糖50 g、蛋白胨5 g、KH2PO42.5 g,MgSO41.0 g,定容至1 000 mL,pH6.0;加富葡萄糖培養(yǎng)基:在葡萄糖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.15%酵母浸出粉。培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃,20 min。
Allegra X-30R 離心機(jī):德國貝克曼公司;TU1900紫外可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HT7800 透射電子顯微鏡:日本日立科學(xué)儀器有限公司;IR-960 傅里葉紅外變換光譜儀:天津瑞岸科技有限公司;Waters 1515 高效液相色譜儀、Waters 2410示差折光檢測(cè)器:美國沃特世公司。
1.3.1 血耳伴生菌的液態(tài)發(fā)酵
將韌革菌XE02 點(diǎn)接于PDA 培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)4 d進(jìn)行活化。挑取5 塊4 mm2大小的菌餅接入50 mL 液體培養(yǎng)基,30 ℃,200 r/min 培養(yǎng)3 d 得到種子液,再按照10%接種量轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min、7 d。
1.3.2 胞外粗多糖的提取
發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾除掉菌絲體,收集濾液,于55 ℃減壓濃縮至原體積的1/10,按100∶5的體積比加入30% H2O2,用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值至9,在40 ℃下水浴1 h 進(jìn)行脫色,得到澄清透明的粗多糖溶液。加入1/4 體積的Sevag 試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1,體積比),磁力攪拌20 min 后,10 000 r/min 離心15 min,脫除蛋白質(zhì),重復(fù)3 次,收集上清液,加入無水乙醇,使體系中乙醇體積濃度達(dá)到80%,4 ℃靜置過夜,10 000 r/min 離心15 min,獲得粗多糖沉淀。將粗多糖沉淀用無水乙醇洗滌2 次,加入蒸餾水溶解,冷凍干燥后得到粗多糖。粗多糖的得率(P,g/L)按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。
式中:M粗多糖為粗多糖的干燥后質(zhì)量,g;V 為用于提取多糖的發(fā)酵液體積,L。
1.3.3 多糖的分離純化
0.1 g 粗多糖溶解在10 mL 蒸餾水中,上樣至DEAE-52 纖維素層析柱(2.6 cm × 45 cm),依次用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl 溶液進(jìn)行洗脫,流速為1 mL/min,每7 mL 洗脫液收集一管。采用苯酚-硫酸法測(cè)量洗脫液的吸光值(A490nm),繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線將主要峰對(duì)應(yīng)的洗脫液合并,依次進(jìn)行減壓濃縮、透析、冷凍干燥,得到韌革菌多糖組分(Stereum exopolysaccharides,SEPS)。
1.3.4 紫外可見吸收光譜測(cè)定
將多糖樣品配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的水溶液,在200~600 nm 波長(zhǎng)內(nèi),以1 nm 間隔進(jìn)行掃描。
1.3.5 高效凝膠滲透色譜測(cè)定
配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品(分子量1 000、5 000、12 000、25 000、50 000、80 000、670 000 Da)和SEPS 溶液,過0.22 μm 微孔濾膜后采用高效凝膠滲透色譜法進(jìn)行測(cè)定。采用示差折光檢測(cè)器;色譜柱為Shodex OHpak SB-803 HQ、Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-805 HQ(8 mm×300 mm)串聯(lián)柱;流動(dòng)相為0.05 mol/L NaCl 水溶液;流速0.6 mL/min;柱溫40 ℃,進(jìn)樣量30 μL。采用Waters Empower 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,以標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量(molecular weight,Mw)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),以相應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得校正曲線。根據(jù)多糖組分的保留時(shí)間由校正曲線計(jì)算得到其分子量。
1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定
多糖樣品1~2 mg 與KBr 固體充分研磨后壓片,在4 000~400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。
1.3.7 透射電子顯微鏡觀察
參照王昭晶等[9]的方法,具體如下:1 mg/mL 的多糖水溶液,按質(zhì)量比1∶1 加入1 mg/mL 十二烷基硫酸鈉溶液,80 ℃恒溫水浴2 h,用蒸餾水稀釋至5 μg/mL,80 ℃繼續(xù)水浴2 h。取1 滴分散好的多糖溶液加到300目銅網(wǎng)碳膜上,室溫下自然干燥后在80 kV 電壓下進(jìn)行觀察。
1.3.8 抗氧化能力測(cè)定
參照Zhang 等[15]的方法測(cè)定多糖樣品的羥自由基清除能力,以VC為陽性對(duì)照。將1.0 mL FeSO4(9 mmol/L)、1.0 mL 水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)和1.0 mL多糖樣品(0~10 mg/mL)混合。加入1.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),37 ℃的水浴孵育1 h,測(cè)定510 nm 處吸光值,按照公式(2)計(jì)算羥自由基清除率(Sh,%)。
式中:A1為樣品溶液的反應(yīng)體系的吸光值;A2為用乙醇代替水楊酸-乙醇溶液的對(duì)照組吸光值;A0為用蒸餾水代替樣品溶液的對(duì)照組吸光值。
參照Feng 等[16]的方法測(cè)定多糖樣品的超氧陰離子自由基清除能力,以VC為陽性對(duì)照。將3.0 mL Tris-HCl 緩沖液(0.05 mol/L,pH8.2,含1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉)于試管中,25 ℃水浴孵育20 min,取出后立即加入2.0 mL 樣品溶液(0~10 mg/mL)和1.0 mL 鄰苯三酚(50 mmol/L),混勻,25 ℃水浴反應(yīng)5 min,然后加入0.2 mL 濃鹽酸終止反應(yīng),于320 nm 處測(cè)吸光值,按照公式(3)計(jì)算超氧陰離子自由基清除率(Ss,%)。
式中:A1為樣品溶液的反應(yīng)體系的吸光值;A2為用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液的對(duì)照組吸光值;A0為用蒸餾水代替樣品溶液的對(duì)照組吸光值。
1.3.9 吸濕、保濕效果測(cè)定
按伍曉萍等[17]的方法,以常用的保濕劑甘油和海藻酸鈉為對(duì)照,考察多糖的吸濕、保濕能力。稱取多糖樣品、甘油和海藻酸鈉各0.5 g 于稱量瓶中,將其放入置有飽和碳酸鉀溶液(相對(duì)濕度43%)和飽和硫酸銨溶液(相對(duì)濕度81%)的干燥器內(nèi),25 ℃放置2、4、6、8、10、12、24 h 后,分別稱量樣品質(zhì)量,按公式(4)計(jì)算吸濕能力(Ma,%)。
式中:W0為初始樣品質(zhì)量,g;W1為特定時(shí)間吸濕后的樣品質(zhì)量,g。
稱取多糖樣品、甘油和海藻酸鈉各0.5 g 于稱量瓶中,分別加入3 倍樣品質(zhì)量的去離子水,轉(zhuǎn)動(dòng)稱量瓶直至樣品將水分完全吸收。將稱量瓶放入裝有變色硅膠的干燥器(相對(duì)濕度0%)內(nèi),25 ℃放置2、4、6、8、10、12、24、36 h 后,分別稱量樣品質(zhì)量,按照公式(5)計(jì)算保濕率(Mr,%)。
式中:H0為初始樣品中的水分質(zhì)量,g;H1為特定時(shí)間后樣品中的水分質(zhì)量,g。
采用Excel 2007 處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析,Origin 2018 軟件進(jìn)行繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3 次。
韌革菌XE02 在馬鈴薯培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基和加富葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,其發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量見圖1。
圖1 韌革菌XE02 在不同培養(yǎng)基中的胞外多糖產(chǎn)量Fig.1 Yield of exopolysaccharides by Stereum sp.XE02 in different media
由圖1 可知,培養(yǎng)基成分對(duì)韌革菌XE02 的胞外多糖產(chǎn)量影響較大,其中,大米培養(yǎng)基為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基,胞外多糖產(chǎn)量為(1.62±0.05)g/L。在后續(xù)試驗(yàn)中均采用大米培養(yǎng)基為韌革菌XE02 胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基。
收集韌革菌XE02 在大米培養(yǎng)基中的發(fā)酵液上清,經(jīng)H2O2脫色、Sevag 試劑脫蛋白、乙醇沉淀得到胞外粗多糖,得率為(1.1±0.2)g/L。采用DEAE-52 纖維素柱層析對(duì)粗多糖進(jìn)行純化,結(jié)果見圖2 和圖3。
圖2 粗多糖的DEAE-52 纖維素柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of crude polysaccharides using DEAE-52 column chromatography
圖3 SEPS 的固體狀態(tài)和顯微形貌Fig.3 Solid state and microscopic morphology of polysaccharides SEPS
由圖2 可知,胞外粗多糖經(jīng)DEAE-52 纖維素柱層析后,在NaCl 濃度為0 mol/L 時(shí)有1 個(gè)洗脫峰,表明韌革菌XE02 的胞外多糖主要為中性多糖。該中性多糖洗脫液經(jīng)濃縮、透析除鹽、冷凍干燥后,得到蓬松的白色絮狀多糖組分SEPS,在透射電鏡下,SEPS 的分子形貌呈長(zhǎng)絲狀(圖3)。
采用紫外可見吸收光譜和高效凝膠滲透色譜分別對(duì)多糖SEPS 的純度和分子量進(jìn)行分析,結(jié)果見圖4和圖5。
圖4 SEPS 的紫外可見吸收光譜Fig.4 Ultraviolet-visible absorption spectra of SEPS
圖5 SEPS 的高效凝膠滲透色譜Fig.5 High performance gel permeation chromatogram of SEPS
由圖4 可知,SEPS 在260 nm 和280 nm 處無明顯的吸收峰,表明樣品中不含或含極少量的蛋白質(zhì)和核酸,純度較高。由圖5 可知,高效凝膠滲透色譜共檢測(cè)到3 個(gè)洗脫峰SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3,保留時(shí)間分別為27.01、40.77、46.91 min,表明SEPS 為含有3 種不同分子量多糖的復(fù)合多糖。根據(jù)右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的lgMw-RT 校正曲線方程y=-0.166x+11.06(R2=0.995),計(jì)算得到SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3 相對(duì)分子質(zhì)量分別為3.77×103、19.61、1.87 kDa。
在4 000~400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)對(duì)SEPS 進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜掃描,分析其特征官能團(tuán),結(jié)果見圖6。
圖6 SEPS 的傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectra of SEPS
由圖6 可知,SEPS 在3 400、2 933、1 641、1 427、1 150、1 051、900、856、766 cm-1處均有吸收峰,具有多糖類物質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)特征。其中,3 400 cm-1和2 933 cm-1附近的吸收峰分別為O-H 伸縮振動(dòng)和C-H 伸縮振動(dòng)[15],二者是糖類的特征吸收峰;1 641 cm-1附近的吸收峰與多糖的結(jié)合水有關(guān)[10],說明SEPS 對(duì)水有較強(qiáng)的親和力;1 427 cm-1附近的吸收峰是C-H 的彎曲振動(dòng)峰[15];1 051 cm-1附近的吸收峰為吡喃糖環(huán)中C-O-C和C-O-H 的C-O 伸縮振動(dòng),766 cm-1為吡喃環(huán)的對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)[15],表明SEPS 中單糖以吡喃糖苷的形式存在;900 cm-1和856 cm-1附近的吸收峰分別為α-糖苷鍵和β-糖苷鍵的吸收峰[15],表明SEPS 同時(shí)存在α和β 兩種類型的糖苷鍵。綜上所述,SEPS 中的單糖組成為吡喃糖,含有β-構(gòu)型糖苷鍵和α-構(gòu)型糖苷鍵。
在正常情況下,人體中的自由基處在不斷產(chǎn)生和不斷消除的動(dòng)態(tài)平衡中,一旦平衡被打破,就會(huì)對(duì)機(jī)體組織產(chǎn)生危害,進(jìn)而引發(fā)腫瘤、衰老、心腦系統(tǒng)損傷等一系列相關(guān)疾病[17-18]。大量研究表明,真菌多糖是一類良好的天然抗氧化劑,可用于防止或減輕自由基造成的危害[18]。以羥自由基清除效果和超氧陰離子自由基清除效果為指標(biāo),評(píng)價(jià)了胞外多糖SEPS 的抗氧化活性,結(jié)果見圖7 和圖8。
圖7 SEPS 對(duì)羥自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of SEPS on hydroxyl radical
圖8 SEPS 對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect of SEPS on superoxide anion radical
由圖7 和圖8 可知,隨著濃度的升高,SEPS 的羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率不斷升高,表明SEPS 的質(zhì)量濃度與清除率呈量效關(guān)系。在10 mg/mL時(shí),SEPS 的羥自由基和超氧陰離子自由基清除率分別約為68%和74%,說明胞外多糖SEPS 具有一定的抗氧化能力,在抗衰老、抗腫瘤、抗炎癥、抗糖尿病活性等方面具有潛在的應(yīng)用前景[12]。
多糖分子結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基、羧基等極性基團(tuán),這些極性基團(tuán)易與水分子形成氫鍵而結(jié)合大量的水分,從而具有良好的吸濕和保濕性。同時(shí),多糖具有良好的成膜性,能夠在果蔬、皮膚等表面形成“鎖水膜”,防止水分流失,達(dá)到持久保鮮或保濕的效果。目前,越來越多的多糖被用于鮮切水果保鮮劑和化妝品保濕劑[19-20]。
2.4.1 吸濕性
分別在相對(duì)濕度43%和相對(duì)濕度81%環(huán)境下,研究了胞外多糖SEPS 的吸濕性,結(jié)果見圖9 和圖10。
圖9 SEPS 在相對(duì)濕度43%時(shí)的吸濕效果Fig.9 Moisture-absorption rates of SEPS at relative humidity of 43%
圖10 SEPS 在相對(duì)濕度81%時(shí)的吸濕效果Fig.10 Moisture-absorption rates of SEPS at relative humidity of 81%
由圖9 和圖10 可知,在相對(duì)濕度43%和相對(duì)濕度81%環(huán)境下,胞外多糖SEPS 及常用保濕劑甘油和海藻酸鈉的吸濕率在24 h 內(nèi)均不斷升高,且環(huán)境濕度越大,吸濕性越強(qiáng);相對(duì)濕度81%環(huán)境下,甘油的吸濕性最強(qiáng),24 h 吸濕率為95.5%,明顯高于海藻酸鈉(45.1%)和胞外多糖SEPS(63.3%)。劉恕[21]的研究也同樣顯示了甘油優(yōu)越的吸濕性能,其在不同濕度條件下的吸濕率優(yōu)于聚乙二醇、透明質(zhì)酸等其它常用保濕劑。然而,胞外多糖SEPS 在24 h 內(nèi)的吸濕率明顯高于海藻酸鈉,表明胞外多糖SEPS 具有良好的吸濕性能。
2.4.2 保濕性
在干燥硅膠環(huán)境(相對(duì)濕度0%)中,研究了胞外多糖SEPS 的保濕性,結(jié)果見圖11。
圖11 SEPS 在干燥硅膠環(huán)境中的保濕效果Fig.11 Moisture-retention rates of SEPS under dry silica gel condition
由圖11 可知,在干燥環(huán)境下,胞外多糖SEPS 與常見保濕劑甘油和海藻酸鈉的水分變化趨勢(shì)一致,在12 h 內(nèi)快速下降,之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),水分的散失開始變得緩慢;胞外多糖SEPS 保濕效果優(yōu)于甘油和海藻酸鈉,36 h 時(shí)胞外多糖SEPS、海藻酸鈉和甘油保濕率分別為31.6%、27.8%和20.0%。
血耳伴生菌菌株韌革菌XE02 產(chǎn)生胞外多糖的最佳培養(yǎng)基為大米培養(yǎng)基,在30 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)7 d,發(fā)酵液離心上清中胞外多糖含量為(1.62±0.05)g/L,經(jīng)H2O2脫色、Sevag 試劑脫蛋白和乙醇沉淀制備得到胞外粗多糖,得率為(1.1±0.2)g/L。采用DEAE-52 纖維素柱層析對(duì)粗多糖進(jìn)行純化,得到1 個(gè)中性多糖組分SEPS,其冷凍干燥后為蓬松的白色絮狀物,在透射電鏡下的分子形貌呈長(zhǎng)絲狀。高效凝膠滲透色譜分析表明,SEPS 為復(fù)合多糖,含有SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3 共3 種多糖組分,相對(duì)分子質(zhì)量分別為3.77×103、19.61、1.87 kDa。傅里葉變換紅外光譜分析表明,SEPS 具備多糖類物質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)特征,其單糖組成為吡喃糖,含有β-構(gòu)型糖苷鍵和α-構(gòu)型糖苷鍵。
SEPS 具有良好的羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力,且呈劑量依賴性。在10 mg/mL 時(shí),SEPS 的羥基自由基和超氧陰離子自由基清除率分別約為68%和74%。SEPS 具有良好的吸濕、保濕性能。在相對(duì)濕度43%和81%環(huán)境下,SEPS 的吸濕效果不及甘油,但明顯高于海藻酸鈉,在相對(duì)濕度81%下,24 h 時(shí)SEPS、海藻酸鈉和甘油的吸濕率分別為63.3%、45.1%和95.5%;在相對(duì)濕度為0%的干燥環(huán)境下,SEPS 保濕效果優(yōu)于甘油和海藻酸鈉,36 h 時(shí)SEPS、海藻酸鈉和甘油保濕率分別為31.6%、27.8%和20.0%。該結(jié)果表明,SEPS在保健食品、果蔬保鮮、化妝品等領(lǐng)域具有較好的開發(fā)應(yīng)用潛力。