牛小軍 黃海濤 李紅莉 敖存

摘要：為探究“倒春寒”和模擬凍害條件下茶樹鮮葉中酶活性與營養(yǎng)成分的變化，以“倒春寒”發(fā)生時茶樹實際受凍害和模擬凍害的新梢為研究材料，比較了不同冷凍脅迫時間下茶樹鮮葉中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）和β-葡萄糖苷酶（β-GC）酶活性及營養(yǎng)成分變化的差異。結果表明，在－3～－5 ℃冷凍4～6 h的條件下，模擬凍害的鮮葉外形最接近實際受凍情況。隨著冷凍時間的增加，鮮葉中PPO酶活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，POD酶活性整體趨于穩(wěn)定，而β-GC酶的活性整體呈現(xiàn)降低趨勢。此外，在冷凍過程中鮮葉茶黃素含量顯著增加，酯型兒茶素含量顯著降低。這些研究可為茶樹遭受凍害時鮮葉質量評估與再利用，以及茶樹響應“倒春寒”機制研究提供一定理論依據。

關鍵詞：茶樹；倒春寒；凍害；鮮葉品質；酶活性

中圖分類號：S571.1；Q946.5? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ?文章編號：1000－3150（2023）09-37-6

Effects of Different Freezing Stress Times on the Enzymatic

Activities and Nutritional Compositions in New Tea Shoots

NIU Xiaojun， HUANG Haitao， LI Hongli， AO Cun*

Hangzhou Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310024， China

Abstract： To investigate the changes in enzyme activities and nutritional components in fresh tea leaves during the occurrence of "late spring cold" and under simulated freezing injury conditions， new shoots of freezing injury and simulated freezing injury were used in this study as materials. The activities of PPO， POD， β-GC and nutritional compositions of new shoots were compared under different freezing conditions. The results show that under the condition of freezing at -3 ℃ to -5 ℃ for 4-6 hours， the phenotypes of simulated frozen fresh leaves were closest to the actual freezing situation. As the freezing time increases， the activity of PPO increased firstly and then decreased， while the activity of β-GC shows a decreasing trend， and the activity of POD enzyme tends to stabilize. In addition， the content of theaflavins shows a significant increase， while the content of ester catechins significantly decreased. This study provided theoretical guidance for the quality evaluation of fresh leaves when tea trees suffer from? freezing injury and laid a foundation of the mechanism of tea trees responding to "late spring cold".

Keywords： tea plant， late spring cold， freezing injury， quality of the fresh leaf， enzymatic activity

初春茶樹新梢萌動后如遭受“倒春寒”天氣，會造成茶樹幼嫩新梢受凍褐變，甚至焦枯壞死[1]。從而導致茶葉品質下降，產量銳減，嚴重時甚至絕收，給茶葉生產造成巨大的經濟損失。當前浙江省茶樹主栽品種中，早生與特早生品種占較大比例，然而這些品種抗寒性相對較差，極易遭受“倒春寒”危害。目前“倒春寒”已成為對茶葉生產影響最大的氣象災害之一[2]。

生產上針對“倒春寒”引起的低溫凍害已逐級形成了較為完善的技術措施，如稻草覆蓋、煙熏驅霜、深耕施肥、加裝防霜風扇、剪除受凍枝條等 [3]。近些年，關于調控茶樹新梢響應低溫的分子機理研究也取得了很多新進展[4-5]。然而，關于茶樹新梢在遭受“倒春寒”后鮮葉的生理變化及質量評價還鮮有報道。本研究以“倒春寒”發(fā)生時茶樹鮮葉實際受凍害和未受凍害的新梢為研究材料，比較不同冷凍時間脅迫下茶樹鮮葉中過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和β-葡萄糖苷酶（β-GC）的酶活性及營養(yǎng)成分變化的差異，以期為茶樹遭受凍害時鮮葉質量評估及響應“倒春寒”機制研究提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為茶樹無性系品種龍井43，實際受凍茶鮮葉嫩度以一芽一葉為主，于2021年3月25日采自杭州市農業(yè)科學研究院茶葉研究所瓶窯基地。模擬凍害試驗原料嫩度為一芽一葉至一芽二葉，于2021年3月30日采自杭州市農業(yè)科學研究院茶葉研究所大清谷基地，鮮葉進廠后，均勻扦取每份600 g，以3 cm厚度鋪于冰柜中，－3 ～ －5 ℃（模擬實際受凍溫度）分別冷凍2、4、6、8、10 h。

1.2? 試劑耗材與儀器

1.2.1? 試劑耗材

谷氨酸、茚三酮、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉、沒食子酸、碳酸鈉、福林酚（分析純）、冰乙酸、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙腈（色譜純）、咖啡堿、兒茶素標樣（Sigma-Aldrich）、蒸餾水、β-葡萄糖苷酶試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、多酚氧化酶試劑盒和過氧化物酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）等。

1.2.2? 設備與儀器

萬分之一天平（Sartorius BSA224S）、DK-S28電熱恒溫水浴鍋（上海精宏）、DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱、－80 ℃超低溫冰箱（海爾 DW-86L626）、冷凍離心機（Centrifuge Velocity 18R Pro）、色差儀（Hunter Lab Color Quest XE）、液相色譜儀（Waters 2695-2998）、TU-1901分光光度計（北京普析）等。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 凍害發(fā)生時環(huán)境溫度測定

溫度計位于離地面1 m高接近茶樹蓬面的位置，采用溫度自動記錄儀記錄每小時溫度變化。

1.3.2? 鮮葉固樣

采用五點取樣法扦取茶青100 g放入液氮中迅速冷凍10 min，然后于－80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，用于酶活性測定。

1.3.3? 生化樣制作

生化樣制作參照曾貞等[6]的微波固樣法并做適當調整，取不同冷凍條件下的茶青500 g，1～2 cm平鋪于微波爐中，高火微波殺青2 min，取出冷卻散失水汽后，中火微波1 min，最后60 ℃烘至足干（45～60 min），用于理化分析和色差分析。

1.3.4? 凍害分級及凍害指數測定

茶樹新梢受凍程度分級標準參照童啟慶[7]凍害分級標準略有修改。以新梢的芽頭和第一葉的受凍面積比例為判斷標準，定義受凍面積＜5%為0級，5%～32%為1級，33%～65%為2級，≥66%為3級。取茶青20 g，目測各個新梢進行分級，稱量各級樣品的質量。根據質量計算出各級受凍鮮葉比例，并計算出凍害指數（凍害指數=∑凍害等級×該等級所占比例），重復3次。

1.3.5? 酶活性測定

PPO：取茶樣1.0 g放入加有少許石英砂的研缽，加入5 mL提取液，進行冰浴勻漿；然后在8 000 r/min轉速下離心10 min。取上清液150 μL，在37 ℃ 恒溫水浴保溫 10 min，取出后立即轉入90 ℃以上沸水浴加熱5 min，取出后流水冷卻，在10 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液于波長420 mm處，用1 cm光徑比色皿，蒸餾水調零后測定各管吸光度（ΔA=A測定－A對照）。具體參照PPO測試盒說明書（南京建成生物工程研究所）。

POD：取茶樣1.0 g放入加有少許石英砂的研缽，加入9 mL預冷的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.0～7.4）后，冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿，在3 500 r/min離心10 min。取上述上清液0.1 mL按照試劑盒中的配方混勻后，3 500 r/min離心10 min。取上清液于420 nm處，用1 cm光徑比色皿，蒸餾水調零后測定各管吸光度OD 值。具體參照POD測試盒說明書（南京建成生物工程研究所）。

β-GC：取茶樣1.0 g放入加有少許石英砂的研缽，加入5 mL預冷提取液，冰浴勻漿，然后在15 000 r/min轉速下離心20 min。取上述上清液0.1 mL按照試劑盒中的配方混勻后，在37 ℃水浴中保溫30 min后，立即在沸水浴中煮沸5 min，流水冷卻后充分混勻。室溫靜置2 min后，于400 nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定－A對照。具體參照β-GC檢測試劑盒說明書（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3.6? 理化成分檢測

水分含量參照《 食品安全國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）、游離氨基酸總量參照《茶 游離氨基酸總量的測定》（GB/T 8314—2013）、茶多酚含量參照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）、水浸出物含量參照《茶 水浸出物測定》（GB/T 8305—2013）測定。兒茶素組成和咖啡堿測定采用液相色譜法，具體方法參照文獻[8]。茶色素測定采用系統(tǒng)分析法，具體參照文獻[9]。

1.3.7? 色差值測定

稱取3.0 g茶樣置于審評杯中，注滿沸水，5 min后用濾紙濾出茶湯至250 mL錐形瓶中。用總透射法測定茶湯色差，以純凈水作為對照，用厚度為1 cm的比色皿測定茶湯明暗度（L）、紅綠色度（a）、黃藍色度（b）。由 L、a、b值計算顏色的系列衍生指標，以? ?a2+b2? 為色調彩度（Cab），以 Cab/L 為色彩飽和度（Sab），以b/a 為色相 [10]。重復3次。

1.4? 數據統(tǒng)計分析

利用Excle 2019及SAS 9.4統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，使用Duncan法進行多組樣本間差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 茶園凍害發(fā)生時環(huán)境溫度及模擬凍害下鮮葉變化

2016年和2020年兩次倒春寒發(fā)生時對受凍茶園實際溫度進行了監(jiān)測記錄，結果表明，凍害發(fā)生時，茶園蓬面高度的氣溫在夜晚20：00下降至0 ℃以下，至清晨6：00時降至最低，分別達到－4.2 ℃和－6.8 ℃，然后隨著日出，氣溫逐漸回升至0 ℃以上（圖1）。因此，模擬受凍試驗將溫度設定為－3～－5 ℃開展，鮮葉受凍程度分為4個等級，如圖2。隨著冷凍時間的增加，葉色由鮮綠逐漸變紅，且紅變比例逐級上升。試驗結果顯示隨著冷凍時間的增加，凍害0級的比例逐漸下降，凍害3級的比例逐漸上升，凍害1級和2級的比例趨于穩(wěn)定。凍害指數隨著冷凍時間的延長，表現(xiàn)為逐漸增大。與模擬凍害相比，實際鮮葉受凍指數位于冷凍4～6 h之間，且實際受凍鮮葉中，凍害0級和1級占比最多，2級和3級占比較少。

2.2? 酶活性的變化

不同冷凍條件下鮮葉中PPO、POD及β-GC酶活性的變化如圖3。隨著冷凍時間的延長，冷凍鮮葉POD活性整體趨于穩(wěn)定；PPO活性先升高后降低，實際受凍鮮葉PPO活性最低；而β-GC的活性整體呈現(xiàn)降低趨勢，實際受凍鮮葉該酶活性亦是最低。

2.3 茶色素含量的變化

分析不同冷凍條件下鮮葉的茶色素成分含量（圖4）發(fā)現(xiàn)，鮮葉在冷凍后茶色素含量整體呈現(xiàn)增加的趨勢。其中，隨著冷凍時間的延長，鮮葉中茶褐素和茶紅素含量增加趨勢較緩，且在冷凍8 h后均基本不再增加（圖4-A）；鮮葉中茶黃素含量逐漸增加，且不同處理時間的鮮葉中茶黃素含量均有顯著差異（圖4-B）。實際受凍鮮葉中茶色素含量均低于冷凍脅迫鮮葉中的含量。

2.4? 理化成分分析

鮮葉冷凍處理后，其理化成分如表1。與未冷凍處理（冷凍0 h）的鮮葉相比，冷凍處理后鮮葉中氨基酸含量無顯著變化；實凍鮮葉中氨基酸含量顯著高于不同冷凍處理鮮葉；冷凍后茶多酚、水浸出物及咖啡堿含量整體呈現(xiàn)下降趨勢，并以實凍鮮葉含量最低。此外，冷凍處理后鮮葉中兒茶素總量與未冷凍鮮葉相比呈顯著下降，且隨著冷凍時間的延長，呈逐漸下降趨勢。從兒茶素組分含量上看（表2），經冷凍處理后鮮葉中兒茶素各組分含量均明顯下降，且隨著冷凍時間的延長，不同類型的兒茶素含量大部分呈逐漸下降趨勢。在冷凍2 h后，沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）和表兒茶素（EC）含量分別下降5.8%、5.0%、6.8%、4.8%，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）則分別下降10.2%、15.4%、8.6%、14.3%?？梢娎鋬鎏幚韺︴バ蛢翰杷兀‥GCG、GCG、ECG、CG）的影響明顯大于對非酯型兒茶素（GC、EGC、C、EC）的影響。

2.5? 茶湯色差分析

不同冷凍處理鮮葉所制的茶樣沖泡后茶湯色差測定結果見表3。鮮葉冷凍后制得茶樣的湯色隨著冷凍時間的延長，L值逐漸降低，表示亮度逐漸降低；a在負值表示綠色程度，b在正值表示黃色程度，由表3可見，隨著冷凍時間的延長，茶湯綠色度和黃色度逐漸增加，導致湯色表現(xiàn)為黃綠，且不同冷凍處理之間存在顯著差異。實際受凍鮮葉所制茶樣的湯色從肉眼觀察和色差數值上看均比較接近模擬冷凍4 h左右鮮葉所制茶樣的湯色。

3? 小結與討論

低溫霜凍是影響春季茶芽生長的最重要環(huán)境因子，本研究以“倒春寒”發(fā)生時茶樹鮮葉實際受凍害和模擬凍害的新梢為材料，研究發(fā)現(xiàn)在－3～－5 ℃冷凍4～6 h的條件下，模擬凍害鮮葉外形最接近實際受凍情況；同時比較了不同冷凍脅迫時間下茶樹鮮葉中酶活性、茶色素及理化成分變化的差異，為茶樹遭受凍害時鮮葉質量評估與再利用，以及響應“倒春寒”機制研究提供理論依據。

鮮葉凍傷后葉片細胞的原生質膜及部分細胞器遭受損傷，細胞膜透性增加。解凍過程中葉片細胞內的部分物質不受限制地從胞內流到胞外，引起一些多酚類物質被氧化，產生一定發(fā)酵作用導致部分鮮葉紅莖紅葉，甚至焦枯[11]。王舒婷等[12]采用冷凍干燥和真空干燥工藝對凍害鮮葉加工工藝進行優(yōu)化，所制綠茶色澤翠綠，香氣、滋味及湯色都得到極大改善，表明凍傷的鮮葉經過合理的加工也可以適制綠茶。張麗霞等[13]依據霜凍芽葉色澤的類型和勻度分別進行分類后，采用不同的加工工藝將凍害鮮葉加工成白茶或紅茶，一定程度避免了“倒春寒”造成的茶園經濟損失。

本研究中，鮮葉凍傷后其兒茶素含量急劇減少，茶色素含量增加，但氨基酸、咖啡堿等變化較小。從外形上看，紅變后的鮮葉顯然已不適合制作高檔綠茶，但還沒有完全枯焦的茶芽可搶采后加工制成低檔綠茶或新式茶飲的原料茶。此外，鮮葉凍傷后茶黃素含量顯著提升，茶黃素是紅茶重要的品質成分之一，與紅茶的湯色、滋味高度正相關 [14-15]。侯炳豪等[16]研究發(fā)現(xiàn)經過冷凍處理的萎凋葉后期在制作工夫紅茶中可以顯著提高紅茶中茶黃素含量，并改善茶葉品質。黃建琴等[17]研究認為鮮葉冷凍萎凋過程中茶黃素的含量相比自然萎凋顯著增加，且能改善紅茶的湯色和滋味品質。本研究中隨著冷凍時間的延長，鮮葉中茶黃素的含量亦呈現(xiàn)顯著增加，可能是由于鮮葉冷凍后細胞膜透性增加，解凍后細胞中兒茶素等多酚類化合物與多酚氧化酶迅速接觸，進一步催化為茶黃素。凍害后的鮮葉本質上是進行了低溫冷凍萎凋，因此可通過合理的工藝技術將其加工為優(yōu)質紅茶，從而減輕因“倒春寒”帶來的損失。

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