張玲 趙穎 葉波 高浩杰 孫圳

(舟山市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 舟山 316000)

野生植物是自然生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，是維持生物多樣性的重要保障，是不可或缺的生物資源，一些野生植物的生存受到嚴(yán)重威脅，部分種類甚至滅絕由于人類的干擾活動不斷加劇和全球氣候變化。生物多樣性是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)。所以，保護野生植物及其賴以生存的自然環(huán)境是人類自身生存和發(fā)展的必要措施，亟需拯救瀕臨滅絕的物種。

蝦脊蘭(Calanthe discolor Lindl.)屬蘭科(Orchidaceae)蝦脊蘭屬(Calanthe)多年生地生植物，《野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約》把蘭科植物全科所有種類列入保護范圍，是世界性瀕危物種。在舟山主要分布在舟山島、桃花島、朱家尖島、普陀山等島嶼，生于闊葉林下或灌叢中。蝦脊蘭既是觀賞植物中的珍品，也有較高的醫(yī)藥用途，在開發(fā)利用上具有很高的價值。由于人為采挖和生境破壞，野生資源瀕臨枯竭，亟需加強擴繁保護。

目前，對受到威脅或已經(jīng)瀕危的中國野生植物，采取就地保護與遷地保護相結(jié)合的方法。野生植物保護區(qū)建設(shè)就是就地保護重點，野生植物在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)進行恢復(fù)和擴繁需要受威脅植物的保護盡量結(jié)合其生境。將植物的種質(zhì)資源保存在植物園就是遷地保護，建立種子庫、基因庫和相關(guān)研究機構(gòu)的實驗基地和實驗室中保存。就地保護和遷地保護都是野生植物保護的基本措施。

21世紀(jì)人類面臨的共同主題是維護生態(tài)安全，加強生態(tài)保護，促進生態(tài)文明。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，生態(tài)環(huán)境建設(shè)已經(jīng)越來越受到各級政府和有關(guān)部門的重視。加強野生植物物種保護，特別是珍稀植物的保護和利用，是維護生態(tài)平衡，保障生態(tài)安全，實現(xiàn)生態(tài)文明的重要舉措。適應(yīng)海島生境的蝦脊蘭不僅具有較高的園藝價值，而且在海島生態(tài)中占有重要的地位，對其而進行保護和利用具有重要的現(xiàn)實意義，而保護的基礎(chǔ)是種群數(shù)量，因此組培快繁是前提。

1 材料與方法

1.1 蝦脊蘭生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性

在舟山市朱家尖、桃花島等地根據(jù)蝦脊蘭分布點的實際地形地勢，采用樣方法對蝦脊蘭所在群落進行群落特性調(diào)查。選擇10m×10m的樣方，統(tǒng)計每個樣方內(nèi)蝦脊蘭的數(shù)量、群落郁閉度、伴生植物、小地形等情況，分析蝦脊蘭所在群落的物種組成與結(jié)構(gòu)等生態(tài)學(xué)特性。

1.2 試驗材料的采集

8—9月于舟山朱家尖和桃花島采集蝦脊蘭成熟未開裂的蒴果，用干凈真空袋裝好帶回實驗室放于3℃冰箱中冷藏備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒴果消毒

取成熟未開裂的蝦脊蘭蒴果洗凈并吸干水分，有斑點的蒴果用手術(shù)刀輕輕刮掉，用75%酒精棉球擦拭多次后在超凈工作臺上風(fēng)干表面水分，用無菌鑷子和無菌手術(shù)刀將小種子在1個自制的小容器里挑選處理，容器上開口，下小細網(wǎng)，見圖1，用鑷子夾住容器用蒸餾水沖洗3～5次，用75%酒精浸泡30s。

圖1 自制容器

種子酒精浸泡完成后用無菌水沖洗3～5次。把放有種子的容器放入1個無菌瓶中，并放入2%的次氯酸鈉浸泡10min。消毒殺菌完畢再用無菌水反復(fù)沖洗3～5次。把容器放入無菌瓶內(nèi)反復(fù)沖洗，無菌水瀝干凈備用。

1.3.2 種子誘導(dǎo)

前期試驗根據(jù)前人研究表明，蝦脊蘭種子誘導(dǎo)以4/5MS、1/2MS及MS培養(yǎng)基，分別加入200ml·L-1椰汁、不同激素(0.025～0.1mg·L-16-BA，0.1mg·L-1NAA)和0.1g·L-1AC組合，并附加瓊脂4.25g·L-1、蔗糖20g·L-1，pH值5.7，光照強度35μmL·m-2，光照時長12h，培養(yǎng)室溫度控制在25±2℃，觀察種子萌發(fā)情況。

萌發(fā)率(%)=誘導(dǎo)成功瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100

1.3.3 增殖與分化

將蝦脊蘭誘導(dǎo)原球莖接種在MS、1/2MS培養(yǎng)基上，分別加入100ml·L-1椰汁或者15g·L-1香蕉泥，添加不同激素配比(0.5～1mg·L-16-BA，0.25mg·L-1NAA)和0.25g·L-1AC組合，并附加瓊脂4.25g·L-1、蔗糖30g·L-1，pH值5.8，培養(yǎng)室溫度控制在25±2℃，光照強度40μmL·m-2，光照時長為12h，35d后統(tǒng)計結(jié)果。

增殖數(shù)=增殖的原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)

1.3.4 生根與壯苗

在蝦脊蘭培養(yǎng)瓶中選擇長勢良好且株高3cm以上蝦脊蘭進行生根試驗。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入100ml·L-1椰汁或者20g·L-1香蕉泥，添加不同激素(0.25mg·L-1NAA)和0.5g·L-1AC組合，并附加瓊脂4.25g·L-1、蔗糖30g·L-1，pH值5.8，培養(yǎng)室溫度控制在25±2℃，光照強度40μmL·m-2，光照時長為12h，在90d后觀察生根情況。

生根率(%)=(生根數(shù)/接種數(shù))×100

2 結(jié)果與分析

2.1 種子誘導(dǎo)

蝦脊蘭種子萌發(fā)以激素濃度適宜在加了椰汁的培養(yǎng)基中，萌發(fā)效果較好，時間短，具體見表1，即在培養(yǎng)基A4：4/5MS加200mL·L-1椰汁加0.025mg·L-16-BA加0.05mg·L-1NAA加0.1mg·L-1AC，培養(yǎng)約120d后種子開始從乳白色小點轉(zhuǎn)化為黃色，繼續(xù)培養(yǎng)約30d左右以后，蝦脊蘭原球莖逐漸發(fā)育成淡綠色，超過85%萌發(fā)率，原球莖長勢旺盛飽滿，見圖2。當(dāng)6-BA濃度為0.1mg·L-1且不加椰汁的誘導(dǎo)率小于10%，并且出現(xiàn)較高比例的褐化現(xiàn)象。

表1 不同激素和有機組合誘導(dǎo)蝦脊蘭種子結(jié)果

圖2 蝦脊蘭種子誘導(dǎo)

2.2 原球莖的增殖與分化

將蝦脊蘭原球莖轉(zhuǎn)接至不同激素和天然復(fù)合物的組合中，天然的香蕉或者椰汁對細胞和組織的增殖分化起到明顯的作用，見圖3。原球莖在B3培養(yǎng)基中增殖速度較快，30d后即可形成蝦脊蘭小苗，具體見表2。當(dāng)6-BA濃度較高時(1mg·L-1)，蝦脊蘭增殖系數(shù)較低，并出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

表2 不同培養(yǎng)基對蝦脊蘭原球莖增殖的影響

圖3 蝦脊蘭原球莖增殖

2.3 蝦脊蘭生根

蝦脊蘭分化后的小苗接種到生根培養(yǎng)基中14d左右，小苗開始生根。半透明狀接近白色的新根慢慢的顏色變深變成深綠色，后逐漸變長變粗，見圖4。在未添加任何激素的C1培養(yǎng)基上，蝦脊蘭也有很高的生根率；添加了NAA結(jié)合香蕉泥或椰汁的培養(yǎng)基中生根效果更好可達100%，且粗壯、較長、植株健壯，具體見表3。

表3 不同培養(yǎng)基對蝦脊蘭生根的影響

圖4 蝦脊蘭生根苗

2.4 煉苗和移栽

根據(jù)蝦脊蘭生物學(xué)特性和組培苗生長情況，當(dāng)組培苗長至8cm，具2～4片葉且根系完整時即可移栽，進行閉瓶和開瓶馴化約10d左右。移栽前先將組培瓶閉口放至于溫室中煉苗，讓瓶內(nèi)的苗逐漸適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境，慢慢打開組培瓶，之后將蝦脊蘭組培苗取出來，先用自然水洗干凈培養(yǎng)基凝膠，再用1000倍多菌靈水溶液浸苗8～15min，取出晾干后待種。進行盆栽試驗1180株，基質(zhì)選用等體積比的椰糠和河沙的混合基質(zhì)，澆足定根水。管護中保持21℃以上溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，在此期間不澆水，以利新根生長和防止病害發(fā)生，5周后移入室中栽培。栽種時要注意保濕和遮蔭，成活后可適當(dāng)追肥，移栽后需要柔光，注意植株保濕，成活率在90%以上。新葉和新根長出后可以按照常規(guī)蘭花進行種苗管理。

3 討論

根據(jù)王國明《舟山海島種子植物》，通過海島植物調(diào)查蝦脊蘭的生境，為蝦脊蘭組培試驗提供了基礎(chǔ)。培養(yǎng)基的成功優(yōu)選參考曾宋君等對銀帶蝦脊蘭進行種子離體培養(yǎng)。采用蝦脊蘭種子，原球莖，完整植株途徑的方法篩選出適宜的培養(yǎng)基，建立無菌播種快繁技術(shù)體系參考于羅遠華等以三褶蝦脊蘭種子為外植體。胚柄細胞與內(nèi)珠被緊密接觸為其提供營養(yǎng)物質(zhì)；而種子萌發(fā)困難的主要原因是內(nèi)種皮營養(yǎng)物質(zhì)和水分的運輸在一定程度上的阻隔，連靜靜等發(fā)現(xiàn)，無距蝦脊蘭幼胚的發(fā)育過程屬于石竹型提供了很好的借鑒。

蘭花種子的萌發(fā)率與其種類和成熟度均有緊密關(guān)系，蝦脊蘭的種子極小，在自然條件下萌發(fā)率不超過10%。通過蒴果培養(yǎng)可以有效提高蝦脊蘭的快速繁殖，1個蒴果內(nèi)含有種子多至數(shù)十萬粒。目前，蝦脊蘭常采用塊莖進行分株繁殖，但該種方法成活率較低。因此，運用種子無菌萌發(fā)與組培快繁技術(shù)對蝦脊蘭進行擴繁，同時通過蝦脊蘭遷地保護與回歸等方式進行保護，緩解蝦脊蘭生存狀況，以期為今后海島珍稀植物保護等研究工作提供經(jīng)驗與幫助。

目前，組培技術(shù)很廣泛地應(yīng)用在蘭科植物的生產(chǎn)和繁育上，如風(fēng)蘭、蝴蝶蘭、大花蕙蘭等蘭花品種的組培技術(shù)已經(jīng)非常成熟。蝦脊蘭采用成熟未破裂的種子為外植體進行組織培養(yǎng)，不僅能減少褐化，還易滅菌。6-BA和NAA的不同濃度組合對蘭科植物種子萌發(fā)具有顯著影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入椰汁和降低瓊脂的含量能有效提高種子的萌發(fā)、原球莖的增殖和分化、生根。因此，通過有機成分、激素、控制礦物質(zhì)元素等條件，能給植物提供所需的生長營養(yǎng)成分。

4 結(jié)論

根據(jù)各樣地調(diào)查，得知蝦脊蘭所在群落的物種組成與結(jié)構(gòu)等生態(tài)學(xué)特性。蝦脊蘭，是蘭科蝦脊蘭屬植物。地生植物，高30～40cm，莖不明顯。葉近基生，2～3枚，葉片狹倒卵狀長圓形，先端急尖或鈍而具短尖，基部楔形下延?；ㄝ銖漠?dāng)年新株的幼葉叢中長出，總狀花序長5～15cm，有花數(shù)朵至10余朵；花紫紅色開展；萼片近等長，中萼片卵狀橢圓形，側(cè)萼片狹卵狀橢圓形；花瓣萼片較小，倒卵狀匙形或倒卵狀披針形，唇瓣玫瑰色或白色，與萼片近等長，與蕊柱合生，3裂，側(cè)裂片斧狀，中裂片卵狀楔形，先端2裂，唇盤上具3條褶片；距圓筒形，細長，末端彎曲；蕊柱粗短。蒴果長圓柱形，下垂?；ㄆ谝话阍?—5月，果期8—10月。根狀莖不是很明顯，假鱗莖粗短，近圓錐形；耐半陰，較耐寒，不耐干旱，喜陽光充足溫暖濕潤的環(huán)境，喜疏松肥沃和排水良好的腐葉土或泥炭苔蘚土，常生于海拔780～1500m的常綠闊葉林下。生于山坡林下，灌叢中，其周邊具有代表性的喬木為紅楠、柘樹、普陀樟等；灌木為茶、朱砂根、天仙果等；草本植物為山蒟、絡(luò)石、江南星蕨等。了解了蝦脊蘭的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性給接下來對蝦脊蘭組培試驗打下了基礎(chǔ)。

本研究篩選得到蝦脊蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)基，根據(jù)不同激素配比和有機添加物的組合，在蝦脊蘭誘導(dǎo)階段，4/5MS加200mL·L-1椰汁加0.025mg·L-16-BA加0.05mg·L-1NAA加0.1mg·L-1AC加瓊脂4.25g·L-1加蔗糖20g·L-1，蝦脊蘭誘導(dǎo)率達到85%以上。在蝦脊蘭增殖分化階段，MS加100mL·L-1椰汁加0.5mg·L-16-BA加0.25mg·L-1NAA加0.25mg·L-1AC加瓊脂4.25g·L-1加蔗糖30g·L-1增殖最快。在蝦脊蘭生根階段，MS加100mL·L-1椰汁加0.25mg·L-1NAA加0.5mg·L-1AC加瓊脂4.25g·L-1加蔗糖30g·L-1培養(yǎng)基中生根效果更好，可達100%，且粗壯，較長，植株健壯。培養(yǎng)條件為pH5.8，溫度25±2℃，光照時長12h。從此試驗得出，在每個階段添加椰汁能有效提高蝦脊蘭的種子萌發(fā)，原球莖增殖分化和壯苗生根。根據(jù)蝦脊蘭原生地生境狀況，選擇生境相似的地點，模擬蝦脊蘭自然生長條件，運用遷地保護技術(shù)對蝦脊蘭進行保護，并結(jié)合就地保護、近地保護技術(shù)，選擇原生地或近生地，對蝦脊蘭進行回歸，調(diào)查與監(jiān)測各保護地蝦脊蘭植株的存活和生長狀況，制訂保護措施。