周雪琴,羅志華,黃從剛,康麗,黃喬春

膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤,占顱腦腫瘤的80%以上[1]。膠質(zhì)瘤的治療包括手術(shù)、放化療等,但治療后腫瘤易復(fù)發(fā)或形成耐藥性,患者預(yù)后不佳[2]。深入研究膠質(zhì)瘤發(fā)病機制,有助于膠質(zhì)瘤早期診斷及預(yù)后判斷。胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon like peptide 1 receptor,GLP-1R)是一種胰高血糖素樣肽 1激素的受體,參與胰島素分泌的信號級聯(lián)反應(yīng)[3]。研究表明,在前列腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中均存在GLP-1R異常表達的現(xiàn)象,GLP-1R能夠通過激活核因子κB信號通路,促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致腫瘤進展[4-5]。二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白和絲氨酸外肽酶,參與葡萄糖和胰島素代謝過程。研究表明,DPP4在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達升高,其能激活雷帕霉素靶蛋白信號通路,促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),鼠熱驚厥動物模型中,DPP4能夠通過調(diào)節(jié)GLP-1/GLP-1R信號通路,調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸能信號傳遞[8]。膠質(zhì)瘤中DPP4及GLP-1R可能存在相似的作用機制?，F(xiàn)通過研究GLP-1R、DPP4在腦膠質(zhì)瘤中的表達,探討兩者的臨床預(yù)后意義,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2018年1月武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者88例為研究對象,留取腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織,常規(guī)石蠟包埋切片處理。其中男55例,女33例,年齡35～78(57.37±6.22)歲;Kamofsky功能狀態(tài)(Kamofsky performance status,KPS)評分:≥70分42例,<70分46例;腫瘤直徑≥5 cm 49例,<5 cm 39例;侵犯腦葉數(shù)<2個38例,≥2個50例;世界衛(wèi)生組織(WHO)分級,Ⅰ～Ⅱ級39例,Ⅲ級49例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過(J201506034),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①經(jīng)病理組織檢查明確診斷為腦膠質(zhì)瘤;②首次診治,既往無放化療等治療史;③患者及家屬能夠配合隨訪,病例資料和隨訪資料完整。(2)排除標準:①合并其他器官系統(tǒng)的惡性腫瘤;②近3個月有心肌梗死、腦卒中等急危重癥疾病;③伴腦積水或腦部手術(shù)史。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 GLP-1R、DPP4蛋白檢測:將術(shù)中獲取的腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織置于10%中性甲醛固定過夜,行石蠟包埋,組織切片,厚度4 μm,37℃溫水中展片后烘干2 h。PV9000兩步法免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司。顯微鏡下(日本OLYMBUS,BX53型)觀察陽性表達部位的染色強度和范圍,進行免疫組化染色評分[9],評分根據(jù)染色強度(0分:無染色,1分:染色淺,2分:染色深)和染色面積(0分:<25%,1分:25%～50%,2分:>50%)的乘積評估。評分<2分為陰性表達,≥2分為陽性表達。

1.3.2 隨訪:患者自出院后進行隨訪,每3個月電話隨訪1次,隨訪5年,隨訪截至2021年1月或患者死亡。主要了解患者生存情況和疾病復(fù)發(fā)進展情況等。

2 結(jié) 果

2.1 腦膠質(zhì)瘤中GLP-1R、DPP4 蛋白表達 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R陽性表達主要位于細胞漿和細胞膜,DPP4陽性表達主要位于細胞核,見圖1。腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R的陽性表達率為69.32%(61/88),明顯高于癌旁組織的25.00%(22/88),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=34.680,P<0.001);腦膠質(zhì)瘤組織中DPP4的陽性表達率為72.73%(64/88),明顯高于癌旁組織的35.23%(31/88),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=24.908,P<0.001)。相關(guān)分析結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤中GLP-1R與DPP4表達呈顯著正相關(guān)(r=0.604,P<0.001)。

注:GLP-1R.胰高血糖素樣肽-1受體;DPP4.二肽基肽酶4。圖1 腦膠質(zhì)瘤中GLP-1R、DPP-4蛋白表達(免疫組化染色,×200)Fig.1 GLP-1R and DPP-4 protein expression in glioma (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4蛋白表達在不同臨床參數(shù)中比較 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4蛋白表達在不同性別、年齡、腫瘤直徑、侵犯腦葉數(shù)間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);KPS評分<70分、WHO分級Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤患者GLP-1R、DPP4蛋白表達陽性率高于KPS評分≥70分、WHO分級Ⅰ～Ⅱ級,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4的表達在不同臨床參數(shù)中差異比較 [例(%)]Tab.1 Comparison of differences in the expression of GLP-1R and DPP4 in glioblastoma tissues among different clinical parameters

2.3 GLP-1R、DPP4蛋白表達對腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響 88例腦膠質(zhì)瘤患者隨訪4～60個月,生存時間為(23.57±3.76)個月。隨訪期間失訪4例,死亡49例,5年總體生存率為41.67%(35/84)。GLP-1R陽性表達組5年總體生存率為26.32%(15/57),明顯低于陰性表達組的74.07%(20/27),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.128,P<0.001);DPP4陽性表達組5年總體生存率為31.15%(19/61),明顯低于陰性表達組的69.57%(16/23),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.670,P=0.003),見圖2。

注:GLP-1R.胰高血糖素樣肽-1受體;DPP4.二肽基肽酶4。圖2 GLP-1R、DPP4蛋白表達對腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響Fig.2 The impact of GLP-1R and DPP4 protein expression on the prognosis of glioma patients

2.4 Cox回歸分析影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險因素 以腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后為因變量,以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量,進行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R陽性表達、DPP4陽性表達、WHO分級Ⅲ級及KPS評分<70分是影響患者生存預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05),見表2。

表2 多因素Cox回歸模型分析影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險因素Tab.2 Multivariate Cox regression model analysis of risk factors affecting the prognosis of glioma patients

3 討 論

膠質(zhì)瘤是原發(fā)于顱內(nèi)神經(jīng)上皮的惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤惡性程度高,增殖迅速且呈浸潤性生長,腫瘤治療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,具有較高的致殘率和致死率,嚴重威脅人民健康[10]。近年來分子病理學(xué)研究證明,膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活、端粒酶的丟失及非整倍體等因素有關(guān),為膠質(zhì)瘤患者早期診斷、臨床預(yù)后判斷及治療方案的選擇提供理論基礎(chǔ)[11]。但目前尚無有效預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的腫瘤標志物。

胰高血糖素樣肽-1是一種由腸道L細胞分泌的多肽激素,在受到營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖、脂肪等刺激下釋放[12]。胰高血糖素樣肽-1通過其受體GLP-1R發(fā)揮作用。GLP-1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,胞外N端由3個二硫鍵形成球狀結(jié)構(gòu)域,GLP-1R激活后具有葡糖糖依賴性促進胰島素分泌的作用[13]。另有研究發(fā)現(xiàn),GLP-1R激活后能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的內(nèi)分泌、生長及分化等重要作用[4]。本研究中,膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R的表達顯著升高,與膠質(zhì)瘤患者WHO分級及KPS評分有關(guān),表明GLP-1R的表達上調(diào)促進膠質(zhì)瘤的惡性進展。膠質(zhì)瘤中GLP-1R升高的機制尚不清楚。研究表明,膠質(zhì)瘤中G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G-protein coupled receptor kinase 2,GRK2)能夠促進腫瘤細胞增殖,抑制凋亡[14]。研究表明,GRK2還能夠激活并促進GLP-1R的表達[15]。因此,膠質(zhì)瘤中GLP-1R表達升高可能與調(diào)控其表達的GRK2升高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),GLP-1R的表達能夠通過激活下游乙酰化酶3的表達,促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強,在動物實驗中予以GLP-1R抑制劑治療后,腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移明顯受到抑制[16]。本研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤中GLP-1R的陽性表達膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后較差,提示GLP-1R是評估膠質(zhì)瘤預(yù)后的腫瘤標志物。有學(xué)者報道,GLP-1R的活化能夠促進化療耐藥基因多藥耐藥相關(guān)蛋白1和P-糖蛋白的表達,促進腫瘤細胞對順鉑等化療藥物耐藥性形成[17]。因此, GLP-1R可能是作為一種促癌因子,通過調(diào)控下游癌基因信號途徑的傳導(dǎo),參與膠質(zhì)瘤的腫瘤進展,導(dǎo)致患者的不良生存預(yù)后。

DPP4是一種Ⅱ型跨膜蛋白,又稱為CD26。結(jié)構(gòu)上,DPP4具有短的6個氨基酸胞質(zhì)尾,屬于絲氨酸蛋白酶S9B家族,廣泛表達于骨髓衍生細胞、骨骼肌細胞、血管平滑肌細胞和脂肪細胞等。功能上,DPP4能與多種細胞表面分子相互作用,參與T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)CD4+T細胞的分化、成熟及遷移,并影響細胞因子的分泌等多種生物學(xué)功能[18]。近年來發(fā)現(xiàn),膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中DPP4表達上調(diào),其通過調(diào)節(jié)機體免疫功能、炎性反應(yīng)、細胞黏附和細胞調(diào)亡等過程,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,19]。本研究中,膠質(zhì)瘤中DPP4表達顯著上調(diào),這與既往學(xué)者在低級別膠質(zhì)瘤中報道的結(jié)果一致[20]。膠質(zhì)瘤中DPP4表達上調(diào)與非編碼RNA調(diào)控異常有關(guān)。有研究報道,miR-152能夠結(jié)合并抑制DPP4的表達,抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲,腫瘤發(fā)生時miR-152表達下調(diào),導(dǎo)致DPP4過度表達,促進腫瘤的惡性增殖和遷移[21]。本研究中,DPP4表達與膠質(zhì)瘤不良臨床病理特征有關(guān),提示DPP4作為一種促癌基因,其表達升高促進膠質(zhì)瘤的疾病進展。既往研究表明,腫瘤抑制因子p53的表達能夠促進DPP4的蛋白降解,導(dǎo)致細胞膜脂質(zhì)過氧化及鐵死亡發(fā)生,發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng),膠質(zhì)瘤發(fā)生時p53基因突變導(dǎo)致DPP4蛋白積累,導(dǎo)致腫瘤細胞鐵死亡減少[22]。此外,膠質(zhì)瘤發(fā)生時DPP4還能夠促進組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的表達,進而激活p62/Keap1/Nrf2信號通路的信號傳導(dǎo),進而促進腫瘤細胞遷移和侵襲[23]。本研究中,DPP4陽性表達是影響膠質(zhì)瘤患者不良生存預(yù)后的獨立危險因素,表明DPP4是評估膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的腫瘤標志物。分析其原因,可能是DPP4的表達上調(diào)能降低腫瘤細胞對化療藥物治療的敏感性。有學(xué)者報道,高表達DPP4的腫瘤細胞能夠抑制腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞,介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,同時通過分泌促炎性細胞因子,增強腫瘤細胞對順鉑等化療藥物的耐藥性,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[18]。同時,本研究顯示,GLP-1R與DPP4在膠質(zhì)瘤組織中表達呈顯著正相關(guān),兩者之間的相互作用機制尚不清楚。研究報道,DPP4通過裂解激活GLP1,生成肽酪氨酸和神經(jīng)肽Y,兩者能夠結(jié)合GLP-1R 等配體,促進下游信號傳遞[24]。因此,筆者推測,膠質(zhì)瘤中DPP4和GLP-1R可能發(fā)揮協(xié)同促進腫瘤進展的生物學(xué)作用,值得臨床深入研究,以探索膠質(zhì)瘤的新治療靶點。

綜上所述,膠質(zhì)瘤中GLP-1R、DPP4蛋白表達上調(diào),兩者表達與WHO分級及KPS評分有關(guān),共同參與促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。膠質(zhì)瘤組織中GLP-1R、DPP4陽性表達是患者不良生存預(yù)后的獨立危險因素,可能是新的膠質(zhì)瘤預(yù)后評估的腫瘤標志物,值得臨床深入探討。但本研究缺乏深入的機制探索,有待今后擴大樣本量及基礎(chǔ)細胞實驗進行研究。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

周雪琴:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;羅志華:提出研究思路,資料搜集整理;黃從剛:分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;康麗:進行統(tǒng)計學(xué)分析,論文修改;黃喬春:課題設(shè)計,論文撰寫