崔永亮，羅 偉，雷久城，余秀梅，程祖強(qiáng)，吳航玉，張玉婷，陳緒玲，胡 驥

（1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川 成都 610041；2.四川省生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院，四川 成都 610041；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 610041；4.四川省自然資源科學(xué)研究院成都分院，四川 成都 610000）

0 引言

近年來，農(nóng)田土壤重金屬污染問題日漸凸顯，重金屬對土壤的組成及其功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的消極影響［1］，造成了食品安全問題和生態(tài)系統(tǒng)破壞等不良后果［2］。為修復(fù)土壤重金屬污染，改善土壤生態(tài)環(huán)境，科學(xué)家深入研究了多種土壤重金屬修復(fù)技術(shù)，如物理修復(fù)技術(shù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)和生物修復(fù)技術(shù)。然而，傳統(tǒng)的化學(xué)修復(fù)和物理修復(fù)技術(shù)成本高、效率低，且存在產(chǎn)生二次污染的風(fēng)險(xiǎn)［3］。目前，經(jīng)濟(jì)高效、綠色環(huán)保的生物修復(fù)技術(shù)，尤其是微生物—植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，已成為解決土壤重金屬污染問題的重要手段。微生物－植物聯(lián)合修復(fù)是一種利用植物根際微生物分泌的活性物質(zhì)來提高植物對重金屬的吸收、累積或固定效率的修復(fù)技術(shù)。根際微生物可以通過分泌植物激素、維生素，利用根瘤菌固氮等方式促進(jìn)植物生長，以提高植物生物量的方式增加重金屬的總積累量［4］。根瘤菌—豆科植物共生體系是目前修復(fù)土壤重金屬污染較為有效的方法之一。在土壤重金屬濃度過高時(shí)，根瘤菌—豆科植物共生體系能形成解毒機(jī)制和重金屬抗性來抵抗重金屬脅迫［5－7］，同時(shí)固氮作用還可以大幅提高土壤養(yǎng)分促進(jìn)植物生長［8，9］，顯著提高作物產(chǎn)量［10］，其所固定的氮約占生物固氮總量的65%［11］。鄒萌萌的研究表明，白三葉—根瘤菌修復(fù)體系在被Cu 污染的土壤中能通過提高白三葉的生物量及其對Cu 的吸收量來提升土壤修復(fù)效率［12］。宋修勇的研究發(fā)現(xiàn)，接種了根瘤菌的天藍(lán)苜蓿對重金屬脅迫的耐受性更強(qiáng)，且結(jié)瘤數(shù)與固氮酶活均有顯著提高［13］。練建軍等在使用紫花苜?！鼍w系修復(fù)鉬污染土壤時(shí)發(fā)現(xiàn)，根瘤菌不僅能促進(jìn)重金屬鉬由水溶態(tài)向中間過渡態(tài)的轉(zhuǎn)變，也能增大土壤殘?jiān)鼞B(tài)鉬的比例，從而促進(jìn)紫花苜蓿對鉬的吸收，同時(shí)降低鉬對紫花苜蓿的生物毒性，修復(fù)效果良好［14］。

在篩選適合開展重金屬土壤污染修復(fù)的生物材料時(shí)，不僅需要考慮植物的重金屬富集能力，還需要考慮植物的經(jīng)濟(jì)效益。因此，作為油料作物的花生受到了廣泛關(guān)注。研究表明，花生對土壤中的Cd、Zn、Cu、Cr、Hg、Ni 等重金屬具有良好的吸收作用［15－18］，且花生果實(shí)對Cd的富集能力最強(qiáng)［16］。然而，鮮有研究探討添加花生根瘤菌是否能提高花生對土壤重金屬的耐受能力和富集能力，篩選具有重金屬抗性的花生根瘤菌的研究也同樣稀缺。

此外，最新研究表明，根瘤菌除固氮外，還具有溶磷、解鉀、分泌IAA（indoleacetic acid，吲哚乙酸）等促生功能［19，20］。磷元素是植物生長的必需元素，但土壤中的磷元素都是以難溶于水的化合物的形式存在，難以被作物直接吸收。植物根系和土壤微生物的水解作用能將其轉(zhuǎn)化為植物可利用的形式，但轉(zhuǎn)化過程緩慢，效率低下［21，22］。近年來的研究表明，根瘤菌與共生植物形成的根瘤能提高磷元素的轉(zhuǎn)化效率，顯著提高植物生物量［23－26］。

綜上，本研究擬對從典型鎘污染區(qū)域農(nóng)田中采集的花生根瘤菌進(jìn)行研究，篩選出在重金屬脅迫下具有較好溶磷能力的菌株，為微生物—植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)提供重要的根瘤菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

花生根瘤菌。從鎘污染區(qū)域農(nóng)田采集的花生根瘤中分離純化得到36 株花生根瘤菌，置于60%甘油中保存于－80℃冰箱。

花生根瘤中存在多種細(xì)菌，可通過使用YMA培養(yǎng)基對根瘤菌進(jìn)行分離提純，其配置方法為酵母粉1.5g／L，甘露醇1g／L、K2HPO40.5g／L、MgSO4·7H2O 0.2g／L、NaCl 0.1g／L、去離子水1 L，pH 7.0。PKO 固體培養(yǎng)基常用于測定微生物是否具有分解無機(jī)磷的能力，篩選解磷微生物，其配置方法為葡萄糖10g／L、Ca3（PO4）25.0g／L、（NH4）2SO40.5g／L、NaCl 0.2g／L、MgSO40.03g／L、MnSO40.03g／L、FeSO40.003g／L、KCl 0.2g／L、瓊脂20g／L、去離子水1L，pH7.2。PKO 液體培養(yǎng)基常用于對解磷微生物分解無機(jī)磷的能力進(jìn)行定量分析，精確比較不同解磷微生物分解無機(jī)磷的能力，其配置方法為葡萄糖10g／L、Ca3（PO4）25.0g／L、（NH4）2SO40.5g／L、NaCl 0.2g／L、MgSO40.03g／L、MnSO40.03g／L、FeSO40.003g／L、KCl 0.2g／L、去離子水1L，pH7.2。

1.2 方法和設(shè)備

1.2.1 方法

1.2.2 設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，恒溫震蕩搖床，離心機(jī)，分光光度計(jì)，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，ICP－OES等。

1.2.3 菌株活化

在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取保種于60%甘油中的花生根瘤菌分別劃線于YMA 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2d。

1.2.4 菌株溶磷作用測定

根瘤菌溶磷能力測定實(shí)驗(yàn)分為定性測定和定量測定［22］。

①定性測定。將根瘤菌接種在PKO 固體培養(yǎng)基上，每個(gè)平板采用點(diǎn)接法接3 個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)接4μL培養(yǎng)好的菌液，28 ℃下培養(yǎng)7d 后測量菌落直徑和周圍透明圈直徑，并計(jì)算有效透明圈直徑。②定量測定。稱取1.5g 左旋抗壞血酸溶于100mL鉬銻混合液［27］。在試管中裝入6mL 液體PKO 培養(yǎng)基，滅菌后備用。按1%接種量在液體PKO培養(yǎng)基中接種被測菌株，每株菌設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，并以接種無菌水的培養(yǎng)基為對照。在150r／min，28 ℃的環(huán)境下振蕩培養(yǎng)7d 后，取培養(yǎng)液在8000r／min 的轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液稀釋后，用鉬銻抗比色法測定上清液中的磷含量。取3mL 上清液，測定pH 值。菌液中磷的含量＝（P×V1×TS）／V2（P：根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出的磷的濃度；V1：測定OD值所定容的體積；TS：分取倍數(shù)；V2：所搖菌液的體積）。

公式（2）中Qd+Qg-Qw為干燥垃圾所需熱量，設(shè)每千克濕垃圾含水率取50%，每千克濕垃圾需蒸發(fā)水分m=0.5 kg，垃圾屬于混合物，且具有各向不同性，其比熱容較難求得，且垃圾比熱容小于水。設(shè)干燥1kg垃圾需要熱量為q，按公式（3）計(jì)算：

1.2.5 根瘤菌的分子鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用異硫氰酸胍（GUTC）法提取根瘤菌的DNA進(jìn)行測序鑒定［22］，并用核酸檢測儀與瓊脂糖凝膠電泳對DNA 的質(zhì)量進(jìn)行檢測分析。對提取的DNA使用PCR 引物27F：5′－GAGTTTGATCACTGGCTCAG－3′ 和 1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行分析，用鄰接法在MEGA6.0 中構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 根瘤菌重金屬抗性測定

對篩選的菌株進(jìn)行重金屬抗逆性分析。配置YMA液體培養(yǎng)基，在試管中加入5ml 培養(yǎng)基后，分別加入不同濃度梯度的Cu、Ni、Cd、Cr、Zn 五種重金屬，濃度梯度按照0、5、10、15、…、70、75、80mg／kg設(shè)置。將菌株以1：100 的比例接種到培養(yǎng)基中，以不接種菌株但添加重金屬的培養(yǎng)基作為對照組，每組處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。28℃、150r／min 培養(yǎng)2 d 后用分光光度計(jì)分別測定OD600，獲得重金屬對菌株的致死濃度。

1.2.7 重金屬脅迫下花生根瘤菌的溶磷能力測定

根據(jù)典型鎘污染區(qū)域農(nóng)田重金屬抗性測定結(jié)果，以5 種重金屬的致死濃度為上限，從0mg／kg 開始，分別加入到滅菌后的PKO 液體培養(yǎng)基中，再接入根瘤菌懸液3mL，以不接菌的PKO液體培養(yǎng)基作為對照組，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。28 ℃的環(huán)境下振蕩培養(yǎng)7 d后，測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量和pH值，分析不同濃度重金屬脅迫下根瘤菌溶磷能力及對應(yīng)pH值的變化。

2 結(jié)果及分析

2.1 根瘤菌溶磷能力測定

經(jīng)過定性測量無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)的透明圈來判斷菌株是否擁有溶磷能力。在36 株根瘤菌中，有19 株根瘤菌產(chǎn)生了大小不一的溶磷圈，透明圈直徑為0.07—1.47cm（表1）。在這19 株菌株中，只有1 株菌株（HM28）的透明圈直徑大于1 cm，有3 株菌株（HW22、HG13、HG16）的透明圈直徑在0.5—1cm之間。

表1 花生根瘤菌溶磷能力測定Table 1 Phosphorus solubilization of peanut rhizobium detection

使用鉬銻抗比色法進(jìn)一步定量測定初篩菌株的溶磷能力。通過定性測定篩選出的19 株根瘤菌其溶磷量各不相同，溶磷量為7.54－55.81μg／mL（表1）。有2 株菌株（HM28、HM2）的溶磷量超過50μg／mL。有4 株菌株（HM21、HW42、HW39、HW38）的溶磷量在40－50μg／mL 之間。有2 株菌株（HG8、HM52）的溶 磷 量在30－40μg／mL 之間。菌 株HM28、HM2 和HM21 具有較高由效溶磷能力，分別為55.81μg／mL、52.82μg／mL和48.61μg／mL。

2.2 根瘤菌的分子鑒定

使用測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

圖1 高效溶磷花生根瘤菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of effective phosphorus－soluble peanut rhizobium

由圖1 可知，溶磷能力較好的3 株根瘤菌均屬于根瘤菌屬（Rhizobium），但這3 種根瘤菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于兩個(gè)分支。其中，HM2 和HM21 與標(biāo)準(zhǔn)菌株Rhizobium altiplani BR 10423T 在同一個(gè)分支上，因此將兩種菌株初步鑒定為Rhizobium altiplani；HM28 與標(biāo)準(zhǔn)菌株Rhizobium metallidurans ChimEc 512T在同一個(gè)分支上，因此將其初步鑒定為Rhizobium metallidurans。

2.3 根瘤菌重金屬抗性測定

具有較好溶磷作用的根瘤菌的重金屬（Cu、Ni、Cd、Cr、Zn）抗性測定結(jié)果如圖1 所示。HM28 對Cu、Ni、Cd、Cr、Zn 的 致 死 濃 度 分 別 為30mg／kg、40mg／kg、10mg／kg、25mg／kg、50mg／kg，因 此 選 取0—30mg／kg、0—40mg／kg、0—10mg／kg、0—25mg／kg、0—50mg／kg作為濃度區(qū)間分別進(jìn)行Cu、Ni、Cd、Cr、Zn脅迫下的溶磷作用測定。HM2 對Cu、Ni、Cd、Cr、Zn的致死濃度分別為50mg／kg、30mg／kg、10mg／kg、25mg／kg、20mg／kg，因此選取0—50mg／kg、0—30mg／kg、0—10mg／kg、0—25mg／kg、0—20mg／kg 作為濃度區(qū)間分別進(jìn)行Cu、Ni、Cd、Cr、Zn 脅迫下的溶磷作用測定。HM21 對Cu、Ni、Cd、Cr、Zn 的致死濃度分 別 為50mg／kg、50mg／kg、50mg／kg、50mg／kg、50mg／kg，因此選取0—50mg／kg、0—50mg／kg、0—50mg／kg、0—50mg／kg、0—50mg／kg 作為濃度區(qū)間分別進(jìn)行Cu、Ni、Cd、Cr、Zn脅迫下溶磷作用測定。

2.4 重金屬脅迫下花生根瘤菌的溶磷能力測定

鉬銻抗比色法測定溶磷量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3株根瘤菌在5 種重金屬的脅迫下，隨著重金屬濃度逐漸增加，活菌數(shù)降低，pH值逐漸升高，其溶磷作用均降低（圖2—4）。

圖2 不同重金屬脅迫下HM28 的溶磷能力及pH值變化曲線Figure 2 Phosphorus solubilization and pH change curves of HM28 under different heavy metal stress

由圖2 可知，菌株HM28 在Cu 的脅迫下，菌株在0—12mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在12—18mg／kg 的 濃度 之 間 幾 乎 無 變化，在18—30mg／kg的濃度之間下降較緩慢，在濃度為30mg／kg時(shí)，沒有溶磷作用；在Ni的脅迫下，菌株在0—8mg／kg和16—24mg／kg的濃度之間溶磷量變化比較小，在8—16mg／kg 和24—40mg／kg 的濃度之間下降較快，在濃度為40mg／kg 時(shí)，沒有溶磷作用；在Cd 的脅迫下，菌株在0—4mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較緩慢，在4—6mg／kg 濃度之間幾乎沒有變化，在6—10mg／kg的濃度之間下降較快，在濃度為10mg／kg時(shí)，沒有溶磷作用；在Cr 的脅迫下，菌株在0—10mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在10—25mg／kg的濃度之間下降較緩慢，在濃度為25mg／kg時(shí)，失去溶磷作用；在Zn的脅迫下，菌株在0—20 mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在20—50mg／kg的濃度之間溶磷量下降較緩慢，在50mg／kg濃度時(shí)，失去溶磷作用。

從圖3 可知，菌株HM2 在Cu的脅迫下，菌株在0—20mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在20—50mg／kg濃度之間下降較緩慢；在Ni 的脅迫下，菌株在0—6mg／kg的濃度之間溶磷量幾乎無變化，在6—30mg／kg的濃度之間下降較快，在濃度為30mg／kg時(shí)，失去溶磷作用；在Cd 的脅迫下，菌株在0—8mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在濃度為10mg／kg時(shí)，失去溶磷作用；在Cr的脅迫下，菌株在0—5mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在5—25mg／kg之間下降較緩慢，在濃度為25mg／kg時(shí)，失去溶磷作用；在Zn 的脅迫下，菌株在0—12mg／kg的濃度之間溶磷量下降較快，在12—20mg／kg 之間變化不大，在濃度為20mg／kg時(shí)，失去溶磷作用。

圖3 不同重金屬脅迫下HM2 的溶磷能力及pH值變化曲線Figure 3 Phosphorus solubilization and pH change curves of HM2 under different heavy metal stress

從圖4 可知，菌株HM21 在Cu 的脅迫下，菌株在0—50mg／kg的濃度之間溶磷量都下降較快，在濃度為50mg／kg時(shí)，失去溶磷作用；在Ni的脅迫下，菌株在0—10mg／kg 和40—50mg／kg 的濃度之間溶磷量變化較快，在10—40mg／kg 的濃度之間變化較小，在濃度為50mg／kg 時(shí)，失去溶磷作用；在Cd 的脅迫下，菌株在0—10mg／kg 的濃度之間溶磷量幾乎無變化，在10—50mg／kg 濃度之間下降較快，在濃度為50mg／kg時(shí)，失去溶磷作用；在Cr的脅迫下，菌株在0—20mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在20—50mg／kg 之間下降緩慢，在濃度為50mg／kg時(shí)，失去溶磷作用；在Zn 的脅迫下，菌株在0—50mg／kg 的濃度之間溶磷量下降較快，在濃度為50mg／kg以上時(shí)，失去溶磷作用。

圖4 不同重金屬脅迫下HM21 的溶磷能力及pH值變化曲線Figure 4 Phosphorus solubilization and pH change curves of HM21 under different heavy metal stress

3 討論

從鎘污染區(qū)域的農(nóng)田土壤中分離出的36 株根瘤菌，有19 株具有溶磷能力。也有部分研究者發(fā)現(xiàn)微生物的溶磷能力不僅受菌株自身特質(zhì)的影響，也會受培養(yǎng)環(huán)境影響［23，26］。有相關(guān)研究表明，同一種菌株對不同的難溶性磷酸鹽的溶解能力有所差異。李靜等研究發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紅青霉菌R3 對Ca3（PO4）2的溶解能力最高達(dá)328.79 mg／L，對AlPO4和FePO4的最高溶解量分別為95.99mg／L 和75.39mg／L，溶磷量Ca3（PO4）2＞AlPO4＞FePO4［28］。但本研究得到的僅為實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)條件下的測定結(jié)果，篩選出的菌株是否具有較好的田間溶磷能力需要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

在含有不同濃度梯度重金屬的液體培養(yǎng)基中HM28、HM2、HM21 溶磷能力變化的測定結(jié)果表明，3 株根瘤菌的溶磷能力會隨著重金屬濃度的增高而降低，且根瘤菌的溶磷量和pH 值變化存在一定關(guān)系。研究表明，溶磷微生物通過分泌有機(jī)酸等物質(zhì)分解難溶性礦物磷，導(dǎo)致培養(yǎng)液pH降低，但不同菌株分泌的有機(jī)酸種類和含量差異較大，所以不同菌株在培養(yǎng)時(shí)測得的pH值也不相同［25，29］。

嚴(yán)警等發(fā)現(xiàn)不同根瘤菌與不同豆科植物共生會因?yàn)閮烧呋虻募嫒菪源嬖诓町惗绊懘偕芰Γ?0］。一些根瘤菌可以與廣泛的宿主共生，但一些根瘤菌只具有專一宿主。不同區(qū)域的環(huán)境，如氣候、土壤等自然環(huán)境條件也會影響共生關(guān)系的建立。綜上所述，根瘤菌與宿主建立共生關(guān)系是根瘤菌、植物和環(huán)境三者相互作用的結(jié)果。因此，已篩選的菌株與花生的共生作用是否能夠?qū)嶋H應(yīng)用于重金屬污染土壤環(huán)境，還需要進(jìn)行多品種、多地的應(yīng)用研究，并闡明其互作機(jī)理。

4 結(jié)論

經(jīng)過定性和定量測定，來自典型鎘污染區(qū)域農(nóng)田的36 株花生根瘤菌中，有52.8%的菌株具有溶磷能力，并且對不同重金屬有不同程度的抗性，且隨著重金屬濃度增加，溶磷作用減弱，pH值逐漸升高，說明重金屬對根瘤菌的溶磷作用有抑制作用。本研究獲得了3 株具有較好溶磷能力的根瘤菌HM28，HM2 和HM21，其中HM28 和HM2 的溶磷量超過50μg／ml。此外，HM28 經(jīng)初步鑒定為Rhizobium metallidurans，HM2 和HM21 經(jīng)初步鑒定為Rhizobium altiplani。本研究篩選獲得的3 株根瘤菌為重金屬污染土壤的生物修復(fù)提供了可利用的菌種資源。