鄔海艷, 閆瑾, 鄒宜芯, 任玉欣, 李慧

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院,天津 300392)

全球土壤鹽堿化現(xiàn)象日益嚴(yán)重,一般認(rèn)為由NaCl、Na2SO4等中性鹽引起的脅迫稱為鹽脅迫,由Na2CO3、NaHCO3等堿性鹽引起的脅迫稱為堿脅迫[1]。相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示,全球約20%的灌溉土壤受鹽脅迫的影響,除自然原因外,環(huán)保意識(shí)的缺失、不良的灌溉方式與施肥方式等都是使土壤中鹽分增加的原因[2-4]。土壤鹽堿化使土壤肥力下降,影響植物新陳代謝,最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量與質(zhì)量下降,經(jīng)濟(jì)效益也受到一定影響[5-6]。

植物經(jīng)歷過生物或非生物脅迫后,再次面對(duì)脅迫時(shí)就會(huì)產(chǎn)生更高的抵御能力,這種逆境記憶已在多物種之中陸續(xù)發(fā)現(xiàn),例如馬鈴薯、小麥、番茄等[7-8]。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)日益成熟,使用含鹽的培養(yǎng)基篩選并鑒定植物的耐鹽性成為常規(guī)手段。使用含NaCl培養(yǎng)基誘導(dǎo)小麥的幼胚和幼穗,獲得耐鹽性植株,對(duì)其進(jìn)行連續(xù)重復(fù)選擇,發(fā)現(xiàn)后代仍能保持耐鹽性[9-10]。植物的逆境脅迫記憶可能是長期的也可能是短期的,并且植物的耐鹽性在當(dāng)代表現(xiàn)較為強(qiáng)烈,其后代也具有一定耐鹽性。綜上所述,植物的逆境適應(yīng)性能使植物再次遭遇脅迫時(shí),快速做出響應(yīng),產(chǎn)生一定耐鹽性。

青花菜為十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種,是我國大宗蔬菜之一。青花菜不僅含有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和多種活性物質(zhì),例如硫代葡萄糖苷、蘿卜硫素、類黃酮等,還具有抗癌、抗氧化等作用[11],因此其市場需求與受喜愛度日益增加。青花菜也是我國主栽的優(yōu)質(zhì)蔬菜之一,但我國其種質(zhì)資源匱乏,因此,對(duì)于青花菜的研究也成為近年來的熱點(diǎn)[12]。青花菜組培體系的建立,為鹽馴化青花菜提供基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以青花菜組培苗為材料,設(shè)置不同NaCl馴化濃度,研究高鹽脅迫下的馴化幼苗的生理指標(biāo)變化,探討鹽馴化對(duì)其生理調(diào)節(jié)機(jī)制的影響,為提高植物耐鹽性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青花菜(BrassicaoleraceaL. var.italica)為天津科潤蔬菜研究所江漢民博士惠贈(zèng)的KJ-18。

1.2 鹽馴化組培體系建立

種子消毒:使用多菌靈沖洗種子30 min,75%酒精清洗種子2 min(期間搖晃),無菌水沖洗2遍(每次2 min),2%次氯酸鈉消毒種子10 min,用無菌水沖洗至無殘留為止,濾紙吸水至種子表面無水分,后接種至MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d(培養(yǎng)溫度25 ℃)。生長7 d青花菜幼苗沿分生點(diǎn)切下,將分生點(diǎn)接種于分化培養(yǎng)基,分化7 d后接種于1/2 MS培養(yǎng)基生根,生根后的分生點(diǎn)即為無根苗。

1.3 組培苗鹽馴化方案

青花菜組培無根苗分別接種至含有75、100、150、200 mmol/L NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基中馴化7 d后,進(jìn)行225 mmol/L NaCl高鹽脅迫處理7 d。測定生理指標(biāo)(表1)。

表1 鹽馴化青花菜組培苗7 d的不同處理組合Table 1 Different treatment combinations for 7 d of salt-tamed broccoli tissue culture seedlings

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 生理生化指標(biāo)測定

葉綠素含量測定采用乙醇提取法,過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法,超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法,過氧化物酶活性(CAT)測定采用紫外吸收法,丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法,脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法,可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法,可溶性糖含量測定采用蒽酮法[13],總酚、類黃酮、花青素含量測定采用分光光度計(jì)法[14]。

1.4.2 硫代葡萄糖苷含量測定

取0.1 g樣品研磨至粉碎,置于110 ℃烘箱1 h;加入8 mL熱水(90 ℃),烘箱溫度100 ℃烘50 min,期間混勻兩次;結(jié)束后,靜置冷卻,用蒸餾水定容至10 mL,搖勻;用濾紙過濾,取1 mL于10 mL離心管中,加入0.15%羧甲基纖維素鈉溶液2 mL和氯化鈀溶液1 mL,搖勻后靜置2～3 h。以氯化鈀、羧甲基纖維素鈉的空白溶液做參比,測定540 nm的吸光度值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硫代葡萄糖苷含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理;使用Origin Pro 2022進(jìn)行作圖;應(yīng)用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用LSD和Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析。采用隸屬函數(shù)分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)綜合分析。

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式:

反隸屬函數(shù)值計(jì)算公式:

式中,Xi為生理指標(biāo)測定值,Xmin、Xmax為所有處理的各指標(biāo)的最小值與最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的抗氧化酶活性及MDA含量的影響

2.1.1 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的MDA含量的影響

由圖1A可以看出,MDA含量從高到低依次為CK2、CK1、T1、T4、T3、T2,其中CK2的MDA含量最高,說明MDA含量與脅迫濃度呈正相關(guān)變化。CK2的MDA含量較CK1顯著增加了42.34%。與CK2的MDA含量相比,馴化組分別顯著降低54.95%、84.84%、76.19%、73.25%,說明鹽馴化能有效降低高鹽脅迫下的青花菜的MDA含量。

圖1 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的抗氧化酶活性及MDA含量的影響A:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的MDA含量的影響;B:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的SOD活性的影響;C:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的POD活性的影響;D:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的CAT活性的影響。注:不同字母表示5%顯著水平。下同。Figure 1 Effect of salt acclimation for 7 d on the antioxidant enzyme activity and MDA content of broccoli tissue culture seedlings

2.1.2 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的SOD活性的影響

由圖1B可以看出,馴化組的SOD活性呈下降、上升、下降的變化趨勢。CK1與CK2之間SOD活性存在顯著差異(P<0.05),CK2較CK1顯著降低。與CK1的SOD活性相比,T3組無顯著差異,T1、T2、T4組顯著降低。與CK2的SOD活性相比,T3組顯著增加9.29%,T1、T2、T4組分別顯著降低14.20%、37.53%、75.67%。T4組的SOD活性達(dá)到最低,同時(shí)也是降低幅度最大的馴化處理組。

2.1.3 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的POD活性的影響

由圖1C可以看出,馴化組POD活性變化呈先升高后降低的趨勢。CK1、CK2之間的POD活性無顯著差異(P>0.05),馴化組的POD活性較CK1、CK2顯著增加,T1組較CK1、CK2分別顯著增加558.39%、758.21%。T1組為POD活性變化的拐點(diǎn),此時(shí)POD活性最大,POD活性增幅也是最大的。

2.1.4 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的CAT活性的影響

由圖1D可以看出,CAT活性水平從高到低排序依次為T1、CK2、T3、T2、CK1、T4。CK1、CK2與馴化組之間的CAT活性無顯著差異(P>0.05),與CK1的CAT活性相比,T4組降低33.33%。與CK2的CAT活性相比,T1組增加6.25%,T2、T3、T4分別降低25.00%、6.25%、75.00%。由此表明,鹽馴化調(diào)節(jié)青花菜植株地上部分活性氧穩(wěn)態(tài)主要依靠POD和SOD。

2.2 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.2.1 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗脯氨酸含量的影響

由圖2A可以看出,馴化組的脯氨酸含量呈先升高后降低的趨勢。CK1與CK2之間的脯氨酸含量存在顯著差異(P<0.05),與CK1的脯氨酸含量相比,CK2、T4組分別顯著降低69.05%、65.8%,T3組顯著增加了70.77%。與CK2的脯氨酸含量相比,T1、T2、T3組顯著增加了240.96%、143.90%、451.83%。馴化組的脯氨酸水平高于或近似CK1水平,說明鹽馴化能使青花菜組培苗積累脯氨酸含量,表現(xiàn)出良好的耐鹽性。

圖2 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響A:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的脯氨酸含量的影響;B:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的可溶性蛋白含量的影響;C:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的可溶性糖含量的影響。Figure 2 Effect of salt acclimation for 7 d on the content of osmoregulatory substances in broccoli tissue culture seedlings

2.2.2 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗可溶性蛋白含量的影響

由圖2B可以看出,除T1外,馴化組的可溶性蛋白含量基本穩(wěn)定。CK1與CK2之間的可溶性蛋白含量存在顯著差異(P<0.05),CK2的可溶性蛋白含量較CK1顯著降低。T1組的可溶性蛋白含量較CK1、CK2顯著降低。

2.2.3 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗可溶性糖含量的影響

由圖2C可以看出,可溶性糖含量變化由高到低排序依次是CK1、T1、T2、T3、CK2、T4。馴化組與CK2可溶性糖含量較CK1顯著降低。與CK2的可溶性糖含量相比,T1、T2、T3組分別顯著增加42.76%、36.40%、11.66%。

2.3 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的總酚、類黃酮、花青素含量的影響

2.3.1 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗總酚含量的影響

總酚含量由高到低依次為CK2、T3、T2、T1、CK1、T4(圖3A)。CK1與CK2之間總酚含量存在顯著差異(P<0.05),與CK1的總酚含量相比,CK2顯著增加116.1%,T1、T2、T3組分別顯著增加4.11%、5.82%、6.85%,T4組顯著降低75.68%。馴化組的總酚含量較CK2顯著降低,其中T4組降低幅度最大,顯著降低88.75%。

圖3 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的總酚、類黃酮、花青素含量的影響A:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的總酚含量的影響;B:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的類黃酮含量的影響;C:鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的花青素含量的影響。Figure 3 Effect of salt acclimation for 7 d on the total phenolic, flavonoid and anthocyanin contents of broccoli histoculture seedlings

2.3.2 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗類黃酮含量的影響

馴化組的類黃酮含量呈下降趨勢(圖3B)。與CK1的類黃酮含量相比,馴化組與CK2顯著降低。與CK2的類黃酮含量相比,馴化組分別顯著降低73.81%、73.59%、73.80%、77.49%。T4組的類黃酮含量最低且降低幅度較CK1、CK2都是最大。

2.3.3 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗花青素含量的影響

由圖3C可以看出,CK1與CK2之間的花青素含量無顯著差異(P>0.05)。與CK1的花青素含量相比,T4組顯著增加87.50%。與CK2的花青素含量相比,T1、T3組差異不顯著,T2、T4組分別顯著增加80.00%、200.00%。

2.4 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的耐鹽性分析

如表2所示,隸屬函數(shù)值由高到低依次為CK1、T3、T1、CK2、T2、T4。除CK1外,T3組的隸屬函數(shù)值的綜合得分最高,即經(jīng)150 mmol/L NaCl(T3)鹽馴化的青花菜組培苗的抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等指標(biāo)在高鹽下能恢復(fù)到近似正常CK1水平,說明鹽馴化能在一定范圍內(nèi)提高幼苗的耐鹽性。T4處理的各項(xiàng)生理指標(biāo)最差,說明200 mmol/L NaCl的濃度過高,不適宜作為馴化濃度。

表2 鹽馴化7 d的青花菜組培苗生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析Table 2 Membership function analysis of physiological indicators of broccoli tissue culture seedlings acclimated to salt for 7 d

2.5 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的硫代葡萄糖苷含量的影響

由隸屬函數(shù)分析可知,T3組的耐鹽調(diào)節(jié)能力最強(qiáng),所以挑選CK1、CK2與T3進(jìn)行硫代葡萄糖苷含量的測定。

由圖4可以看出,硫代葡萄糖苷含量由高到低排序依次為CK1、T3、CK2,各處理間的硫代葡萄糖苷含量存在顯著差異。

圖4 鹽馴化7 d對(duì)青花菜組培苗的硫代葡萄糖苷含量的影響Figure 4 Effect of salt acclimation for 7 d on glucosinolates content of broccoli tissue culture seedlings

3 討 論

植物的脅迫適應(yīng)(馴化)是一個(gè)較為復(fù)雜的過程,涉及植物的生理、分子及表觀遺傳水平上的變化。合適的馴化條件能增加植物的抗逆性。大量研究表明,逆境脅迫會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS并積累,影響植物細(xì)胞膜透性以及不飽和脂肪酸的氧化,從而影響植物的形態(tài)建成?？寡趸Ｗo(hù)是植物脅迫適應(yīng)的第一道防線,其酶活性水平可作為衡量植物抗性的重要指標(biāo)之一[15]。鹽脅迫下的甜菜耐鹽品系中,抗氧化物酶活性顯著升高,MDA含量減小[16]。本試驗(yàn)中,T1、T2組的POD活性較CK2顯著增加,T3組的SOD、POD活性較CK2顯著增加,T4組的SOD、CAT活性較CK2降低,POD活性較CK2顯著增加。經(jīng)鹽馴化的幼苗(T1—T4)比未經(jīng)鹽馴化的幼苗(CK2)較CK1(空白對(duì)照)變化較小,因此證明鹽馴化能活化青花菜的抗氧化酶,進(jìn)而提高植物的抗逆能力,鹽馴化使青花菜組培苗保持較高的SOD活性水平,這與低溫馴化辣椒的研究結(jié)果一致[17]。鹽馴化的CAT活性變化幅度小于SOD活性和POD活性,說明CAT活性對(duì)鹽馴化的青花菜影響較小,調(diào)控能力較弱,與申世銘對(duì)玉米幼芽的耐鹽性影響研究結(jié)果一致[18],SOD、POD活性水平能夠更好地反映出植物耐鹽性。MDA含量往往能體現(xiàn)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受氧化傷害的程度。馴化組的MDA含量較CK1、CK2顯著降低,其中T2、T3組的MDA含量降低幅度最大,這與董愛玲低溫馴化茄子幼苗研究結(jié)果一致[19],結(jié)合抗氧化物酶活性的變化,說明鹽馴化能使植物的抗氧化物酶活性水平增加,可有效清除高鹽脅迫產(chǎn)生的活性氧,調(diào)節(jié)植物的MDA含量變化,降低鹽分對(duì)植物造成的氧化傷害。

植物遭受鹽脅迫時(shí),因吸水困難造成滲透壓失衡,從而遭受滲透脅迫。植物體通過合成及積累無機(jī)、有機(jī)滲透保護(hù)物質(zhì),降低細(xì)胞水勢,維持光合作用、氣體交換和酶活性等生理過程的正常進(jìn)行[20]。研究表明,鹽脅迫下,煙草的脯氨酸含量積累不僅與滲透調(diào)節(jié)有關(guān),還與抗氧防御基因的表達(dá)有關(guān)[21]?？嘬牟嗽诘望}脅迫下(66～200 mmol/L NaCl),可溶性蛋白含量顯著增加,高鹽脅迫下(200～300 mmol/L NaCl),脯氨酸與可溶性糖含量顯著增加[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,馴化組的脯氨酸變化趨勢為先升高后降低。其中T1、T2組的脯氨酸含量與CK1水平一致,T3組的脯氨酸含量達(dá)到最大,說明中低鹽馴化能使植物在高鹽脅迫下通過增加脯氨酸含量增強(qiáng)青花菜組培苗的耐鹽性,這與甘草愈傷組織的鹽適應(yīng)研究結(jié)果一致[23]。T4組青花菜組培苗的脯氨酸和可溶性蛋白含量下降后趨于穩(wěn)定,說明青花菜在NaCl濃度超過200 mmol/L后滲透調(diào)節(jié)能力降低,這與賈鵬燕的研究結(jié)果一致[22]。馴化組的可溶性蛋白含量較CK2無顯著差異,較CK1顯著降低,與薄杉、秦麗鳳等人的研究結(jié)果一致[24-25],說明鹽馴化的青花菜可溶性蛋白含量在高鹽脅迫下的合成受阻或分解速度加快,可溶性蛋白不是主要有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。T1、T2、T3組的可溶性糖含量顯著高于CK2,T4組與CK2無顯著差異。蕓豆在50 mmol/L NaCl和100 mmol/L NaCl鹽脅迫下可溶性糖含量與脅迫濃度呈正相關(guān),但當(dāng)濃度為175 mmol/L NaCl時(shí),可溶性糖含量較CK(空白對(duì)照)顯著降低,與本試驗(yàn)結(jié)果一致[26]。

酚類物質(zhì)、類黃酮類和花青素等是植物的次生代謝產(chǎn)物,其含量與植物的風(fēng)味品質(zhì)、抗逆性及抗氧化等作用有著密切的聯(lián)系[27]。研究表明,酚類含量與抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)[28],類黃酮與酶促氧化劑的表達(dá)有關(guān),因此類黃酮也能通過清除自由基恢復(fù)植物的氧化平衡[29]。研究表明,耐鹽性強(qiáng)的甘蔗品種中,多酚類物質(zhì)、類黃酮和花青素含量均升高[30]。本試驗(yàn)中,馴化組的總酚和類黃酮含量較CK2顯著降低,說明不經(jīng)鹽馴化的青花菜幼苗(CK2),通過積累酚類和類黃酮類物質(zhì)含量來增加自身抗氧化能力,清除產(chǎn)生的過量ROS,這與銀杏鹽脅迫的研究結(jié)果一致[29],表明高鹽脅迫下,植物可通過積累多酚、類黃酮等活性物質(zhì)減少鹽害損傷。馴化組的花青素含量變化幅度不明顯,T4組的花青素含量較CK1、CK2顯著增加。硫代葡萄糖苷是十字花科蔬菜中一種重要的活性物質(zhì),具有多種生物學(xué)功能,例如抗癌、抗氧化、抗菌等[31]。本試驗(yàn)中,硫代葡萄糖苷含量與植物的耐鹽性有一定的關(guān)系,還待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

鹽馴化青花菜組培苗在高鹽脅迫下,通過提高抗氧化物酶(SOD、POD)活性水平和積累脯氨酸來提高其耐鹽能力。隸屬函數(shù)分析表明,T3組的馴化效果最好,耐鹽調(diào)節(jié)能力最佳。