畢 珊,吳玉田,楊紹群,劉貴榮,王穎怡,趙正雨

(貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴陽(yáng) 550004)

交鏈孢霉又稱鏈格孢霉菌,普遍分布于自然界中,是一種極為常見(jiàn)的腐生菌和植物病原菌[1-2],其產(chǎn)生的毒素種類達(dá)70 余種,主要包括交鏈孢酚(AOH)、交鏈孢酚單甲醚(AME)、細(xì)交鏈孢菌酮酸(TeA)和騰毒素(TEN)[3-4]。交鏈孢霉毒素對(duì)人體具有一定的致癌、致畸等慢性或急性毒性作用,如果多種交鏈孢霉毒素同時(shí)存在可產(chǎn)生協(xié)同作用,導(dǎo)致毒性增強(qiáng)[5-6]?？ㄗ咽莻涫軞g迎的大眾休閑食品,亦可作為食用油原料?？ㄗ言趦?chǔ)藏過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、發(fā)霉、變質(zhì)等現(xiàn)象,易受到交鏈孢霉毒素的污染,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大大降低甚至?xí)?duì)人體造成傷害。因此,監(jiān)測(cè)葵花籽中交鏈孢霉毒素的含量具有重要意義。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于食品中交鏈孢霉毒素檢測(cè)技術(shù)方面的文獻(xiàn)報(bào)道[7-13],其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于具有靈敏度高、定性準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn),已經(jīng)成為主流方法,但我國(guó)尚未建立食品中交鏈孢霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)也鮮有關(guān)于測(cè)定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的報(bào)道。本工作針對(duì)葵花籽基質(zhì)樣品,提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測(cè)定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的方法,并用于實(shí)際樣品檢測(cè),以期了解葵花籽中交鏈孢霉毒素污染狀況,同時(shí)為葵花籽中交鏈孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)方法的研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX QTRAP 6500＋型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;MPW-352R 型高速冷凍離心機(jī);TTC-DC11型氮吹儀;Milli-Q 型超純水機(jī);Waters Oasis HLB固相萃取柱。

單標(biāo)準(zhǔn)溶液:100.0 mg·L－1,準(zhǔn)確稱取1.0 mg AOH、AME、TeA、TEN 標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解、稀釋,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質(zhì)量濃度均為100.0 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)溶液。同法制備交鏈孢酚-d2(AOH-d2)、交鏈孢酚單甲醚-d3(AME-d3)、細(xì)交鏈孢菌酮酸-d13(TeA-d13)、滕毒素-d3(TEN-d3)的單內(nèi)標(biāo)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋,配制成AME質(zhì)量濃度為10.0μg·L－1、TEN 和AOH 質(zhì)量濃度為100.0μg·L－1、TeA 質(zhì)量濃度為500.0μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合內(nèi)標(biāo)溶液:移取適量的單內(nèi)標(biāo)溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋,配制成AME-d3質(zhì)量濃度為100.0μg·L－1、TEN-d3和 AOH-d2的質(zhì)量濃度為1 000.0μg·L－1、TeA-d13的質(zhì)量濃度為5 000.0μg·L－1的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)品:AOH,10 mg/瓶;AME,10 mg/瓶;TeA,10 mg/瓶;TEN,1 mg/瓶;AOH-d2,1 mg/瓶;AME-d3,1 mg/瓶;TeA-d13,1 mg/瓶;TEN-d3,0.25 mg/瓶。

乙腈、甲醇均為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫40 ℃;進(jìn)樣體積3.0 μL;流量0.2 mL·min－1;流動(dòng)相A 為1.0 mmol·L－1碳酸氫銨溶液,B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～2.0 min時(shí),B為5%;2.0～4.0 min時(shí),B由5%升至90%,保持2.0 min;6.0～6.5 min時(shí),B由90%降至5%,保持3.5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負(fù)離子(ESI－)掃描模式;噴霧電壓4 500 V;離子源溫度500 ℃;霧化氣1壓力0.4 MPa,霧化氣2 壓力0.4 MPa,氣簾氣壓力0.2 MPa,碰撞氣壓力0.1 MPa;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

用高速粉碎機(jī)粉碎葵花籽樣品,取2.5 g,置于50 mL聚丙烯刻度離心管中,加入500.0μL混合內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,放置過(guò)夜,加入25.0 mL 體積比為45∶10∶45的乙腈-甲醇-0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)混合液,以轉(zhuǎn)速2 500 r·min－1振蕩提取10 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液,并用水定容至30.0 mL,搖勻。取6.0 mL提取液,加入15.0 mL 0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0),搖勻,過(guò)Waters Oasis HLB固相萃取柱(預(yù)先用5.0 mL甲醇和5.0 mL水活化),用20%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液淋洗,抽干固相萃取柱,用10 mL體積比為1∶1的含1%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水的甲醇-乙腈混合液進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,在水浴40 ℃下氮吹至近干,殘?jiān)?00.0μL甲醇復(fù)溶,并用水定容至2.0 mL,渦旋后按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

4種交鏈孢霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際葵花籽樣品的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms

2.2 固相萃取柱的選擇

Waters Oasis HLB固相萃取柱是一種適用于酸性、中性和堿性化合物的通用性凈化小柱,其良好的化學(xué)穩(wěn)定性、高而穩(wěn)定的回收率備受研究者的青睞。為驗(yàn)證Waters Oasis HLB固相萃取柱在葵花籽基質(zhì)凈化中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式,在相同加標(biāo)量(AME 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0μg·kg－1,AOH 和TEN 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0μg·kg－1,TeA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0μg·kg－1)條件下制備6個(gè)平行樣,將Waters Oasis HLB柱(簡(jiǎn)稱HLB柱)與實(shí)驗(yàn)室常用的Hypersep Retain PEP柱(簡(jiǎn)稱PEP柱)、Hypersep C18柱(簡(jiǎn)稱C18柱)的凈化效果進(jìn)行對(duì)比(除不加混合內(nèi)標(biāo)溶液外,樣品提取與凈化同1.3節(jié))。

3種固相萃取柱凈化下葵花籽基質(zhì)樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 3種固相萃取柱凈化下目標(biāo)物的回收率Fig.2 Recovery of targets purified by three solid phase extraction columns

由圖2可知:固相萃取柱凈化下葵花籽基質(zhì)樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率為46.3%～114%,HLB柱對(duì)葵花籽基質(zhì)樣品中目標(biāo)物的回收率最好,其次是PEP柱、C18柱。原因在于HLB柱的吸附劑是水脂平衡的水可浸潤(rùn)的反相吸附劑,由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物,其吸附容量較高,吸附性較強(qiáng),與C18柱鍵合了硅膠相比,吸附劑的表面積增大2～3倍,凈化效果較好;PEP 柱采用高純度、高滲透率的苯乙烯二乙烯基聚合物,鍵合脲功能團(tuán)使它對(duì)極性和非極性分析物均有保留,其表面同時(shí)具有親水性和憎水性基團(tuán),吸附能力也遠(yuǎn)高于C18柱,4種毒素在PEP柱上仍有較好的回收率;C18柱鍵合硅膠,適用于高保留性烷基鍵合相化合物,吸附能力弱,對(duì)含油脂的葵花籽基質(zhì)中目標(biāo)物的保留能力較差,且雜質(zhì)干擾較大,不建議在含油性基質(zhì)的凈化過(guò)程中使用。因此,試驗(yàn)選擇Waters Oasis HLB固相萃取柱為凈化柱。

2.3 洗脫劑的選擇

保證其他條件不變,試驗(yàn)考察了不同洗脫劑(5.0 mL甲醇＋5.0 mL乙腈、10 mL體積比為1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液)的洗脫效果。結(jié)果顯示:使用兩種洗脫劑時(shí),目標(biāo)物的回收率無(wú)太大差別,但洗脫劑中有氨水時(shí)目標(biāo)物峰形更為尖銳、信號(hào)更強(qiáng),同時(shí)基線也更平滑。因此,試驗(yàn)選擇10 mL體積比為1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液作為洗脫劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定下限

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0,20,50,100,200,400,800,1 000μL置于不同的10 mL容量瓶中,均加入適量的混合內(nèi)標(biāo)溶液,依次加入甲醇500,480,450,400,300,100,0,0μL,用水定容,配制成AME 的質(zhì)量濃度分別為0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.00μg·L－1,TEN 和AOH 的質(zhì)量濃度分別為0,0.20,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.0μg·L－1,TeA 的質(zhì)量濃度分別為0,1.00,2.50,5.00,10.0,20.0,40.0,50.0μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,其中同位素內(nèi)標(biāo)TeA-d13的質(zhì)量濃度均為25.0μg·L－1,AOH-d2和 TEN-d3的質(zhì)量濃度均為5.00μg·L－1,AME-d3的質(zhì)量濃度均為0.50μg·L－1。按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線性參數(shù)和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

以10倍信噪比(S/N)計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

隨機(jī)選取3份陽(yáng)性樣品,每份樣品制備7組平行樣,按照試驗(yàn)方法測(cè)定,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝7)Tab.3 Results of test for precision(n＝7)

由表3 可知,各目標(biāo)物測(cè)定值的RSD 為3.9%～12%,表明方法重現(xiàn)性良好,該檢測(cè)方法的建立具有實(shí)際可操作性。

2.6 回收試驗(yàn)

對(duì)空白葵花籽樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平同時(shí)設(shè)計(jì)6組平行試驗(yàn),按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率和測(cè)定值的RSD,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of test for recovery(n＝6)

由表4可知,目標(biāo)物的回收率為75.0%～112%,測(cè)定值的RSD 為4.3%～12%,說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度良好,并進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的精密度良好。

2.7 樣品分析

隨機(jī)抽取市售散裝、袋裝葵花籽樣品19份,按照試驗(yàn)方法測(cè)定4種交鏈孢霉毒素的含量,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of the samples

由表5可知:AOH、AME、TeA 和TEN 檢出率分別為36.8%,52.6%,89.5%,84.2%。檢出率和檢出量最高的是TeA,平均值為1 890.16μg·kg－1,主要源于葵花籽在加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏期間發(fā)生霉變;TEN 的檢出率次之,平均值為20.26μg·kg－1。可見(jiàn),葵花籽中4種交鏈孢霉毒素均有不同程度檢出,其中受TeA 毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)最大,其次是TEN。

本工作提出了UHPLC-MS/MS測(cè)定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的方法,同時(shí)對(duì)3種常見(jiàn)的固相萃取柱進(jìn)行了對(duì)比,對(duì)洗脫劑進(jìn)行了考察,采用內(nèi)標(biāo)法定量,提高了定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。本方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度好、靈敏度高等特點(diǎn),適用于葵花籽中4種交鏈孢霉毒素含量的測(cè)定。對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),葵花籽中4種交鏈孢霉毒素的暴露水平高,污染情況嚴(yán)重,其中,TeA 和TEN 檢出率高,且以TeA 污染情況最為嚴(yán)重。若經(jīng)常食用受毒素污染的葵花籽或葵花籽油會(huì)對(duì)人體健康造成一定影響,相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)交鏈孢霉毒素污染水平的監(jiān)測(cè)與調(diào)查,保障人民的身體健康,同時(shí)為制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。