滕小梅 ,汪 蓉 ,倪春芳 ,梁 晨 ,張玉榮*

(1.青島海洋生物醫(yī)藥研究院,青島 266071;2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室,上海 200083)

我國吸毒的人數(shù)仍處于高位,濫用藥物與新型毒品的品種數(shù)量持續(xù)增長,禁毒工作面臨著嚴(yán)峻的形勢[1-2]。涉毒案件時有發(fā)生,毒物品種廣泛,具體案件分析目標(biāo)物不明確,給案件偵破造成很大的困難。目前的毒物篩查方法遠(yuǎn)不能滿足辦案的需要,建立快速、準(zhǔn)確的高通量篩查方法具有重要意義。

液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成功應(yīng)用于寬范圍的毒物篩查[3-6]。篩查技術(shù)需要強(qiáng)大數(shù)據(jù)庫的支持,與串聯(lián)四極桿質(zhì)譜相比,飛行時間質(zhì)譜具有更高的質(zhì)量數(shù)分辨率和掃描速率[3],不受限于檢測化合物的數(shù)目,以更高的靈敏度提供了具有非靶向篩選能力的完整質(zhì)譜數(shù)據(jù),因而更適合未知多目標(biāo)物的篩查。事實上,飛行時間質(zhì)譜已被證明對于法醫(yī)毒理學(xué)篩查非常有效[7-11]。

血液(血漿、血清)、尿液、胃內(nèi)容物、唾液、毛發(fā)等是涉毒案件中常見的生物檢材[12-13],本課題組前期工作[14]已建立超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(UHPLC-Q-TOF/MSE,其中E 是能量energy的簡寫,MSE技術(shù)可以設(shè)置兩個不同能量通道,同時獲得母離子和碎片離子信息)篩查人全血中150種藥物與毒物的方法,包含苯二氮艸卓類、抗抑郁藥、阿片類、除草劑、殺蟲劑等。與血清或血漿相比,尿液取樣方便,所含藥物與毒物含量相對較高[12,15],本工作進(jìn)一步完成了篩查尿液中150種藥物與毒物,并進(jìn)行了方法學(xué)驗證,可為涉毒案件偵破工作提供快速、準(zhǔn)確的篩查方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀;Xevo QTOF 型四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀,配Lock-spray接口、Masslynx V4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和UNIFI篩查軟件;ELGA Labwater PURELAB型純化水系統(tǒng)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取150種化合物標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)不同理化性質(zhì)采用甲醇或乙腈作溶劑,分別配制成1.0 g·L－1或0.1 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,保存于－20 ℃。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:5 mg·L－1,取適量的150種化合物的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,混合,用甲醇稀釋,配制成5 mg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

系統(tǒng)適用性溶液:采用10 種不同相對分子質(zhì)量、極性和化學(xué)性質(zhì)的化合物的混合溶液作系統(tǒng)適用性溶液,10種化合物分別為尼古丁、東莨菪堿、米那普侖、曲普利啶、噻奈普汀、泰必利、丁咯地爾、曲唑酮、氯氮平和奮乃靜。使用前將購買的系統(tǒng)適用性溶液用水稀釋至100μg·L－1,在每次分析運行開始時進(jìn)樣,以驗證儀器性能。

甲醇、乙腈、甲酸和甲酸銨均為色譜純;四硼酸鈉、氫氧化鈉、二氯甲烷、異戊醇、乙醚和己烷均為分析純;試驗用水為自制超純水(電阻率18.2 MΩ·cm,總有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1×10－9)。

使用的150種化合物標(biāo)準(zhǔn)品購自公安部物證鑒定中心、中國食品藥品檢定研究院、上海市農(nóng)藥研究所等不同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)廠家。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,3.5μm);柱溫50 ℃;樣品室溫度4 ℃;進(jìn)樣量10μL;流動相A 為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的乙腈溶液,B為5 mmol·L－1甲酸銨溶液(pH 3.0);流量420μL·min－1。梯度洗脫程序:0～0.50 min時,A 為13%;0.50～10.00 min時,A 由13%升至50%;10.00～10.75 min時,A 由50%升至95%,保持1.50 min;12.25～12.50 min時,A 由95%降至13%,保持2.50 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源,正離子全掃描模式,離子源溫度120 ℃;毛細(xì)管電壓3 000 V,錐孔電壓25 V;去溶劑氣(氮氣)流量800 L·h－1,溫度450 ℃;錐孔氣(氮氣)流量20 L·h－1;低碰撞能量6 eV;高碰撞能量10～30 eV;質(zhì)量數(shù)采集范圍質(zhì)荷比(m/z)50～1 000 Da。以亮氨酸腦啡肽(m/z556.277 1)實時進(jìn)樣,校正外界環(huán)境造成的質(zhì)量數(shù)偏移,質(zhì)量濃度為2 mg·L－1,流量為5μL·min－1。其他質(zhì)譜參數(shù)見文獻(xiàn)[14]中表1。

表1 保留時間的精密度試驗結(jié)果(n＝8)Tab.1 Results of test for precision of retention time(n＝8)

1.2.3 篩查條件

采用Masslynx V4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和UNIFI篩查軟件采集數(shù)據(jù)和控制儀器。收集150種藥物與毒物的保留時間和質(zhì)譜信息,建立質(zhì)譜庫文本數(shù)據(jù),導(dǎo)入UNIFI篩查軟件,對未知物進(jìn)行高通量快速篩查。將數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時間、母離子及碎片離子信息與實際樣品的進(jìn)行對比,保留時間偏差的絕對值小于0.25 min及質(zhì)量數(shù)偏差的絕對值小于10 m Da的化合物將會自動顯示在篩查結(jié)果中,即為陽性結(jié)果。在每個序列開始時首先進(jìn)樣系統(tǒng)適用性溶液,并根據(jù)系統(tǒng)適用性化合物的保留時間和準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)偏差來設(shè)定篩查的標(biāo)準(zhǔn)范圍。

1.3 試驗方法

參照文獻(xiàn)[14]取250μL 尿液于2 mL 離心管中,準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL及pH 9.5的飽和硼酸鹽溶液125μL,渦旋混合15 s。將750μL 提取溶劑體積比為50∶30∶20∶0.5的乙醚-二氯甲烷-己烷-異戊醇混合液加入離心管中,渦旋60 s。以轉(zhuǎn)速13 000 r·min－1離心5 min,轉(zhuǎn)移上層(有機(jī)層)液體至1.5 mL的離心管中。在50 ℃水浴空氣流下?lián)]干,殘渣用250μL 初始流動相溶液復(fù)溶,渦旋混合,按儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜行為和定性分析

以篩查實際案件的陽性結(jié)果為例,圖1是在儀器工作條件下篩查得到的氟哌啶醇質(zhì)譜圖。

圖1 氟哌啶醇的質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of haloperidol

由圖1可知,在低碰撞能量時得到的氟哌啶醇母離子為m/z376.147 4,與理論值m/z376.147 5基本一致;在高碰撞能量時得到的氟哌啶醇碎片離子為m/z165.069 5和358.137 6,與理論值(m/z165.071 1和358.136 9)相符。

150種化合物是根據(jù)化合物的保留時間和母離子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)來鑒定的,碎片離子也包含在內(nèi),用來提高鑒別的可信度和區(qū)分同分異構(gòu)體的可能性。在本工作測定的150種化合物中,共有13組同分異構(gòu)體?；诓煌谋Ａ魰r間或獨特的碎片離子,13組同分異構(gòu)體中的10 組可以成功地彼此區(qū)分;其余3組同分異構(gòu)體,即麻黃堿和偽麻黃堿、倍他米松和地塞米松、嗎啡和氫嗎啡酮不能通過上述方法具體區(qū)分。

2.2 保留時間的精密度試驗

取空白尿液,添加系統(tǒng)適用性溶液(100μg·L－1),并按試驗方法測定,用于評估保留時間的重現(xiàn)性。通過分析同一日8次進(jìn)樣及連續(xù)8日每日進(jìn)樣一次的尿液樣本數(shù)據(jù),計算保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),以考察系統(tǒng)適用性化合物保留時間的日內(nèi)和日間精密度,結(jié)果見表1。

2.3 選擇性試驗

取空白尿液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)尿液(加標(biāo)量為25.0μg·L－1),按試驗方法測定,以各目標(biāo)物保留時間、母離子及碎片離子信息進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明,空白尿液背景未見內(nèi)源性物質(zhì)干擾,加標(biāo)尿液與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物的保留時間及離子對信息一致。

2.4 殘留試驗

進(jìn)樣一針高濃度水平(質(zhì)量濃度為200μg·L－1)的尿液后,再進(jìn)3 針空白溶劑,考察化合物在整個檢測系統(tǒng)的殘留情況。結(jié)果顯示,第一針空白溶劑進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)普拉西泮和普羅帕酮有殘留,但后續(xù)兩針空白進(jìn)樣后沒有再出現(xiàn)。因此,篩查遇到這兩種化合物時,需要加一針空白溶劑。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

選取68個化合物作為代表性化合物,這些化合物的保留時間貫穿150種化合物的出峰位置?？疾炝?8個化合物在尿液中的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(RE)。基質(zhì)效應(yīng)包含絕對基質(zhì)效應(yīng)(a ME)和相對基質(zhì)效應(yīng)(r ME)。試驗采用絕對基質(zhì)效應(yīng)來評估基質(zhì)對化合物質(zhì)譜信號的抑制或增強(qiáng)程度。

取空白尿液,按試驗方法處理樣品,收集上層有機(jī)溶劑,在有機(jī)溶劑中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,搖勻,于50℃水浴空氣流下?lián)]干,殘渣用250μL初始流動相溶液復(fù)溶,按試驗方法進(jìn)行測定,各分析物的峰面積記作A;取標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 ℃水浴空氣流下?lián)]干,然后用250μL初始流動相溶液復(fù)溶,按儀器工作條件進(jìn)行測定,各分析物的峰面積記作B;按照a ME＝A/B×100%計算絕對基質(zhì)效應(yīng)。

取空白尿液,加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗方法處理樣品,并進(jìn)樣測定,各分析物的峰面積記作C,按照RE＝C/A×100%計算提取回收率。結(jié)果見表2。

表2 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率Tab.2 Matrix effect and recovery of extraction

試驗所建立的篩查方法是初篩尿液中藥物與毒物的定性方法,本課題組前期已建立全血基質(zhì)的篩查方法[14]。全血與尿液都是常見的生物檢材,考慮到實際案件的應(yīng)用,不同生物檢材采用相同的方法,操作簡單,且有利于推廣,因此試驗采用與血樣一致的樣品前處理方法來處理尿樣。由表2可知,該方法的絕對基質(zhì)效應(yīng)為23.1%～119%,平均值為69.5%;提取回收率為30.8%～115%,平均值為84.6%。尿液主要成分是水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%～97%)、無機(jī)鹽(主要是鈉鹽和氯鹽)和有機(jī)物(主要是尿素,還含有少量的糖類、蛋白質(zhì)、酶、性激素等)[3],主要的干擾成分是無機(jī)鹽[16];另外,尿液中含有的各種酶會使部分目標(biāo)物發(fā)生酶解。尿液中一些化合物的絕對基質(zhì)效應(yīng)較明顯,可能是因為一些內(nèi)源性物質(zhì)(如無機(jī)鹽、酶)未完全去除干凈而造成的。

通過計算6個來源空白尿液基質(zhì)得到的A/B的變異系數(shù),得到化合物在不同批次尿液基質(zhì)間的相對基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,除地芬諾酯(相對基質(zhì)效應(yīng)40.7%)、甲基麻黃堿(相對基質(zhì)效應(yīng)19.1%)外,其他化合物的相對基質(zhì)效應(yīng)均小于15%,說明化合物在不同批次尿液中受到的基質(zhì)影響差異小。

綜上可知,對于多種藥物與毒物的同時測定,這些化合物的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率還是可以接受的,說明本方法仍不失為一種可行的檢測方法。

2.6 檢出限

在空白尿液中添加不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,化合物在尿液中的質(zhì)量濃度分別為0.2,1.0,5.0,25.0,100.0,200.0μg·L－1,按試驗方法對上述溶液處理后進(jìn)樣分析。以3倍信噪比(S/N)計算各化合物的檢出限(3S/N),結(jié)果見表3。

表3 檢出限Tab.3 Detection limits

由表3 可知:150 種化合物的檢出限為0.2～25.0 μg·L－1,其中112 個化合物的檢出限為0.2μg·L－1,20 個化合物的檢出限為1.0μg·L－1,13個化合物的檢出限為5.0μg·L－1,5個化合物的檢出限為25.0μg·L－1。

2.7 穩(wěn)定性試驗

在空白尿液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(各化合物的質(zhì)量濃度均為25.0μg·L－1),考察了不同條件下樣品的穩(wěn)定性,包括短期穩(wěn)定性(將尿液樣品于室溫存放7 h)、長期穩(wěn)定性(將尿液樣品于－20 ℃存放10 d)、處理后進(jìn)樣器放置穩(wěn)定性(尿液樣品經(jīng)處理后在自動進(jìn)樣器中于4 ℃存放24 h)和凍融穩(wěn)定性(將尿液樣品于－20 ℃存放24 h,取出置于室溫下30 min,將尿液樣品溶解后再于－20 ℃存放24 h,如此重復(fù)凍融3個循環(huán),第3個循環(huán)時進(jìn)行測定)。

結(jié)果表明:O3-單乙酰嗎啡、敵百蟲、海洛因和普拉西泮于室溫存放7 h不穩(wěn)定;氯硝西泮、東莨菪內(nèi)酯、乙草胺、魚藤酮、奧沙西泮、海洛因、O3-單乙酰嗎啡于－20 ℃存放10 d后發(fā)生部分降解;除福爾可定、氯丙嗪和硝西泮外,所有化合物在自動進(jìn)樣器中于4 ℃存放24 h后均保持穩(wěn)定;O3-單乙酰嗎啡在3次凍融循環(huán)條件下降解。對于上述化合物的更優(yōu)儲存條件還需進(jìn)一步研究。

2.8 實際案例分析

將建立的篩查方法用于實際案例分析。篩查120個尿液實際案例,共有10個樣品(1?！?0＃)呈陽性(咖啡因沒有統(tǒng)計),分別為氯胺酮和去甲氯胺酮(1＃)、氯硝西泮(2＃)、嗎啡(3＃)、地西泮和去甲基安定(4＃)、氯硝西泮和阿普唑侖(5＃)、甲基安非他明(6＃)、可卡因(7＃)、東莨菪堿(8＃)、阿普唑侖和α-羥基-阿普唑侖(9＃)、氟哌啶醇(10＃)。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對篩查的陽性樣品進(jìn)行了驗證,證明了UHPLC-Q-TOF/MSE方法作為日常篩查工具的適用性。

本工作建立了尿液中150種藥物與毒物的篩查技術(shù),采用相同的樣品前處理、色譜系統(tǒng)和檢測系統(tǒng),新的化合物可以很容易添加到篩查方法中,方法快速簡單、準(zhǔn)確可靠,有利于推廣。另外,涉毒案件復(fù)雜,涉及的生物檢材多種多樣,下一步工作將開發(fā)其他基質(zhì)中藥物與毒物的檢測手段,并進(jìn)一步擴(kuò)充篩查數(shù)據(jù)庫,為涉毒案件偵破工作提供準(zhǔn)確、高效的多未知目標(biāo)物篩查技術(shù),提高辦案效率。