陳 茜,黃雪利,武 超,趙微微,秦俊杰,侯曉礁

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210095;2.北京生泰爾科技股份有限公司,北京 102600;3.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心,北京 102600)

奶牛乳房炎是奶牛常見的乳房疾病之一,臨床發(fā)病原因復(fù)雜,是牛體狀況、奶牛所處的飼養(yǎng)環(huán)境因素以及接觸的病原微生物共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。其中病原微生物感染,尤其是大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等病原微生物感染是引起奶牛乳房炎的主要病因[1]。隱性乳房炎為無臨床癥狀表現(xiàn)的一種乳房炎,其特征是乳房和乳汁無肉眼可見異常變化、然而乳汁在理化性質(zhì)、細(xì)菌學(xué)上一發(fā)生變化,故臨床上不易發(fā)現(xiàn),以致常常不被人們所重視[2]。隱性乳房炎常導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量、乳質(zhì)量下降,不僅降低經(jīng)濟(jì)價(jià)值,后續(xù)高昂的治療費(fèi)用也給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前臨床常用治療方法以抗生素治療為主[4],但由于長期濫用抗生素造成乳汁中藥物殘留和細(xì)菌耐藥性的問題,在很大程度上也讓獸醫(yī)不得不慎重使用抗生素[3]。由于中獸藥具有低毒、無殘留、療效確切等優(yōu)點(diǎn),且隨著中獸藥的發(fā)展也越來越受到臨床關(guān)注。用Mete分析法對中藥治療奶牛乳房炎臨床試驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià),結(jié)果顯示,復(fù)方中藥對奶牛乳房炎的療效顯著優(yōu)于青鏈霉素[5],還有文獻(xiàn)報(bào)道,用中獸藥可以使病原菌耐藥率下降[6]。銀黃可溶性粉是金銀花和黃芩提取物,具有清熱解毒、抗細(xì)菌等功效[7]。體外抑菌試驗(yàn)表明,銀黃可溶性粉對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、無乳鏈球菌的最小抑菌濃度分別為4.8×10-3、3.5×10-3、2.4×10-3g/mL,銀黃可溶性粉對奶牛乳房炎致病菌有明顯的抑菌作用,對奶牛乳房炎有很好的防治作用[8]。本試驗(yàn)以中獸藥銀黃可溶性粉為試驗(yàn)藥物對患有隱性乳房炎奶牛進(jìn)行臨床治療,通過不同劑量的銀黃可溶性粉治療效果觀察,來確定銀黃可溶性粉的最佳治療劑量,旨在開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、有效、安全的中獸藥制劑治療奶牛隱性乳房炎。

1 材料與方法

1.1 材料

患牛年齡3～6歲,胎次2～3胎,泌乳期相近,患牛只患有隱形乳房炎無其他疾病。不用有藥品過敏史的患牛、有典型的臨床型乳房炎癥狀的患牛、并發(fā)有其他疾病的患牛、試驗(yàn)期間繼發(fā)其他疾病的患牛、正在參加其他臨床試驗(yàn)的患牛、未按療程服藥、中途換藥或混用其他藥物的患牛。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、無乳鏈球菌由北京生泰爾科技股份有限公司診斷中心提供。

1.1.3 主要試劑 銀黃可溶性粉(每100 g本品相當(dāng)于原生藥75 g),愛迪森(北京)生物科技有限公司產(chǎn)品;萬乳康(500 g/袋,每500 g本品相當(dāng)于原生藥500 g),安徽佰斯特生物科技有限公司產(chǎn)品;LMT診斷液,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 主要儀器 丹麥福斯 MilkoScanTM Minor體細(xì)胞測定儀、上海雷磁電子pH計(jì)、電子秤等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 將50頭隱性乳房炎患牛,隨機(jī)分為5組,每組10頭。陽性藥物組,每頭牛灌服萬乳康130 g/d;銀黃可溶性粉試驗(yàn)組分別按每頭牛10、15、20 g/d的劑量灌服銀黃可溶性粉水溶液。給藥方法為:將上述劑量藥物以溫開水溶解成1 000 mL,連續(xù)給藥7 d,停藥后繼續(xù)觀察10 d?？瞻讓φ战M用同樣方法每頭牛灌服1 000 mL/d溫開水。給藥前記錄各組奶牛的基線資料,主要為入組奶牛的年齡、產(chǎn)奶量及胎次水平。

1.2.2 LMT檢測及判定 分別于試驗(yàn)第0天、第8天和第17天采集新鮮乳樣進(jìn)行LMT檢測。檢驗(yàn)方法參照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸醫(yī)研究所制定的奶牛隱性乳房炎現(xiàn)場診斷法進(jìn)行檢測診斷(表1)。

表1 奶牛隱性乳房炎判定標(biāo)準(zhǔn)(LMT)

1.2.3 乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù) 分別于試驗(yàn)第0天、第8天、第17天采集各試驗(yàn)組牛的4個(gè)乳區(qū)乳樣。各乳區(qū)在采樣前,棄去前2把奶,擠出乳樣,每個(gè)乳區(qū)各收集乳汁50 mL,放入有防腐劑的采樣管中,4℃保存運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室檢測各試驗(yàn)組奶樣中乳汁體細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4 乳汁pH 分別于試驗(yàn)第0天、第8天、第17天采集各試驗(yàn)組牛的4個(gè)乳區(qū)乳樣。各乳區(qū)在采樣前,棄去前2把奶,擠出乳樣,每個(gè)乳區(qū)各收集乳汁50 mL,放入采樣管中,立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行pH計(jì)檢測,以蒸餾水清洗pH計(jì)電極頭,將乳樣放置燒杯中,檢測前搖動燒杯使乳樣均勻,檢測時(shí)電極頭全部浸入乳樣,讀取數(shù)值。

利用CaO與CO2反應(yīng)吸附脫除CO2以及CaCO3分解為CaO與CO2的鈣循環(huán)過程，不僅普遍適用于煙氣脫碳（如燃燒后鈣基循環(huán)脫碳[3]），還可用于化學(xué)化工過程（如乙酸重整反應(yīng)吸附強(qiáng)化制氫[4-5]）。CaO不僅具有較高的CO2摩爾吸附容量（理論上為0.786 g CO2/gCaO），而且廣泛存在于天然石灰石中，其脫碳成本較低，具有極大的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢[6]。因此充分了解CaO基CO2吸附劑的吸附與釋放機(jī)理，對提高CO2吸附劑重復(fù)循環(huán)使用，降低鈣循環(huán)脫碳技術(shù)成本，具有重要的科研價(jià)值與實(shí)際意義[7]。

1.2.5 銀黃可溶性粉體外抑菌試驗(yàn)

1.2.5.1 供試菌液制備 金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌用普通肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng),無乳鏈球菌用馬丁肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng),將上述菌種接種后置于37℃恒溫箱中18～24 h進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),取出后生理鹽水稀釋100倍作為供試菌液,備用。

1.2.5.2 銀黃可溶性粉稀釋方法 取20 g銀黃可溶性粉溶解于75 mL滅菌的純化水中,制備成200 mg/mL生藥量的銀黃可溶性粉溶液,取8支滅菌試管,第1和第2支試管分別放入200 mg/mL生藥量的銀黃可溶性粉溶液,第2～第7支試管用滅菌生理鹽水將溶液分別進(jìn)行2倍稀釋,分別得到濃度相當(dāng)于含生藥量 200 、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 mg/mL銀黃可溶性粉溶液。

1.2.5.3 抑菌試驗(yàn) 取無菌48孔培養(yǎng)板(8×6),選取1橫排(8個(gè)孔)作為試驗(yàn)組,在試驗(yàn)組1～8孔中全部加入0.5 mL雙倍濃度的培養(yǎng)基,然后在第1孔中加入0.5 mL上述梯度濃度的銀黃可溶性粉溶液,混合均勻,各孔加入10 μL供試菌液,同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基陰性對照孔和培養(yǎng)基加菌的陽性對照孔,37℃恒溫培養(yǎng)16～18 h。觀察各試管有無細(xì)菌增長,當(dāng)陽性對照孔觀察到渾濁時(shí),觀察各試驗(yàn)組有無細(xì)菌增長(肉眼觀察變渾濁為有菌增長,記為“+”,反之則無,記為“-”),無肉眼可見細(xì)菌生長的最低銀黃可溶性粉溶液濃度,即為銀黃可溶性粉溶液對該菌種的最小抑菌濃度。每種菌株抑菌試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 分別在試驗(yàn)的第0天、第8天、第17天對所有試驗(yàn)?zāi)膛５拿總€(gè)乳區(qū)進(jìn)行LMT檢測,統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組奶?；疾∪閰^(qū)隱性乳房炎積分變化情況,按照文獻(xiàn)[10]評價(jià)藥物效果。

治愈乳區(qū):患病乳區(qū)(≥1分)LMT檢測積分減少至0分,乳汁的體細(xì)胞數(shù)降低到50萬/mL以下,pH降低到正常范圍(6.40～6.60);

有效乳區(qū):患病乳區(qū)LMT檢測積分值與用藥前相比減少,乳汁的體細(xì)胞數(shù)和pH均有所降低;

無效乳區(qū):患病乳區(qū)LMT檢測積分值與用藥前相比不變或增加,乳汁的體細(xì)胞數(shù)未降低甚至出現(xiàn)升高,pH未降低甚至出現(xiàn)升高;

乳區(qū)積分減少率=(給藥前總積分-給藥后總積分)/給藥前總積分×100%

治愈率=治愈乳區(qū)數(shù)/患病乳區(qū)數(shù)×100%

有效率=有效乳區(qū)數(shù)/患病乳區(qū)數(shù)×100%

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,計(jì)量資料的比較用單因素方差分析或t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料的比較用卡方檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 入組試驗(yàn)動物情況

選擇了50頭平均年齡4.29歲,平均胎次2.67,平均每頭產(chǎn)奶量為23.86 kg/d的中國荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)用牛。5組試驗(yàn)牛在年齡、產(chǎn)奶量以及胎次水平無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組試驗(yàn)?zāi)膛；€資料比較

2.2 LMT檢測結(jié)果

空白對照組在不治療情況下,有少數(shù)奶牛存在自愈情況,試驗(yàn)第8天和第17天,自愈率分別為3.13%和6.25%,但總體乳區(qū)積分上升,說明不使用藥物治療患病奶牛自愈率較低。試驗(yàn)第8天時(shí),銀黃可溶性粉高、中、低劑量組的有效率分別為84.38%、81.82%、64.52%;陽性藥物組的有效率略高于低劑量組66.67%,各用藥組與空白對照組相比差異均顯著(P<0.05)。試驗(yàn)第17天時(shí),有效率最高的是銀黃可溶性粉高劑量組為87.50%,中劑量組次之為84.85%;陽性藥物組有效率顯著低于銀黃可溶性粉高劑量組(P<0.05),為63.33%;各用藥組與空白對照組相比,差異均顯著(P<0.05)(表3)。

表3 各組奶牛乳區(qū)LMT檢測結(jié)果積分統(tǒng)計(jì)

在治愈率方面,試驗(yàn)第8天時(shí),銀黃可溶性粉高、中劑量組達(dá)到了75.00%和72.73%的治愈率,低劑量組和陽性藥物組的治愈率也達(dá)到了53.33%以上。試驗(yàn)第17天時(shí),銀黃可溶性粉中劑量組的治愈率最高為75.76%,其他各用藥組的治愈率也保持在54.84%以上。整個(gè)試驗(yàn)過程中,各用藥組的治愈率與空白對照組相比差異均顯著(P<0.05)。

試驗(yàn)第8天各藥物試驗(yàn)組的乳區(qū)LMT積分都有明顯下降,其中銀黃可溶性粉中劑量組下降程度最明顯,達(dá)到69.49%,銀黃可溶性粉高劑量組下降幅度也達(dá)到67.21%,均高于陽性藥物組50.88%的降幅;而空白對照組的乳區(qū)積分反而上升高了5.45%,在試驗(yàn)第17天,即停藥10 d后,空白對照組乳區(qū)積分升高了9.09%(表4);銀黃可溶性粉高劑量組乳區(qū)積分下降率最高,達(dá)到了68.85%;其次分別為陽性藥物組、銀黃可溶性粉中、低劑量組。

表4 不同時(shí)間段乳區(qū)積分減少率

2.3 乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)和pH

給藥前各試驗(yàn)組平均乳汁體細(xì)胞數(shù)均在100萬/mL以上,乳汁pH 6.89～7.14,兩個(gè)指標(biāo)各組之間差異均不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)第8天,各給藥組體細(xì)胞數(shù)、pH均有不同幅度下降,其中銀黃可溶性粉高、中劑量組效果最好,各用藥組與空白對照組相比差異均顯著(P<0.05);銀黃可溶性粉高、中劑量組與陽性藥物組相比差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)第17天,即停藥10 d后,銀黃可溶性粉高、中劑量組和陽性藥物組體細(xì)胞數(shù)、pH與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)(表5)。

表5 乳汁體細(xì)胞數(shù)(百萬/mL)和pH的檢測結(jié)果

2.4 銀黃可溶性粉對隱形乳房炎常見致病菌的影響

由表6可知,對無乳鏈球菌MIC為3.13 mg/mL生藥量,對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌MIC均為6.25 mg/mL生藥量。上述結(jié)果表明,銀黃可溶性粉對隱形乳房炎常見致病菌有較好的抑菌作用。

表6 銀黃可溶性粉對奶牛乳房炎常見致病菌的最低抑菌濃度(mg/mL生藥量)

3 討論

奶牛乳房炎是泌乳期奶牛最常見的疾病之一,據(jù)國際奶牛聯(lián)合會統(tǒng)計(jì),世界范圍內(nèi),臨床型乳房炎發(fā)病率20%,隱性乳房炎發(fā)病率高達(dá)50%,而在我國隱性乳房炎發(fā)病率更高。研究發(fā)現(xiàn),奶牛隱性乳房炎發(fā)病率與年齡、胎次也有一定關(guān)系,4胎前發(fā)病率隨胎次增加而降低,究其原因可能是胎次少奶牛的乳腺發(fā)育還未完全成熟;而4胎后隨胎次增加而增加,其原因可能是長期的產(chǎn)犢和泌乳,乳房接觸病原微生物幾率大大增加。同時(shí)由于長期泌乳擠奶,乳頭的形狀和機(jī)能都發(fā)生變化,對外源微生物的易感性增加,導(dǎo)致隱性乳房炎的發(fā)病率呈上升趨勢[11]。研究表明,隨著泌乳期的過渡奶牛隱性乳房炎的發(fā)病率有所增加,說明隱性乳房炎的發(fā)生與泌乳期關(guān)系密切。為減少各組間動物選擇的偏倚性,本試驗(yàn)中選擇3～6歲、2～3胎、泌乳期相近奶牛作為研究對象,本試驗(yàn)5組奶?；€資料比較結(jié)果表明試驗(yàn)牛在年齡、產(chǎn)奶量以及胎次水平無顯著差異,說明入組試驗(yàn)牛各組間基線具有可比性。

西獸醫(yī)認(rèn)為隱性乳房炎通常是由于多種致病的病原微生物通過污染乳房或者通過乳腺侵入乳房中造成發(fā)病[12]。乳房炎屬于中獸醫(yī)學(xué)中的奶腫、奶黃、乳癰等范疇,多因使役負(fù)重太過,奔走太急,或食精料過多,致使胃熱壅盛,氣血凝滯,又因乳房是胃熱壅盛,胃脈受阻,乳房經(jīng)氣阻塞,遂成乳癰。本試驗(yàn)中銀黃可溶性粉主要由金銀花、黃芪組成,具有清熱解毒、宣肺燥濕的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明,金銀花在解熱抗炎、抗菌、抗病毒、護(hù)肝利膽以及增強(qiáng)免疫力等方面均有較顯著功效[13]。金銀花提取液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌、黑曲霉等均表現(xiàn)出一定的抑制作用,起抑菌作用的主要成分為綠原酸、異綠原酸[14]。日糧中添加金銀花提取物1 g/kg或2 g/kg可顯著降低乳體細(xì)胞數(shù)[15]。金銀花-板藍(lán)根藥對中活性成分可能與炎癥密切相關(guān)的靶標(biāo)COX-2有關(guān),推測“金銀花-板藍(lán)根”藥對可能調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶標(biāo)COX-2在炎癥中發(fā)揮作用[16]。發(fā)酵黃芪可有效降低乳體細(xì)胞數(shù),提高奶牛產(chǎn)奶量,其原因可能是黃芪能夠提高奶牛的機(jī)體免疫力,從而使乳房炎感染率大大降低[17]。銀黃可溶性粉體外對金葡菌,凝固酶陰性葡萄球菌,大腸埃希氏菌,無乳鏈球菌等有較好的抑制作用,對奶牛乳房炎致病菌體外抑菌作用及具有臨床預(yù)防奶牛乳房炎的作用。綜上所述,從現(xiàn)代學(xué)藥理研究角度看,銀黃可溶性粉有一定的抗炎、抗菌、增強(qiáng)免疫力以及降低乳汁中體細(xì)胞數(shù)的作用。

本研究中,用藥后銀黃可溶性粉高、中劑量組的有效率和治愈率相當(dāng),均達(dá)到81%、72%以上,陽性藥物組和低劑量有效率和治愈率相當(dāng),均達(dá)到63%、53%以上,停藥后10天銀黃可溶性粉中劑量組的治愈率(75.76%)最大。在乳區(qū)LMT積分方面,各藥物試驗(yàn)組的乳區(qū)LMT積分都有明顯下降,其中銀黃可溶性粉中劑量組下降程度最明顯。而空白對照組的乳區(qū)積分反而升高了,表明奶牛隱性乳房炎在不用藥情況下自愈率低。在降低乳汁中體細(xì)胞數(shù)、pH方面,用藥后銀黃可溶性粉和萬乳康均有降低乳汁中體細(xì)胞數(shù)、pH的效果,用藥第8天銀黃可溶性粉高、中劑量組的作用效果更為顯著。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果提示,銀黃可溶性粉對奶牛隱形乳房炎有普遍抑菌作用。上述結(jié)果表明,銀黃可溶性粉和萬乳康對奶牛隱性乳房炎均有較好的治療效果,其中銀黃可溶性粉不僅起效速度更快,在合適的劑量范圍內(nèi),其整體作用效果明顯優(yōu)于萬乳康,此外,與萬乳康相比,臨床使用量少,成本更低,更適于推廣使用。銀黃可溶性粉主要藥材具有抗炎、抗菌、降低乳汁中體細(xì)胞的作用,這與奶牛隱性乳房炎的病因密切相關(guān),故可以在臨床上取得很好的治療效果。兼顧治療效果和節(jié)約成本,推薦銀黃可溶性粉的臨床使用劑量為每頭牛每天15 g,連續(xù)使用7 d。