楊嶸長

(寬甸滿族自治縣動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 寬甸 118200)

為避免豬流感病毒對養(yǎng)殖區(qū)域造成較大的影響，需重視豬流感病毒復(fù)制病毒，在篩選宿主基因的基礎(chǔ)上，尋找其中存在的SIV (結(jié)構(gòu)投資載體) 對豬生命周期造成的影響，深入研究SLC35A1 對豬流感病毒復(fù)制產(chǎn)生的干擾，從而根據(jù)檢測基因的方式，明確在自然環(huán)境下豬受感染的現(xiàn)象是如何產(chǎn)生的。 這樣，本研究則可基于SLC35A1 對豬流感病毒復(fù)制的影響，為后續(xù)的致病機(jī)理奠定良好的基礎(chǔ)。

1 豬流感病毒的基本概述

流感病毒隸屬于正黏病毒科，其中的基因組主要分為單股負(fù)鏈RNA，具體大小被規(guī)劃在12 ～14 kb，并且可以分為從A 到D 四種類型。此時，B 型、A 型內(nèi)的基因組片段有8 個；D型和C 型之間的基因組片段有7 個。 而B 型的感染性更強(qiáng)，其可以對人類的身體健康造成影響，引發(fā)人類出現(xiàn)感染問題，嚴(yán)重則會造成呼吸系統(tǒng)等疾病的產(chǎn)生；C 型的流感病毒是以寄生為主，其宿主范圍是豬和人。 在此基礎(chǔ)上，可結(jié)合血清學(xué)、流行病學(xué)以及病理學(xué)等方面的研究進(jìn)行分析，其中D 型的病毒主要是感染自然宿主，如牛等；A 型的流感病毒則可劃分為病毒表層的NA (神經(jīng)氨酸酶)、HA (抗原蛋白血凝素)[1]。

其中豬流感被認(rèn)定為其中的A 型病毒，會引起豬出現(xiàn)發(fā)熱、打噴嚏、厭食、流鼻涕、咳嗽以及呼吸困難等疾病。 在豬流感發(fā)生后一般在5 ～7 日內(nèi)可以恢復(fù)正常，但由于此病毒的致死率高達(dá)4% ～10%并且具有較高的發(fā)病率，一旦豬流感發(fā)生則會造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。 同時由于豬群在養(yǎng)殖過程中需控制屠宰體重，若發(fā)生豬流感豬的免疫力則會下降，引發(fā)其他的病毒的并發(fā)產(chǎn)生，如鏈球菌、巴氏桿菌、綜合征病毒等，提高的豬的死亡率，無法保證豬養(yǎng)殖人員的經(jīng)濟(jì)效益[2]。

2 SLC35A1 對豬流感病毒復(fù)制的影響

2.1 配置實驗材料及設(shè)備

2.1.1 材料 為監(jiān)測SLC35A1 對豬流感病毒復(fù)制的影響，可選取正確的實驗材料配置方式，運用固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基執(zhí)行實驗。選購8% 含量的polybrene，可選取粉末狀的polybrene，讓其在無菌的狀態(tài)下將培養(yǎng)基內(nèi)的離子水去除，保證其在充分溶解后能夠定容在25 mL 的溶液中，將其保存于4 ℃以內(nèi)，確保在實驗過程中相關(guān)材料試劑不會出現(xiàn)問題。

同時可選取50 × TAE 緩沖液，讓其能夠注入于800 mL 的離子水內(nèi)運用充分的攪拌方式，注入對應(yīng)的醋酸，在確保相互之間能夠完全混合后，讓其中的離子水能夠定容到1 000 mL 并且在室溫下進(jìn)行保存。 另外，可增加甘氨酸電泳、轉(zhuǎn)膜緩沖液等的應(yīng)用，讓其能夠在室溫條件下與鹽酸進(jìn)行混合，適量粉底增加愛甲醇，做好備用準(zhǔn)備[3]。

2.1.2 設(shè)備 在進(jìn)行實驗過程中需運用搖床、多功能PCR 儀、生化培養(yǎng)箱(恒溫)、冷凍離心機(jī)、顯微鏡、多功能酶標(biāo)儀等設(shè)備[4]。

2.2 設(shè)置實驗方法

2.2.1 細(xì)胞相關(guān)實驗 從豬的身體中獲取細(xì)胞，運用液氮容器對細(xì)胞進(jìn)行凍存，在應(yīng)用時直至液氮排凈后則可將其應(yīng)用于37 ～42 ℃的溫水內(nèi)。

同時若需將細(xì)胞進(jìn)行凍存，可將無血清培養(yǎng)基中血清、DMSO 以及凍存液的比例控制在6∶3∶1，讓細(xì)胞可以在4 ℃內(nèi)的冰箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)冷，將單層的細(xì)胞近懸浮，確?？梢宰⑷?5 mL 的細(xì)胞懸浮液，在執(zhí)行離心3 ～5 min后，則可將上清去除，將保存好的細(xì)胞進(jìn)行沉淀，在實驗環(huán)節(jié)將其進(jìn)行取出。

再者，為保證細(xì)胞的計數(shù)工作能夠順利實施，需將蓋玻片、計數(shù)板擦拭干凈，在單層細(xì)胞密集的區(qū)域，確保單個細(xì)胞呈現(xiàn)出懸浮的狀態(tài)，根據(jù)實驗要求吸出對應(yīng)的細(xì)胞，讓其密度可以稀釋到100 ～1 000 倍，這樣，則可讓懸浮液充滿整個計數(shù)板和蓋玻片以內(nèi)，在完成3 分鐘的靜止后，則可運用“計上不計下，計左不計右” 的方式，完成對細(xì)胞的計算。

2.2.2 病毒相關(guān)實驗 首先，通過病毒原液的應(yīng)用，執(zhí)行對應(yīng)的滅菌操作，在PBS 稀釋進(jìn)行時候，則可運用無菌的注射器，將200 μL的病毒進(jìn)行稀釋，保證其可以利用絨毛尿囊腔完成接種工作，在此操作執(zhí)行9 ～11 日后，則可運用石蠟進(jìn)行封口，讓其可以放置在37 ℃恒溫箱中完成對應(yīng)的孵化操作。 這樣，在豬流感病毒增殖培養(yǎng)過程中，實驗人員則可通過12 h 的觀察，運用雞胚胎來確認(rèn)其是否存活，若在接種完畢后48 ～72 h 以內(nèi)出現(xiàn)雞胚死亡的現(xiàn)象，則可將其放置于4 ℃的環(huán)境中，在4 h以內(nèi)完成離心操作，汲取其中的尿囊液并開展對應(yīng)的離心操作，保證在上清收集完畢后，可進(jìn)行高速的離心操作，讓其能夠進(jìn)入濾器過濾，在確認(rèn)病毒的滴度后，方可讓其進(jìn)入負(fù)80 ℃的環(huán)境下進(jìn)行保存。

其次，可運用豬流感病毒細(xì)胞接種的方式，在細(xì)胞板內(nèi)增加單層流感病毒的應(yīng)用。 優(yōu)先將病毒原液放置于無菌的環(huán)境中，讓其能夠進(jìn)行稀釋，保證可以運用無菌PBS 執(zhí)行對細(xì)胞的二次清洗。 由此方式，適當(dāng)?shù)卦黾硬《疽旱膽?yīng)用，促使流感病毒能夠在37 ℃內(nèi)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行一個小時的孵化。 這樣，在每孔內(nèi)都已經(jīng)完全棄去病毒液后，則可運用無菌PBS 洗液執(zhí)行二次清洗操作，讓青鏈霉素含量為1%，使其可以在現(xiàn)象的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行繁殖。

最后，可在37 ℃的室溫內(nèi)進(jìn)行對豬流感病毒的培養(yǎng)，讓實驗人員可以根據(jù)不同的時間點對細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行觀察，運用收集上清的方式，合理地規(guī)劃存活細(xì)胞數(shù)量。 這樣，則可在96 孔微量的反應(yīng)板上執(zhí)行對應(yīng)的操作。 實驗人員通過左右孔內(nèi)注入50 μL 生理鹽水的方式，讓病毒液能夠與之混合，在二者充分融合后，方可將其中的50 μL 病毒液吸出，將其應(yīng)用于第二個孔內(nèi)，按照次序依次對其進(jìn)行吸取。 在此基礎(chǔ)上，則可將12 個孔內(nèi)豬流感病毒的變化情況進(jìn)行分析，運用12 孔內(nèi)的陰性對照實驗，保證不同孔內(nèi)的細(xì)胞懸浮液可以自右至左進(jìn)行排列。 據(jù)此，則可在穩(wěn)定15 min 后按照操作需求，在激光顯微鏡下進(jìn)行對應(yīng)的觀察操作，順利檢測出SLC35A1 對豬流感病毒復(fù)制的影響。

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 創(chuàng)建SLC35A1 敲除細(xì)胞系，抑制SIV增殖 SLC35A1 對豬流感病毒復(fù)制具有一定的增值影響，運用實驗比對的方式可驗證了12個準(zhǔn)確的候選因素，一旦SLC35A1 被敲定，則可看出其對豬流感病毒復(fù)制產(chǎn)生的抑制作用，當(dāng)豬已經(jīng)感染流感病毒72 h 之后，細(xì)胞的存貨數(shù)量相對較多，此時為創(chuàng)建出SLC35A1的細(xì)胞敲除體系，可基于NPTr -Cas9 細(xì)胞進(jìn)行考慮，運用ALG5 的操作方式，在NPTr -Cas9 的基礎(chǔ)上構(gòu)建對應(yīng)的SLC35A1 敲除細(xì)胞組。 這樣，則可結(jié)合實驗中4 株單克隆細(xì)胞，讓其他病株不會受到影響，運用野生型的對照方式，在36 小時后測定4 株單克隆細(xì)胞所受到的抑制性作用。 得出結(jié)果，在第3、第4 株單克隆細(xì)胞對豬流感病毒的增殖細(xì)胞抑制作用作為強(qiáng)烈。 同時為印證SLC35A1 對NPTr -Cas9 的影響，需將 SIV 劃分為 NPTr -ΔSLC35A1 以及NPTr -Cas9，通過12 h、24 h以及36 h 的試驗對比方式，正確地收集存活細(xì)胞及上清。 經(jīng)實驗表明，前者可表達(dá)為通過蛋白定量檢測的方式，展現(xiàn)出其中涵蓋的NP蛋白表達(dá)量，而后者內(nèi)所檢測出的病毒為TCID50。 據(jù)此，則可根據(jù)SLC35A1 敲除操作，了解在SLC35A1 應(yīng)用后，其會對SIV 產(chǎn)生一定的抑制作用。

2.3.2 發(fā)揮SLC35A1 敲除作用，抑制豬流感病毒吸附 由于SLC35A1 作為一種唾液酸轉(zhuǎn)運蛋白，其在生成過程中需要唾液酸進(jìn)行合成，當(dāng)出現(xiàn)豬流感病毒時，唾液酸會吸附于細(xì)胞的表面，運用HA 與細(xì)胞表層結(jié)合的方式，形成唾液酸。 在此背景下，可通過實驗研究的方式，掌握SLC35A1 敲除后期是否能夠?qū)ωi流感病毒的吸附造成影響。

通過NPTr - Cas9 細(xì)胞的復(fù)制，讓其能夠進(jìn)行高速的冷凍以及濃縮，控制好SIV 的狀態(tài)，讓操作人員可以運用MOI ＝75 的劑量，實現(xiàn)SLC35A1 敲除細(xì)胞與SIV 的反應(yīng)。 首先，可將病毒進(jìn)行固定，在經(jīng)過一段吸附時間后，運用依次發(fā)育的方式，執(zhí)行顯微鏡與激光工具的觀察。 經(jīng)結(jié)果下顯示，在野生型細(xì)胞內(nèi)病毒會出現(xiàn)于細(xì)胞膜的附近，并且會在短時間內(nèi)進(jìn)行聚集。 但在SLC35A1 敲除細(xì)胞的觀察過程中未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒顆粒。 據(jù)此，則可運用細(xì)胞比對的方式，掌握SLC35A1 于HA 之間存在無法結(jié)合的問題，表示當(dāng)SLC35A1 敲除細(xì)胞系運行過程中，其會對SIV 造成一定的影響，了解到豬流感的產(chǎn)生是由于細(xì)胞表層與病毒顆粒的集合效率下降造成。

其次，在SLC35A1 敲除后，能夠了解到HA 會產(chǎn)生一定的吸附抑制作用，其可以保證SIV 不會持續(xù)增殖。

2.3.3 開展SLC35A1 實驗，調(diào)控豬流感病毒復(fù)制問題 通過凝集素實驗的方式，印證SLC35A1 敲除過程中細(xì)胞表層所發(fā)生的唾液酸受阻現(xiàn)象，運用流式細(xì)胞術(shù)掌握細(xì)胞在敲除后細(xì)胞與HA 蛋白的結(jié)合量呈現(xiàn)出下降的趨勢，由此則可判定SLC35A1 對豬流感病毒的抑制的作用。 通過3F -Neu5Ac 來對唾液酸的轉(zhuǎn)移進(jìn)行抑制，保證在細(xì)胞內(nèi)豬流感病毒不會持續(xù)增殖。 由此方式，可運用SLC35A1 敲除的方式，證實了其對豬流感病毒復(fù)制產(chǎn)生的抑制作用。 即使未進(jìn)行蛋白水平的檢測，也可在72 h內(nèi)掌握細(xì)胞存活階段SLC35A1 敲除細(xì)胞系的狀態(tài)。 據(jù)此，利用吸附實驗的方式，實現(xiàn)對HA 蛋白的驗證，運用有活性的豬流感病毒試驗方式，了解到豬細(xì)胞增殖后，其中的病毒會產(chǎn)生濃縮，只有運用高劑量的SLC35A1 才可控制細(xì)胞的密度，抑制其中的F26、PR8 以及H9N2 毒株的增殖。

3 結(jié)論

綜上所述，經(jīng)過上述實驗檢驗的方式，可得出豬流感具有較強(qiáng)的傳染性，并且豬是流感病毒的一種混合器，一旦豬感染了豬流感則會產(chǎn)生新型的病毒，增強(qiáng)人感染流感的可能性。所以，為避免豬流感帶來經(jīng)濟(jì)損失或是對人們的身體健康造成影響，應(yīng)加強(qiáng)對豬流感病毒的控制，做好預(yù)防計劃，保證流感病毒在整個細(xì)胞周期內(nèi)都能得到控制，這樣在網(wǎng)格蛋白接入環(huán)節(jié)，相關(guān)治理人員則可根據(jù)流感病毒進(jìn)入細(xì)胞的狀態(tài)，避免宿主因子與流感病毒進(jìn)行重疊，從而運用通過替代篩選的方式降低宿主因子的實際表達(dá)水平，保證豬的健康成長，推動生豬養(yǎng)殖水平的不斷提升。