張強 李長春 劉敏 尹熙惠 洪蘭 方成虎

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 延吉 133000 ;2上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第一康復(fù)醫(yī)院);3延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室)

急性心肌梗死(AMI)是供應(yīng)心臟血流的冠狀動脈發(fā)生急性閉塞〔1〕。由于血管中斑塊、白細(xì)胞、膽固醇和脂肪的不穩(wěn)定積聚,使血液停滯或不能正常流向心臟的某個部位,造成該冠狀動脈供血區(qū)域的心肌細(xì)胞發(fā)生損傷、壞死。由于心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,壞死后不可再生,壞死部分心肌功能逐漸減弱,因此,挽救瀕死心肌以縮小梗死面積成為AMI治療的關(guān)鍵。在臨床工作中,再灌注治療依然是目前AMI患者治療的主要方法,包括靜脈溶栓、冠狀動脈支架植入術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù),以恢復(fù)冠脈血流,使缺氧、缺血的心肌細(xì)胞得以存活。無法及時接受再灌注治療或再灌注治療失敗的患者,由于存活心肌細(xì)胞的減少往往會發(fā)生心肌不良重塑和充血性心力衰竭,甚至死亡。據(jù)報道,因為出凝血功能障礙、腎功能衰竭等各種原因,一些患者只能接受保守治療,卻仍然表現(xiàn)出較高的存活率〔2〕。究其原因,可能為某些心臟細(xì)胞在某種物質(zhì)的參與下,進一步分化為血管樣細(xì)胞并形成新生毛細(xì)血管的結(jié)果,這引發(fā)了壞死心肌局部微循環(huán)的重新建立〔3〕。在微循環(huán)重新建立后,新生的血管以通暢血流營養(yǎng)缺血、缺氧的心肌細(xì)胞,維持心臟的生理功能。有趣的是,這種情況通常發(fā)生在前降支、回旋支和右冠狀動脈三支血管均堵塞的患者身上,并在嚴(yán)格后續(xù)治療后發(fā)現(xiàn)患者日常生活未受明顯限制。這提示促進AMI后微循環(huán)建立將有助于保護殘存心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。問題是,這種血運重建并不是所有患者都發(fā)生,也可能發(fā)生的時間較晚。因此,尋求一種促進梗死后微循環(huán)重建的方法顯得至關(guān)重要。細(xì)胞替代治療作為一種獨創(chuàng)性的治療手段及其廣大的應(yīng)用前景引起了臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)工作者的廣泛存眷〔4〕,已成為再生醫(yī)學(xué)中最有前途的領(lǐng)域之一,其核心觀念即通過將患者自體或異體細(xì)胞移植入受損組織或器官,最終實現(xiàn)缺失部位的替代和功能的修復(fù)。中外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞〔5〕、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞〔6〕、人脂肪組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞〔7〕等均可誘導(dǎo)心肌組織間隙毛細(xì)血管生成。這些干細(xì)胞具有來源廣泛、容易體外分離、培養(yǎng)及擴增等優(yōu)點,但也存在諸多問題,如社會倫理爭議、細(xì)胞之間的免疫排斥反應(yīng)、致瘤性、療效不確定性等〔8〕。因此,開發(fā)一種能解決上述不足之處的理想細(xì)胞來源,便成為當(dāng)前細(xì)胞治療研究的熱點。人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)克服了以上細(xì)胞的缺點,以其廣泛可用性、干細(xì)胞特性、低免疫源性、分化可塑性、無致瘤性、容易獲取且不涉及倫理問題等優(yōu)點,成為細(xì)胞替代治療AMI的一個新的發(fā)展和研究熱點,近10年來受到了越來越多的關(guān)注。本文將圍繞 hAECs在AMI后微循環(huán)重建中的作用及具體機制展開綜述。

1 hAECs的簡述

hAECs來源于胎盤羊膜組織,且來源于內(nèi)細(xì)胞團,是胚胎細(xì)胞,由于在器官發(fā)生過程中沒有直接受到分化信號的影響,因此可能保留外胚層干細(xì)胞樣特征和體外三期分化能力〔9,10〕。并且明顯具有成熟上皮細(xì)胞的許多表型特征,包括細(xì)胞角蛋白表達和細(xì)胞間緊密連接的形成,能夠封閉羊膜腔,幫助維持羊水的成分。hAECs具有表達干細(xì)胞標(biāo)志分子及相關(guān)基因的特性,林海等〔9〕通過細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)hAECs表達階段特異性胚胎抗原(SSEA)-3、SSEA-4、腫瘤排斥抗原(TRA)-1-60和TRA-1-81等,運用逆轉(zhuǎn)錄-實時聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測出其可表達干細(xì)胞全能性相關(guān)基因八聚體結(jié)合蛋白(OCT)-4、染色體相關(guān)性別決定區(qū)(SOX)-2、抑制性突變體(Nanog)、遺傳變種基因(REX)-1、纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)-4及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)等,這些表達結(jié)果顯示hAECs具有部分干細(xì)胞特性,具有明顯的可塑性及多項分化潛能,同時證明hAECs不表達干細(xì)胞中端粒酶基因,說明其不可以無限增殖,具有非致瘤性,因此,其在臨床治療中安全性更高。大量研究證實,hAECs在不同生長因子的調(diào)節(jié)下,可分化為肝樣細(xì)胞〔11〕、心肌樣細(xì)胞〔12〕、神經(jīng)元細(xì)胞〔13〕及胰島樣細(xì)胞〔14〕等,在細(xì)胞替代治療及組織再生醫(yī)學(xué)上有廣闊的應(yīng)用前景。

2 hAECs治療MI的潛力

Fang等〔12〕將表達上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記pan-cytokeratin的hAECs移植入由液氮制造的AMI大鼠模型后,經(jīng)過一個月的人工飼養(yǎng)后對大鼠心臟進行切片分析發(fā)現(xiàn),部分hAECs可分化為表達心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記肌球蛋白重鏈(MHC)的心肌樣細(xì)胞,通過免疫組化及分子生物學(xué)分析等實驗證實,分化后的細(xì)胞有效減少了心臟梗死面積,通過正電子發(fā)射型計算機斷層顯像(PET)及超聲心動圖等可發(fā)現(xiàn)心臟功能得以部分恢復(fù)。王鈺瑩等〔15〕將hAECs移植到左前降支結(jié)扎的大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)hAECs移植組存活的心肌細(xì)胞數(shù)量較AMI模型組梗死區(qū)的更多,心肌細(xì)胞纖維化程度更小,左心室重構(gòu)程度與其相比明顯減輕、延緩。但Fang等〔12〕對AMI大鼠模型的細(xì)胞移植中,僅有3%的hAECs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞,由此可見數(shù)量不多的心肌樣細(xì)胞有可能并不是改善心功能的關(guān)鍵因素,且并未闡明其改善心肌功能的具體作用機制,故hAECs作為一種新型治療AMI的途徑其機制還有待進一步研究證實。

3 hAECs及人羊水來源干細(xì)胞來源的內(nèi)皮細(xì)胞(AFSC-EC)對梗死后微循環(huán)的影響

Benavides等〔16〕以纖維蛋白-聚乙二醇水凝膠為細(xì)胞包封平臺,其可促進生物相容性、機械穩(wěn)定性和血管生成;在共培養(yǎng)中,AFSC和hAECs各作為一種支持細(xì)胞來源,類似于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),發(fā)現(xiàn)其能夠促進血管長度、面積和厚度的增加;AFSC和hAECs共同衍生的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)清晰形成,血管厚度和覆蓋面積與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)-MSC衍生的網(wǎng)絡(luò)相似,但還需要進一步的分析來確定血管成熟度和體內(nèi)活力的潛能。Lloyd-Griffith等〔17〕通過對AFSC-HUVEC共培養(yǎng)用于體外膠原蛋白硫酸軟骨素(CCS)支架內(nèi)生成微毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò),AFSC可發(fā)揮周圍細(xì)胞樣細(xì)胞的作用,以穩(wěn)定微毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成。但其研究發(fā)現(xiàn),缺氧條件對微毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成無有利影響,常氧促進了3種O2濃度條件下微毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。這項研究是首次使用含有AFSC的共培養(yǎng)方法成功的預(yù)血管化CCS支架(或任何多孔支架)?？偟膩碚f,本研究驗證了基于AFSC和hAECs的共培養(yǎng)用于血管形成前具有促進作用。

3.1hAECs及AFSC-EC可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞 Liu等〔18〕通過局部肌內(nèi)將AFSC-EC移植于裸鼠缺血后肢,明顯增加血流灌注,治療效果明顯(搶救出11/13只肢體)。這種AFSC-EC在缺血組織中移植的好處可能不是與供體細(xì)胞融合或轉(zhuǎn)分化血腦屏障的結(jié)果,而是由于新生血管的形成,重新構(gòu)建缺血部位的微循環(huán),在缺血區(qū)域肌內(nèi)注射AFSC-EC改善了保肢,恢復(fù)了血液灌注,顯著增加了毛細(xì)血管和小動脈密度。此外,移植的AFSC-EC分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞并融入血管,進而促進包括小動脈在內(nèi)的新血管的形成。因此,AFSC-EC可能是缺血性疾病再生治療的一種選擇,即可用于AMI的患者,使其壞死區(qū)域毛細(xì)血管再生,重新構(gòu)建微循環(huán),使患者心臟功能得以部分恢復(fù)。Fazel等〔19〕強調(diào)了血運重建的必要性,報道骨髓源性祖細(xì)胞通過促進新生血管生成,顯著增強心臟修復(fù)。因hAECs是比AFSC起源更早的細(xì)胞,故其保留較多干細(xì)胞特性,因此其也對血管再生機制有著廣闊的前景。

3.2hAECs及AFSC-EC的旁分泌因子對血管再生的影響 一些研究表明〔20〕,hAECs表達一些抗血管生成的化學(xué)物質(zhì),包括血栓反應(yīng)素-1,內(nèi)皮抑素和硫酸肝素蛋白聚糖。此外,所有4種金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1,-2,-3和-4都存在于hAECs中,其具有強大的抗血管生成作用。另一方面,也有報道指出hAECs分泌一些血管生成因子,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素(IL)-8 、血管生成素、干擾素、IL-6、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和血小板源性生長因子(PDGF)等〔21〕?；谶@些數(shù)據(jù),hAECs可以同時具有血管生成和抗血管生成的特性。hAECs誘導(dǎo)血管生成可以用血管生成因子解釋,包括:VEGF、IL-8、IL-6、生長相關(guān)癌基因(GRO)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、血管內(nèi)黏附分子(ICAM)和遷移抑制因子(MIF),這些因子都是由hAECs及AFSC-EC分泌的〔22〕。當(dāng)羊膜分泌的生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、EGF、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子等存在時,間充質(zhì)細(xì)胞可分化為內(nèi)皮細(xì)胞。因此,羊膜除了分泌多種血管生成因子外,還可通過間充質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化,促進血管生成。

旁分泌因子在細(xì)胞治療中起關(guān)鍵作用。通過大量文獻及研究可知通過局部控制細(xì)胞因子濃度,持續(xù)向缺血組織輸送旁分泌因子對治療有好處〔23〕。然而,Liu等〔18〕觀察到1個單一肌內(nèi)注射AFSC-EC上清液并不能改善缺血的保肢或局部血流,說明該治療不能有效地誘導(dǎo)治療性血管生成。這種辦法失敗的根本原因仍待探討。AFSC-EC上清液可能會被迅速清除,而不會在缺血區(qū)域停留足夠長的時間以誘導(dǎo)血管生成。提高AFSC-EC上清液治療效果的策略,如反復(fù)肌內(nèi)注射缺血組織和使用肽納米纖維控制輸送,需要進一步的研究。金屬蛋白酶系統(tǒng)(MMPs)已被證明參與了新生血管的形成過程〔24〕。雖然Kim等〔25〕表明MMP-3和MMP-9的表達在MSC的血管生成中起著重要作用,但并沒有確定可能參與血管生成通路的因素。VEGF-α在血管生成中起關(guān)鍵作用。已有多篇報道討論了VEGF-α與MMP-3或MMP-9相互作用的可能性〔26〕,但這些分子相互作用的機制尚不清楚:研究表明,MMP-9刺激VEGF表達〔27〕,而另一些研究認(rèn)為MMP-9被VEGF激活〔28〕。其研究發(fā)現(xiàn),添加MMP-3或MMP-9抑制劑顯著抑制體外毛細(xì)血管樣血管的形成。MMP-9抑制劑治療減少了VEGF-α的釋放,但MMP-3抑制劑治療增加了VEGF-α的水平。表明MMP-9可能刺激AFSC-EC釋放VEGF-α,從而誘導(dǎo)新生血管,而MMP-3則相反,可能受到VEGF-α的調(diào)控,從而誘導(dǎo)血管生成。然而,AFSC-EC治療作用的機制尚不完全清楚。事實上,AFSC-EC誘導(dǎo)血管生成和動脈生成的改善可能有多種機制。Cohen等〔29〕研究表明,IL-6在血管生成中的作用是通過誘導(dǎo)VEGF,是一種有效的血管生成因子。Song等〔30〕通過研究表明,h-AECs 分泌細(xì)胞因子包括血管生長素(ANG)、EGF、IL-6、MCP-1等,這些細(xì)胞因子在大鼠MI模型中能夠有效地參與心肌修復(fù)和功能改進,故進一步研究這些分泌因子的作用機制對開發(fā)新型分子療法治療MI具有重要意義。

綜上,血管生成是一個復(fù)雜的過程,成熟的內(nèi)皮細(xì)胞具有有限的再生能力。研究表明,移植的AFSC-EC在缺血的小鼠組織中存活,增加了毛細(xì)血管和小動脈的密度,并直接并入缺血部位的小動脈(內(nèi)皮和平滑肌層)。缺血肢體血流灌注改善可能是缺血部位新生血管的誘導(dǎo)所致。因此,該研究證明了被移植的AFSC-EC在體內(nèi)分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞,并融入血管,進而促進包括小動脈在內(nèi)的新血管的形成。AFSC和hAECs在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時能夠分化為ECs,AFSC-ECs在基質(zhì)上形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。重要的是,研究表明,移植的AFSC-ECs在缺血組織中存活,增強新生血管生成,融入血管組織,改善缺血區(qū)域的血液灌注。h-AECs 分泌細(xì)胞因子能夠有效地參與心肌修復(fù)和功能改進,本文認(rèn)為AFSC-ECs和h-AECs可以作為一種新的異種移植細(xì)胞來源,用于治療缺血性疾病的血管生成。雖然 h-AECs 細(xì)胞替代治療研究至今在臨床前實驗研究上沒有大的進展,但為MI后的缺血再灌注治療提供了更多參考方案,其在MI治療的研究潛力是不可估量的。相信其后續(xù)研究能有更大進展,并應(yīng)用到真正的臨床實踐中。