劉巖,凌琬茗,趙瑞雪,王浩

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種多發(fā)于兒童且發(fā)病率較高(10%～17%)的慢性炎性皮膚病,若診斷不及時(shí)可能繼發(fā)膿皰感染,甚至導(dǎo)致紅皮病的發(fā)生[1-2]。AD可能與遺傳、免疫系統(tǒng)、環(huán)境等多個(gè)方面有關(guān)[3-4]。近年來(lái)分子生物標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中的研究越來(lái)越多,因此,尋找可靠的分子生物學(xué)指標(biāo)對(duì)于AD的臨床早期識(shí)別及預(yù)后改善十分重要。外泌體廣泛分布于各種體液,對(duì)機(jī)體自身免疫疾病具有調(diào)節(jié)作用,且參與細(xì)胞生物學(xué)行為及組織修復(fù)等過(guò)程,取少許樣品即可在臨床上用于分析研究,且檢測(cè)標(biāo)本容易獲取、創(chuàng)傷較小[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)是一種長(zhǎng)度>200個(gè)堿基的反義RNA分子,在免疫疾病的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[6-7]。唐敏等[8]研究表明,LncRNA MIR155HG與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病有關(guān)。目前在AD患兒血漿外泌體中LncRNA MIR155HG的表達(dá)相關(guān)的報(bào)道較少?；诖?本研究檢測(cè)并比較LncRNA MIR155HG在AD患兒與健康兒童血漿外泌體中的表達(dá)差異,并以此為基礎(chǔ)分析其與病情進(jìn)展之間的關(guān)系,期望為AD的臨床早期及時(shí)控制提供參考,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年12月—2023年1月于河北省兒童醫(yī)院皮膚科就診的AD患兒118例(AD組)為研究對(duì)象,男58例,女60例,年齡1～14(6.72±3.36)歲,病程(2.11±0.47)年。以急性濕疹為主,表現(xiàn)為亞急性和慢性皮損,皮疹干燥肥厚,呈苔蘚樣變,發(fā)生于面頸、腘窩、肘窩、小腿等部位。另選同期健康體檢兒童120例作為健康對(duì)照組,男62例,女58例,年齡1～13(6.51±3.15)歲;排除標(biāo)準(zhǔn):(1)測(cè)試當(dāng)日有化妝品或護(hù)膚品使用;(2)近1周使用過(guò)抗生素;(3)存在皮損。AD組和健康對(duì)照組兒童性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)研究同意(LS臨床20210106),受試者監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②測(cè)量部位無(wú)皮膚損傷;③近1個(gè)月無(wú)糖皮質(zhì)激素、抗生素及免疫抑制劑等使用史;④無(wú)其他基礎(chǔ)病、合并癥及家族遺傳史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①其他自身免疫性疾病;②感染性疾病;③惡性腫瘤。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 收集患兒確診后第2天、健康者體檢當(dāng)天空腹靜脈血4 ml,肝素抗凝后,離心留取血漿,-70℃儲(chǔ)存待測(cè)。

1.3.1 血漿外泌體提取:(1)使用外泌體提取試劑盒(涿州捷融生物科技有限公司)分離血漿外泌體,磷鎢酸染色外泌體后,以透射電鏡(型號(hào)JEM-1230,長(zhǎng)春百克生物科技股份公司)進(jìn)行結(jié)果分析。(2)外泌體顆粒濃度采用納米粒度儀(型號(hào)Zetasizer,長(zhǎng)春市中保牧生物科技有限公司)進(jìn)行測(cè)定,樣品稀釋5 000倍,按照納米粒度儀操作說(shuō)明設(shè)置檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。(3)獲取血細(xì)胞、外泌體樣品、血漿,提取總蛋白,定量100 μg蛋白后,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉操作,分別加入外泌體表面標(biāo)志蛋白[CD9(1∶670)、CD63(1∶710)、TSG101(1∶710)、Calnexin(1∶690)](涿州捷融生物科技有限公司)一抗孵育20 h,添加羊抗兔二抗(1∶1 630)(河南祺祥科技生物有限公司)孵育3 h后,ECL試劑顯色,凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)SH-1720,長(zhǎng)春市中保牧生物科技有限公司)拍照。

1.3.2 熒光定量PCR(qRT-PCR)法測(cè)定血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平:血漿外泌體總RNA采用TRIzol試劑(涿州捷融生物科技有限公司)提取,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(河南祺祥科技生物有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得cDNA。使用qRT-PCR儀(型號(hào)eQ164CP,長(zhǎng)春百克生物科技股份公司)并參照PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)(涿州捷融生物科技有限公司)說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系30 μl:SYBR Premix Ex Taq 18 μl,cDNA 2 μl,H2O 9 μl,上下游引物各0.5 μl。反應(yīng)條件:92℃ 19 s、91℃ 17 s、57℃ 23 s、74℃ 18 s,共循環(huán)32次。LncRNA MIR155HG、GAPDH引物均由長(zhǎng)春百克生物科技股份公司合成,LncRNAMIR155HG上游引物:5’-TGCGGCAAAGTGCT-TACAGTG-3’,下游引物:5’-CCAGTGCAGGGTCCG-AGGT-3’;GAPDH上游引物:5’-GAAGGTGAAGGTC-GGAGTC-3’,下游引物:5’-AAGATGGTGATGGG-ATTTC-3’。以2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA MIR155HG相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 AD積分指數(shù)(SCORAD)評(píng)價(jià):對(duì)所有AD患兒進(jìn)行SCORAD評(píng)分,SCORAD評(píng)分(0～103分)包含:皮損范圍(A)、皮損嚴(yán)重程度(B)、瘙癢和影響睡眠程度(C)。SCORAD總分計(jì)算公式為A/5+7B/2+C,評(píng)分越高表示AD病情越嚴(yán)重。依據(jù)評(píng)分分為輕度亞組(41例,評(píng)分<25分)、中度亞組(38例,25分≤評(píng)分≤50分)、重度亞組(39例,評(píng)分>50分)[9]。

2 結(jié) 果

2.1 血漿外泌體鑒定 (1)透射電鏡顯示:圓形脂質(zhì)雙層膜囊狀顆粒直徑約140 nm,且清晰可見(jiàn),見(jiàn)圖1。(2)納米粒度儀檢測(cè)結(jié)果顯示:顆粒直徑為30～195 nm,單峰正態(tài)分布(峰值約54 nm),見(jiàn)圖2。(3)免疫印跡法顯示:外泌體樣品中外泌體標(biāo)志蛋白(CD63、CD9、TSG101)表達(dá)較穩(wěn)定,Calnexin蛋白表達(dá)不穩(wěn)定,見(jiàn)圖3。表明純化樣品中外泌體顆粒大量存在。

圖1 血漿外泌體透射電鏡結(jié)果(磷鎢酸染色,×10 000)Fig.1 Transmission electron microscopy results of plasma exosomes (stained with phosphotungstic acid, × 10 000)

圖2 血漿外泌體納米粒度儀檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of nanoparticle analyzer for plasma exosomes

圖3 血漿外泌體蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Immunoblotting test results of plasma exosomes protein

2.2 2組血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平比較 AD組血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平高于健康對(duì)照組(2.85±0.85 vs.1.00±0.00,t/P=23.843/<0.001)。

2.3 3亞組血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平、SCORAD評(píng)分比較 輕度亞組、中度亞組、重度亞組AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平、SCORAD評(píng)分依次升高(P均<0.01),見(jiàn)表1。

表1 不同嚴(yán)重程度AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平及SCORAD評(píng)分比較Tab.1 Comparison of plasma exosomes LncRNA MIR155HG expression levels and SCORAD scores in children with different severity of AD

2.4 血漿外泌體LncRNA MIR155HG與SCORAD評(píng)分的相關(guān)性 AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG與SCORAD評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.673,P<0.001)。

2.5 血漿外泌體LncRNA MIR155HG對(duì)中度、重度AD的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血漿外泌體LncRNA MIR155HG診斷中度AD的曲線下面積(AUC)為0.831(95%CI0.758～0.935),截?cái)嘀禐?.13,敏感度為0.741,特異度為0.916,約登指數(shù)0.657;診斷重度AD的AUC為0.802(95%CI0.704～0.891),截?cái)嘀禐?.31,敏感度為0.715,特異度為0.817,約登指數(shù)0.532;診斷中度和重度AD的AUC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z/P=1.008/0.313),見(jiàn)圖4。

圖4 LncRNA MIR155HG診斷中度、重度AD的ROC曲線Fig.4 ROC curve of LncRNA MIR155HG in diagnosing moderate and severe AD

3 討 論

AD又被稱(chēng)作可遺傳的過(guò)敏性皮炎,是多見(jiàn)于兒童及青少年的皮膚病,常表現(xiàn)為皮膚大面積紅斑、丘疹、頑固性瘙癢及皮膚干燥等癥狀,其發(fā)病可能與遺傳、免疫、環(huán)境及精神等因素有關(guān)[10]。臨床尚無(wú)特效治療方法,由于易復(fù)發(fā)、易騷癢等特征,其會(huì)對(duì)患兒及家屬造成嚴(yán)重影響[11-12],因此臨床急需可輔助診斷的分子生物標(biāo)志物。

外泌體由細(xì)胞釋放,作為最小的細(xì)胞外囊泡之一,其密度為1.10～1.18 g/ml。細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒形成的多囊泡體受刺激后與質(zhì)膜融合,導(dǎo)致外泌體的釋放,外泌體相關(guān)蛋白CD9、CD63等均會(huì)在此過(guò)程被轉(zhuǎn)運(yùn)[13-14]。本研究首先提取鑒別外泌體,染色后觀察(透射電鏡),可見(jiàn)圓形脂質(zhì)雙層膜囊狀顆粒,直徑約為140 nm。納米粒度儀檢測(cè)結(jié)果顯示顆粒主要分布于30～195 nm,且分散均一,直徑呈單峰正態(tài)分布曲線,峰值約在54 nm處。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,CD63、TSG101、CD9外泌體標(biāo)志蛋白在外泌體樣品穩(wěn)定表達(dá)。表明純化樣品中外泌體顆粒的存在。

外泌體能夠攜帶不同的具有生物活性的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸[信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、LncRNA、DNA等],并能有效地將此類(lèi)活性物質(zhì)運(yùn)輸至不同的受體細(xì)胞,從而改變受體細(xì)胞的生物活動(dòng)[15-17]。MIR155HG是人染色體9p21上的高度保守重要LncRNA,也是微小RNA-155(miR-155)的宿主LncRNA,miR-155作為其前體序列與免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[18]。盧山明等[19]研究發(fā)現(xiàn),與健康人比較,血虛風(fēng)燥型AD患者血清miR-155水平明顯升高。唐敏等[8]研究發(fā)現(xiàn),自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中LncRNA MIR155HG水平明顯高于健康對(duì)照組,且與疾病活動(dòng)度有關(guān),提示LncRNA MIR155HG可能為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度評(píng)估及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。因此推測(cè)LncRNA MIR155HG與免疫系統(tǒng)疾病AD的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平較健康兒童更高,且隨嚴(yán)重程度的增加逐漸升高。與上述相關(guān)研究趨勢(shì)一致,說(shuō)明患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG的異常升高可能參與AD的發(fā)生與進(jìn)展,分析原因,LncRNA MIR155HG及其前體序列miR-155可對(duì)AD患兒機(jī)體炎性因子進(jìn)行調(diào)控,從而參與免疫應(yīng)答反應(yīng)。SCORAD評(píng)分是AD評(píng)估常用標(biāo)準(zhǔn),可用于AD患者病情嚴(yán)重程度的評(píng)估[20]。此外,在本研究中AD患兒LncRNA MIR155HG與SCORAD評(píng)分呈正相關(guān),進(jìn)一步表明血漿外泌體LncRNA MIR155HG異常升高可能參與了AD病情的進(jìn)展過(guò)程,LncRNA MIR155HG表達(dá)水平越高則表明病情越嚴(yán)重。為進(jìn)一步探究血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平與AD嚴(yán)重程度的關(guān)系,本研究分析了LncRNA MIR155HG的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達(dá)水平診斷中度、重度AD的AUC分別為0.831、0.802,截?cái)嘀捣謩e為2.13、3.31,敏感度分別為0.741、0.715,特異度分別為0.916、0.817。表明血漿外泌體LncRNA MIR155HG對(duì)AD嚴(yán)重程度有較高的診斷價(jià)值,臨床上要關(guān)注血漿外泌體LncRNA MIR155HG高于2.13、3.31的AD患兒,這類(lèi)患兒容易發(fā)展為中度、重度AD。

綜上所述,AD患兒血漿外泌體LncRNA MIR155HG高表達(dá),且其可能與AD病情的嚴(yán)重程度有關(guān),定時(shí)監(jiān)測(cè)其表達(dá)變化可用于AD患兒的病情評(píng)估。但關(guān)于LncRNA MIR155HG作用于AD患兒的具體機(jī)制仍需后續(xù)深入探索。

利益沖突:所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉巖:設(shè)計(jì)研究方案,課題設(shè)計(jì),實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);凌琬茗:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;趙瑞雪:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;王浩:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析