劉前程 劉鑫 楊端云 吳敏華 鄧湘雨 鐘文露 孟立鋒,2

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530023;2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科)

腹膜透析(PD)是終末期腎臟病患者重要的腎臟替代治療方法之一,全球透析人口中有11%在PD〔1〕。與血透相比,PD成本更低,更有利于殘余腎功能的保護(hù),但是PD并不能完全替代人體正常腎臟功能,患者進(jìn)行PD的1～4年內(nèi)仍有3%～36%的患者出現(xiàn)腹膜損傷、腹膜纖維化(PF)致腹膜超濾功能衰竭,患者不得不退出PD。PF的始動(dòng)環(huán)節(jié)是腹膜間皮細(xì)胞(PMC)損傷。因此,針對(duì)性干預(yù)PMC損傷是防治PF的重要靶點(diǎn),開發(fā)保護(hù)PMC損傷的技術(shù)或藥物成為研究的重要課題。

線粒體損傷、功能障礙可以引起細(xì)胞供能障礙,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線粒體自噬可以清除損傷、功能障礙的線粒體,從而維持機(jī)體細(xì)胞的存活。線粒體損傷、功能障礙是引起自噬發(fā)生的主要原因之一。有報(bào)道指出,高糖腹膜透析液(PDS)能抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ及抗氧化物酶活性,進(jìn)而導(dǎo)致PMC層通透性增高,引起PMC損傷〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)PINK1/Parkin通路調(diào)控線粒體自噬,對(duì)于線粒體的數(shù)量控制、質(zhì)量控制及正常功能的維持起到重要作用〔3〕。針對(duì)性干預(yù)PINK1/Parkin通路調(diào)控線粒體自噬可能是防治PMC發(fā)生的重要靶點(diǎn)。

PD尿毒癥患者的全身微炎癥、氧化應(yīng)激狀態(tài)、反復(fù)發(fā)作的腹膜炎癥等是導(dǎo)致患者腹膜損傷的重要原因,目前臨床尚缺乏有效的防治措施。脾氣虧虛是PD相關(guān)腹膜早期病變的主要病機(jī),而PMC損傷又是PF的起始環(huán)節(jié),脾胃是人體氣血生化之源,線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力工廠。在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下,結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)PMC損傷的機(jī)制認(rèn)識(shí),從脾胃著手干預(yù)PMC線粒體功能障礙防治PDS誘導(dǎo)的PMC損傷,體現(xiàn)了中醫(yī)病證結(jié)合的辨治特色。研究表明〔4〕,具有健脾益氣功效的中藥單體如黃芪甲苷、葛根素等可能具有干預(yù)細(xì)胞線粒體損傷、功能障礙,進(jìn)而防治PMC損傷、PF的作用。在目前尚未開發(fā)出有效保護(hù)腹膜結(jié)構(gòu)和功能藥物(包括新型透析液)的情況下,積極探索中醫(yī)藥防治PF、保護(hù)腹膜功能的有效干預(yù)方法及可能作用機(jī)制,對(duì)于預(yù)防治療PF、延長PD患者的腹透時(shí)間、提高其生存率具有重要的科學(xué)意義和社會(huì)意義。

1 PMC損傷是PF的始動(dòng)因素

研究表明〔5〕,保持腹膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能的有效性,尿毒癥患者才能夠長期、有效地進(jìn)行PD。而PMC是機(jī)體腹膜的主要組成部分,保護(hù)PMC不受非生理相容性腹透液、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷,有助于維持腹膜正常結(jié)構(gòu)和功能。然而,長期PD過程中,腹膜長時(shí)間與高糖、高滲、低酸堿(pH)值等非生理相容的PDS接觸及反復(fù)發(fā)生的腹膜炎和腹腔積血等均可引起腹膜慢性炎癥及損傷,這些因素均會(huì)對(duì)腹腔的局部防御功能及腹膜的細(xì)胞成分造成損害,導(dǎo)致PMC出現(xiàn)間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)、新生血管形成等病理表現(xiàn),從而引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能的變化,促進(jìn)了PF的形成,最終導(dǎo)致腹膜超濾功能衰竭〔6〕。因此,PMC損傷是PF的始動(dòng)因素,針對(duì)PMC損傷這個(gè)起始環(huán)節(jié)進(jìn)行防治PF的研究,體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)既病防變的理念〔7〕。

高濃度葡萄糖PDS破壞了PMC結(jié)構(gòu),是導(dǎo)致PF的重要因素。盡管新型PDS不斷涌現(xiàn),但是基于葡萄糖的傳統(tǒng)透析液仍然是絕大多數(shù)PD患者的首選,在含糖腹透液的長期作用下,PMC脫落、缺失,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生減少,MMPs及其抑制劑平衡被破壞,抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解;同時(shí)增加纖維連接蛋白、活化蛋白的表達(dá),促進(jìn)PF〔8〕。有研究報(bào)道,高糖PDS對(duì)腹膜組織毒性作用早期體現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷和線粒體功能障礙〔9〕。首先,高糖PDS能夠誘導(dǎo)PMC內(nèi)細(xì)胞活性氧(ROS)生成引起腹膜組織氧化應(yīng)激損傷〔9〕。其次,生成的ROS促進(jìn)了巨噬細(xì)胞極化,加重PMC損傷〔10〕,最終誘導(dǎo)腹膜炎癥反應(yīng)、PMC發(fā)生EMT〔11〕。

2 線粒體功能障礙是高糖PDS誘導(dǎo)PMC損傷的主要機(jī)制

線粒體功能障礙可表現(xiàn)為三磷酸腺苷(ATP)合成減少、ROS生成增加、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放等,是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死的重要因素〔12〕。研究表明,線粒體功能障礙通過損傷足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)腎臟疾病〔13〕。此外,報(bào)道指出線粒體功能障礙在神經(jīng)退行性變、糖尿病等疾病過程中也具有重要作用〔14～16〕。

首先,線粒體功能障礙是PMC損傷的早期事件,可直接介導(dǎo)PMC凋亡。研究表明,在高糖PDS及其反應(yīng)產(chǎn)物反復(fù)刺激下,PMC的ROS生成增多,清除相對(duì)不足,從而導(dǎo)致了細(xì)胞線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和PMC凋亡,加速了PD尿毒癥患者的腹膜損傷、通透性改變的進(jìn)程,最終導(dǎo)致腹膜超濾衰竭〔17,18〕。機(jī)體清除ROS、維持線粒體動(dòng)態(tài)和能量代謝平衡、保護(hù)細(xì)胞存活的主要途徑為線粒體自噬。研究表明,高糖PDS可導(dǎo)致PMC線粒體損傷,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體自噬受阻,ROS積累越來越多,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡壞死〔19〕。其次,高糖PDS還可能通過抑制過氧化物酶體增殖活化γ輔助活化因子(PGC)-1α蛋白的表達(dá),抑制線粒體呼吸鏈活性及抗氧化物酶活性,促進(jìn)ROS積聚,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔2〕。此外,PMC在高糖PDS長期作用下炎癥因子分泌增多,導(dǎo)致細(xì)胞長期處于慢性微炎癥狀態(tài),從而啟動(dòng)新生血管的形成及PF過程〔20〕。最后,高糖PDS還可持續(xù)激活PMC核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRP)3-白細(xì)胞介素(IL)-1β,實(shí)時(shí)啟動(dòng)線粒體自噬可能干預(yù)NLRP3-IL-1β持續(xù)激活,這可能成為延緩PD腹腔慢性炎癥及PF的治療靶點(diǎn)〔21〕。

綜上,高糖PDS造成腹膜線粒體損傷、功能障礙是PMC損傷的主要機(jī)制。線粒體自噬可清除受損的線粒體,緩解線粒體功能障礙,進(jìn)而防治PMC損傷。因此,研究線粒體損傷、功能障礙在PF發(fā)生、發(fā)展中的具體作用,可以為闡明PF的發(fā)病機(jī)制及其臨床防治提供新思路。

3 PINK1/Parkin途徑依賴的線粒體自噬是防治PMC損傷的重要靶點(diǎn)

線粒體自噬在機(jī)體維持線粒體穩(wěn)態(tài)及功能中起到主要作用。線粒體損傷后,通過調(diào)節(jié)自噬小體特異性吞噬、降解和清除受損的線粒體,在維持線粒體功能和細(xì)胞存活中起到重要作用。適度水平的線粒體自噬有利于維持能量供應(yīng)及細(xì)胞功能,對(duì)于細(xì)胞的新陳代謝及細(xì)胞凋亡等過程具有重要作用。然而,過度的線粒體自噬加重線粒體功能障礙,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

線粒體自噬的機(jī)制主要有Parkin依賴性及Parkin非依賴性,包括Parkin與PINK1介導(dǎo)的、線粒體自噬受體蛋白(FUNDC1)參與的缺氧介導(dǎo)的及腺病毒E1B相互作用蛋白(Bnip)3/Nip樣蛋白(Nix)介導(dǎo)的〔22〕。研究表明,Parkin依賴性的PINK1、Parkin及泛素協(xié)同在線粒體正常功能的維持、自噬的調(diào)控中起到主導(dǎo)作用〔3,23〕。PINK1被認(rèn)為是線粒體損傷的主要探測(cè)器,Parkin被認(rèn)為線粒體自噬信號(hào)的“增強(qiáng)子”,起到放大信號(hào)等重要作用〔24〕。生理狀態(tài)下,PINK1及Parkin都維持穩(wěn)定的低水平狀態(tài)。當(dāng)線粒體受損時(shí),負(fù)責(zé)降解PINK1的蛋白水解酶被抑制,PINK1在受損線粒體外膜聚集并誘導(dǎo)Parkin轉(zhuǎn)位到受損線粒體〔25〕。與此同時(shí),Parkin的構(gòu)象發(fā)生變化,其E3泛素酶被激活,從而線粒體基質(zhì)蛋白泛素化,泛素化的自噬受體蛋白P62在去極化的線粒體基質(zhì)上積累,進(jìn)而與微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3結(jié)合,介導(dǎo)泛素化的底物進(jìn)入自噬體,募集受損線粒體到溶酶體上,從而介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。PINK1/Parkin信號(hào)通路蛋白PINK1和Parkin是調(diào)節(jié)線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白,其表達(dá)水平的高低可以反映線粒體自噬水平的高低。

細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、運(yùn)動(dòng)和死亡等多種細(xì)胞程序進(jìn)程都有線粒體自噬的參與。因此,明確PMC線粒體功能變化與自噬的關(guān)系及線粒體自噬相關(guān)分子機(jī)制,將成為高糖PDS誘導(dǎo)PMC損傷的突破口。有研究表明,PMC能抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ活性,進(jìn)而導(dǎo)致PMC層通透性增高,引起PMC損傷〔2〕。新的研究表明PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬可緩解高血壓腦出血后腦損傷程度〔26〕。因此推測(cè)PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬可能是高糖PDS誘導(dǎo)PMC損傷發(fā)生的主要機(jī)制。調(diào)控PINK1/Parkin通路影響PMC線粒體功能及其介導(dǎo)的自噬活性,激活其適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制,可能是保護(hù)PMC損傷、防治PF的新靶點(diǎn)。

4 PMC線粒體功能障礙及其誘導(dǎo)的線粒體自噬與中醫(yī)脾氣虧虛密切相關(guān)

PD利用腹膜的屏障作用作為半透膜,PD能長期而有效地進(jìn)行,很大程度上取決于腹膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能的有效性,但腹膜過度使用也會(huì)導(dǎo)致PMC結(jié)構(gòu)和功能損傷。《素問·熱論》中提出“脾主大腹”,明確指出腹膜的結(jié)構(gòu)和功能與脾臟功能強(qiáng)弱有密切關(guān)系〔5〕。

4.1中醫(yī)脾-線粒體密切相關(guān) 宏觀上,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,脾具有“主運(yùn)化”的作用,與肝合為人體樞紐;微觀上,線粒體是機(jī)體物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)化的中心,是機(jī)體進(jìn)行各項(xiàng)生命活動(dòng)的樞紐。所以,從人體宏觀以及微觀的角度,均可認(rèn)為脾-線粒體共同作為機(jī)體“后天之本”“氣血生化之源”。

4.2PMC線粒體功能障礙及其誘導(dǎo)的自噬與中醫(yī)脾氣虧虛密切相關(guān) 通過對(duì)全國8個(gè)省市2 546例PD患者進(jìn)行中醫(yī)證型分析,發(fā)現(xiàn)PD初期脾腎氣虛證的比例最大〔27,28〕。脾虛證通常伴隨著機(jī)體線粒體結(jié)構(gòu)或功能損傷,脾虛證與線粒體氧化損傷相關(guān),并影響能量代謝過程〔29〕。研究表明〔30～32〕,補(bǔ)脾中藥和復(fù)方可以通過改善脾氣虛導(dǎo)致的線粒體功能障礙。首先,四君子湯可明顯升高脾虛證大鼠骨骼肌線粒體超氧化物歧化酶(SOD)、Ca-Mg-ATP等酶活性,降低丙二醛(MDA)含量;其次,四君子湯明顯升高心衰大鼠心肌組織肌球蛋白輕鏈2、琥珀酰輔酶A連接酶(Suclg)2蛋白,下調(diào)絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體,表明健脾益氣中藥可減輕線粒體氧化損傷,調(diào)節(jié)能量代謝,改善骨骼、心臟功能〔30,31〕。林海鳴等〔32〕通過制備水濕困脾動(dòng)物病理模型,發(fā)現(xiàn)培土制水方能清除模型大鼠ROS,減少水濕困脾證大鼠心肌及小腸細(xì)胞線粒體的損傷,起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

線粒體自噬活性與脾氣是否充足密切相關(guān)。通過觀察脾氣虛大鼠海馬神經(jīng)元線粒體自噬水平及PINK1/Parkin途徑的變化,發(fā)現(xiàn)脾氣虛的發(fā)生可能與PINK1/Parkin途徑抑制所致的海馬神經(jīng)元線粒體自噬水平下降有關(guān)〔33〕。可見,中醫(yī)脾氣虧虛與線粒體功能障礙-自噬存在密切相關(guān)性。因此,健脾益氣法可能通過調(diào)控PINK1/Parkin通路影響PMC線粒體功能及其介導(dǎo)的自噬活性,激活其適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制,起到保護(hù)PMC損傷、防治PF的作用。

綜上,線粒體功能障礙可能是從脾論治PF的生物學(xué)基礎(chǔ)。從脾氣虛、線粒體功能相關(guān)指標(biāo)及脾與腹膜組織線粒體的結(jié)構(gòu)變化等方面探討從脾論治PF的療效機(jī)制,研究具有健脾益氣、活血祛瘀和絡(luò)的健脾益氣方能否調(diào)控PINK1/Parkin通路影響PMC線粒體功能及其介導(dǎo)的自噬活性,激活其適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制,可能是保護(hù)PMC損傷、防治PF的新靶點(diǎn)。本研究從調(diào)養(yǎng)后天之本出發(fā),以期豐富脾-腹膜臟象理論,為PF的防治提供參考和依據(jù)。