呂朝軍 趙建超 鐘寶珠 張楚毓 陳拓 李文蓮

關(guān)鍵詞：嗜菌異小桿線蟲；致病力；紅棕象甲；形態(tài)學(xué)

紅棕象甲（RhynchophorusferrugineusOliver）是我國重要的檢疫性害蟲，分布于海南、廣東、廣西、重慶、臺(tái)灣、云南、西藏、香港、澳門、江西、上海、四川、貴州、浙江、福建等地[1-2]，也是世界上椰子（CocosnuciferaL.）、油棕（ElaeisguineensisJacq.）、椰棗（PhoenixdactyliferaL.）等棕櫚科作物的重大害蟲。該蟲主要通過鉆蛀植物的莖干和生長點(diǎn)危害，由于其為害隱蔽，在植株表現(xiàn)癥狀時(shí)多數(shù)已無法挽救。

目前生產(chǎn)上對于紅棕象甲的防治方法包括莖干注射[2]、藥劑噴霧[3]、信息素誘捕[4]等。在該蟲生物防治方面已取得了一些成就[5-7]，其中昆蟲病原線蟲（entomopathogenicnematodes，EPNs）作為重要的生防因子之一[7]，可與其他生物形成共生關(guān)系[8]，截至2015年底，已報(bào)道95種斯氏線蟲和16種異小桿線蟲[9]。BARBARA等[10]研究了斯氏線蟲（Steinernemacarpocapsae）對紅棕象甲的致死效果，及其對紅棕象甲生長發(fā)育及幼蟲的免疫活性等影響，當(dāng)EPNs通過肛門、氣孔和口腔進(jìn)入宿主后，會(huì)在宿主血腔中釋放共生細(xì)菌引起細(xì)胞毒性，并引起敗血癥導(dǎo)致宿主死亡[11]；田間試驗(yàn)結(jié)果表明，EPNs對紅棕象甲的預(yù)防效果達(dá)98%，治愈率達(dá)80%[12]。同時(shí)嗜菌異小桿線蟲（Heterorhabditisbacteriophora）和昆蟲病毒以1∶5混合對紅棕象甲的防治效果較好[13]；嗜菌異小桿線蟲與白僵菌（Beauveriabassiana）混用對于紅棕象甲幼蟲具有增效作用，尤其對低齡幼蟲的增效作用更顯著[14]。目前針對EPNs侵染紅棕象甲的研究多集中在幼蟲，而較少報(bào)道對其他蟲態(tài)是否有致病性的研究，因此本文研究了嗜菌異小桿線蟲H06（HeterorhabditisbacteriophoraH06）品系對紅棕象甲各蟲態(tài)的致病力，并對其侵染途徑及侵染過程等進(jìn)行系統(tǒng)觀察，以期為紅棕象甲生物防治策略的科學(xué)制定提供參考。

1材料與方法

1.1材料

紅棕象甲和嗜菌異小桿線蟲H06品系均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所生物防治實(shí)驗(yàn)室自繁自養(yǎng)。其中紅棕象甲采用半人工飼料[15]飼養(yǎng)；嗜菌異小桿線蟲H06品系以大蠟螟幼蟲為寄主進(jìn)行擴(kuò)繁，采用Whitetrap法[16]收集3齡侵染期線蟲（infectivejuveniles，IJs），用蒸餾水稀釋成系列濃度，備用。

試蟲繁育及實(shí)驗(yàn)均在溫度（26±1）℃，相對濕度70%±5%的昆蟲繁育室開展。

1.2方法

1.2.1嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲的致病力測定養(yǎng)蟲杯（直徑4cm，高3cm）杯底覆蓋濾紙，杯頂置通氣孔，用移液槍滴加1mL不同濃度線蟲液至濾紙上，將紅棕象甲5個(gè)齡期段（1～2齡、3～4齡、5～6齡、7～8齡、9～10齡）幼蟲、卵、蛹、成蟲分別置于養(yǎng)蟲杯中。處理5d后統(tǒng)計(jì)試蟲死亡率，并以對照組死亡率對處理死亡率進(jìn)行校正。每處理30頭，重復(fù)3次，以蒸餾水處理為對照。幼蟲、蛹、成蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)：以昆蟲針輕觸蟲體，完全不動(dòng)者為死亡。卵死亡標(biāo)準(zhǔn)：以變紅色或黑色為死亡。

死亡率=死亡蟲口數(shù)/處理總蟲口數(shù)×100%

校正死亡率=（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100%

1.2.2紅棕象甲不同蟲態(tài)被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后的形態(tài)學(xué)變化使用線蟲液（500IJs/mL）分別對紅棕象甲6齡幼蟲、預(yù)蛹、初產(chǎn)1d卵、新羽化成蟲進(jìn)行處理。其中幼蟲和預(yù)蛹滴加200μL于前胸背板處，成蟲滴加200μL于前胸背板和中胸之間連接處，卵直接在線蟲液中浸漬5s取出，處理后將試蟲單獨(dú)放置于養(yǎng)蟲盒中，成蟲和幼蟲以甘蔗塊為補(bǔ)充營養(yǎng)。處理72h后用索尼攝像機(jī)（FDR-AX700）拍照記錄紅棕象甲各蟲態(tài)被EPNs侵染后的典型形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3嗜菌異小桿線蟲H06品系從紅棕象甲幼蟲不同部位的侵入效果選取紅棕象甲3齡、6齡、8齡幼蟲，以每克蟲體重接種100IJs劑量嗜菌異小桿線蟲H06品系，分別接種于紅棕象甲口器、氣孔和肛門周圍，處理4d后統(tǒng)計(jì)死亡蟲數(shù)。死亡標(biāo)準(zhǔn)為用昆蟲針輕觸蟲體，完全不動(dòng)者為死亡。每處理接種30頭，重復(fù)3次，以未接種處理為對照。

1.2.4嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲腹側(cè)氣孔的侵入行為觀測以紅棕象甲8齡幼蟲為寄主，接種24h后觀察蟲體氣孔周圍嗜菌異小桿線蟲H06品系的分布情況。為便于觀察，用防水藍(lán)色記號(hào)筆在紅棕象甲幼蟲氣孔處進(jìn)行輕微涂抹，利用解剖鏡（鳳凰XTL-165-LD500u）持續(xù)觀察線蟲從紅棕象甲氣孔侵入蟲體的過程并記錄。

1.3數(shù)據(jù)處理

致病力測定結(jié)果中，根據(jù)黃劍等[17]的方法，采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件求毒力回歸方程及LC50、LC50的95%置信區(qū)間等。嗜菌異小桿線蟲H06品系致病力數(shù)據(jù)采用試蟲的校正死亡率進(jìn)行分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT法）進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態(tài)的致病力

紅棕象甲各蟲態(tài)均可被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染（表1）。從毒力測定結(jié)果可知，嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲卵和1～2齡幼蟲的毒力水平最高，二者無顯著差異。隨著幼蟲齡期增加，紅棕象甲對嗜菌異小桿線蟲H06品系的敏感性逐漸降低，其LC50值逐漸增大；嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲蛹和成蟲的致病力無差異，但均低于卵和1～6齡幼蟲。此外，5～6齡幼蟲與7～8齡幼蟲之間、7～10齡幼蟲與蛹之間、9～10齡幼蟲與成蟲之間對嗜菌異小桿線蟲H06品系的敏感性均無顯著差異。

2.2紅棕象甲不同蟲態(tài)被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后的形態(tài)學(xué)變化

經(jīng)嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后，紅棕象甲幼蟲、預(yù)蛹、蛹和卵均死亡，輕觸蟲體無自主反應(yīng)，體色變成紅色或紅褐色，同時(shí)伴隨蟲體體壁皺縮僵硬。成蟲經(jīng)嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后體色加深，體表斑紋逐漸消失（圖1）。

2.3嗜菌異小桿線蟲H06品系對不同齡期紅棕象甲幼蟲不同部位的侵入效果

紅棕象甲幼蟲不同部位被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后，紅棕象甲死亡率如表2所示。紅棕象甲3齡幼蟲的接種處理中，以氣孔和肛門處接種的致死率較高，且二者無顯著差異，分別為91.11%和78.89%，均顯著高于口器接種處理；而在6齡幼蟲和8齡幼蟲的接種處理中均以口器接種致死率最高，分別為95.56%和98.89%，其次為肛門接種和氣孔接種。

口器接種處理中，6齡和8齡紅棕象甲幼蟲死亡率無顯著差異，但均顯著高于3齡幼蟲死亡率；在氣孔接種處理中，3齡幼蟲的死亡率顯著高于6齡和8齡幼蟲；而在尾部肛門接種處理中，供試3個(gè)齡期的紅棕象甲幼蟲死亡率無顯著差異。

2.4嗜菌異小桿線蟲H06品系從紅棕象甲幼蟲氣孔侵入的行為觀測

研究結(jié)果表明，嗜菌異小桿線蟲H06品系接近紅棕象甲氣孔后，在氣孔周圍停留一段時(shí)間，之后從氣孔進(jìn)入蟲體（圖2），從開始進(jìn)入氣孔至完全進(jìn)入蟲體整個(gè)過程持續(xù)2～5min；部分線蟲在進(jìn)入氣孔的過程中會(huì)退出，亦有部分線蟲直接從氣孔上爬過而不侵入蟲體，接觸到紅棕象甲蟲體氣孔的線蟲且成功進(jìn)入蟲體的比例為33.33%。

3討論

EPNs作為一種生防因子，已經(jīng)在部分害蟲的防治上得到了應(yīng)用。如小卷蛾斯氏線蟲（Steinernemacarpocapsae）All品系與草地貪夜蛾數(shù)量比為劑，可長期較好地抑制小地老虎對煙草幼苗的危害[19]；600IJs/mL線蟲液處理24h后，Wn01線蟲對紅脈穗螟的校正死亡率達(dá)到86.67%[20]。SHAHINA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，供試的7種EPNs對紅棕象甲各蟲態(tài)均具有較好的致病效果；在阿聯(lián)酋椰棗園紅棕象甲的防控實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一種本土分離的Heterorhabditisindicus線蟲能在短時(shí)間內(nèi)滅殺紅棕象甲幼蟲、成蟲和蛹[22]。由于EPNs對昆蟲宿主的高致病性[23]，小卷蛾斯氏線蟲（SteinernemacarpocapsaeWeiser）和嗜菌異小桿線蟲（H.bacteriophoraPoinar）[24]已制作成生防制劑并用于有害生物綜合治理（IPM）中。前期研究顯示，嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲具有一定的致死作用，且蟲體呈現(xiàn)出僵硬皺縮、體色變褐、身體腫脹直至蟲體腐爛、線蟲游離而出的現(xiàn)象[7]。本研究進(jìn)一步證明，嗜菌異小桿線蟲H06品系不僅可侵染紅棕象甲幼蟲，同時(shí)對紅棕象甲蛹、成蟲、卵等也具有侵染活性。其中對紅棕象甲卵和1～2齡幼蟲的毒力水平最高，這可能與不同蟲態(tài)對EPNs的耐受力差異有關(guān)，也說明在紅棕象甲卵期和低齡幼蟲期利用嗜菌異小桿線蟲H06品系進(jìn)行可取得較好的防效。

EPNs侵染寄主的方式分為3種：潛伏型、攻擊型和中間型[25]。其中斯氏線蟲的垂直擴(kuò)散能力較強(qiáng)，搜索策略為潛伏型，而異小桿線蟲對寄主的感應(yīng)強(qiáng)烈且主動(dòng)搜索力較強(qiáng)，適于侵染隱蔽性害蟲[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜菌異小桿線蟲H06品系在有水為介質(zhì)的情況下會(huì)游離至紅棕象甲幼蟲氣孔附近，并通過氣孔進(jìn)入蟲體，但觀察發(fā)現(xiàn)其進(jìn)入蟲體氣孔無目的性，即并不是所有抵達(dá)氣孔的線蟲均會(huì)侵入至蟲體，因此嗜菌異小桿線蟲H06品系從紅棕象甲氣孔侵入蟲體，是由氣孔散發(fā)的氣味吸引其向氣孔定向移動(dòng)？還是偶然經(jīng)過氣孔附近進(jìn)而侵入？還需進(jìn)一步深入研究。

EPNs侵入蟲體后會(huì)釋放共生細(xì)菌，通過細(xì)菌毒素和線蟲消耗寄主營養(yǎng)致寄主死亡[28]，蟲尸棕色表示該蟲是由斯氏線蟲侵染所致，而紅色則為異小桿線蟲侵染所致，顏色差異是由于尸體中共生細(xì)菌釋放的色素不同[10]，本研究結(jié)果也表明，經(jīng)嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后，紅棕象甲的卵、幼蟲、預(yù)蛹、蛹及成蟲等各蟲態(tài)體色均變成紅色或紅褐色，此結(jié)果與王國漢等[28]發(fā)現(xiàn)的異小桿線蟲侵染蟲體后導(dǎo)致寄主尸體初為桔紅色、后期為紅褐色一致。

EPNs從紅棕象甲幼蟲不同部位接種后，死亡率存在顯著差異，其中3齡幼蟲處理中，以氣孔和肛門處接種的致死率較高，而6齡和8齡幼蟲處理均以口器接種致死率最高。在氣孔接種處理中，3齡幼蟲的死亡率較高；而在尾部肛門接種處理中，供試3個(gè)齡期的紅棕象甲幼蟲死亡率無顯著差異，究其原因可能與紅棕象甲幼蟲的氣孔、口器及肛門的發(fā)育特征有關(guān)，其致病機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。