周秉正,陳生學(xué),劉思嘉,祁得林,祁洪芳,汪 洋,趙 凱,田 菲

( 1.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所, 高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室, 高原魚類進(jìn)化與功能基因組學(xué)實驗室,青海 西寧 810001;2.青海省動物生態(tài)基因組學(xué)重點實驗室,青海 西寧 810001;3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;4. 青海大學(xué),省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室,青海 西寧 810001;5.青海湖裸鯉繁育重點實驗室,青海湖裸鯉救護(hù)中心,青海 西寧 810001 )

青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskiissp.przewalskii)屬鯉形目鯉科裂腹魚亞科。裂腹魚亞科魚類是鯉科魚類中唯一一種適應(yīng)青藏高原極端環(huán)境的自然群體。青海湖裸鯉是裂腹魚類中研究最為廣泛的物種之一,主要棲息于我國最大的咸水湖泊青海湖(鹽度12～14、pH 9.0～9.2)[1]。前期研究表明,青海湖裸鯉起源于生活在黃河淡水環(huán)境中的花斑裸鯉(G.ecklonissp.eckloni)[2],由于地理隔離和對自然環(huán)境的長期適應(yīng),使青海湖裸鯉演化出其特有的形態(tài)、生理以及遺傳特征。因此,青海湖裸鯉是研究青藏高原極端環(huán)境下物種形成和適應(yīng)性進(jìn)化的良好素材,而其適應(yīng)高鹽堿環(huán)境的機(jī)制也成為了國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點[3]。青海湖裸鯉的擴(kuò)張基因主要富集于離子轉(zhuǎn)運相關(guān)通路中[4],推測可能是其對青海湖高鹽環(huán)境長期適應(yīng)的結(jié)果。

苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸(FXYD)家族是一類小分子跨膜蛋白,不僅是鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)的組成部分[5],也是鈉鉀ATP酶活性調(diào)控的重要因子之一,參與維持細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)滲透壓平衡和調(diào)控細(xì)胞體積等生物學(xué)功能。已有研究表明,FXYD基因家族通過調(diào)節(jié)離子通道和水通道活性響應(yīng)滲透壓變化,廣泛參與了魚類鹽度的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。FXYD基因包含6～9個外顯子,編碼60～160個氨基酸,其中在脊椎動物中高度保守的FXYD基序位于胞質(zhì)外[6]。青海湖裸鯉FXYD基因家族有12個家族成員(FXYD1～ FXYD12),在多種組織中表達(dá)并對組織的生理功能起到積極作用,如維持腎的鈉離子重吸收[7]、肌肉收縮和神經(jīng)元興奮性[8]。在該家族成員中,FXYD8～FXYD12基因被認(rèn)為是魚類特有的FXYD基因家族成員,例如在大西洋鮭(Salmosalar)中發(fā)現(xiàn)有8個FXYD基因成員,包括FXYD2、FXYD5～FXYD9、FXYD11和FXYD12基因,而斑馬魚(Daniorerio)包含了FXYD1、FXYD2、FXYD3、FXYD5～FXYD7、FXYD11和FXYD12基因共8個成員[9-11]。

在多種魚類中的研究已證明,FXYD1、FXYD2、FXYD4、FXYD7、FXYD10～FXYD12等在結(jié)構(gòu)和功能上與鈉鉀ATP酶相互作用使得機(jī)體離子濃度發(fā)生變化,從而引起一系列的生理變化[12-15]。在咸水環(huán)境中,大西洋鮭、綠河鲀(Tetraodonnigroviridis)等魚類鰓組織的FXYD基因被激活,與淡水環(huán)境相比其轉(zhuǎn)錄水平顯著提高;同時,在進(jìn)行鹽度處理時發(fā)現(xiàn),斑馬魚(Daniorerio)、鰻鱺(Anguillajaponica)鰓和皮膚組織中的FXYD11基因以及青鳉(Oryziaslatipes)腎臟組織中FXYD12基因的轉(zhuǎn)錄水平也有明顯的提高[12,15-16]。另有研究表明,FXYD1可調(diào)節(jié)水通道蛋白(AQP2)在腎臟組織中的功能,進(jìn)而影響對水的重吸收[17]。綜上所述,FXYD基因家族作為鈉鉀ATP酶基因表達(dá)和調(diào)控因子,在魚類鹽度適應(yīng)和鹽度變化響應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。

筆者基于實驗室組裝的青海湖裸鯉基因組數(shù)據(jù),對青海湖裸鯉FXYD基因家族成員進(jìn)行鑒定,通過與斑馬魚等物種FXYD基因家族成員的序列比對及共線性分析,揭示其分類與基因加倍事件,同時,利用不同鹽度條件下青海湖裸鯉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探討FXYD基因家族在青海湖裸鯉鹽度適應(yīng)中的潛在功能。

1 材料與方法

1.1 青海湖裸鯉 FXYD 基因家族成員鑒定

基于PacBio和Hi-C測序得到青海湖裸鯉基因組為2.03 Gb,掛載到46條染色體,scaffold N50達(dá)到44.93 Mb,contig N50達(dá)到386.94 kb。染色體數(shù)目與已報道的青海湖裸鯉核型分析結(jié)果[18-19]一致。根據(jù)序列的同源性和功能結(jié)構(gòu)域的保守性共同鑒定青海湖裸鯉FXYD基因家族成員。通過Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)獲得FXYD保守域HMM模型(PF03106),利用HMMER 3.0在青海湖裸鯉蛋白序列中搜索包含有FXYD保守域HMM模型的候選序列(cutoff為E值<10-5)。在Pfam數(shù)據(jù)庫和CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)中對鑒定得到的候選蛋白序列進(jìn)行手動分析,確保候選基因含有FXYD保守結(jié)構(gòu)域。利用驗證后的青海湖裸鯉候選蛋白,使用Hmmscan軟件,構(gòu)建青海湖裸鯉FXYD的隱馬爾科夫模型(HMM),在基因組水平進(jìn)行搜索,以確定其包含F(xiàn)XYD的保守結(jié)構(gòu)域。同時,利用Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)獲得斑馬魚FXYD蛋白質(zhì)序列,以斑馬魚FXYD氨基酸序列為檢索序列(query),采用BLASTP的比對方法通過比對獲得青海湖裸鯉FXYD家族成員(cutoff為E值<10-5),并進(jìn)行手動驗證。使用ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器(https://web.expasy.org/protparam/)和scansite (https://scansite4.mit.edu)計算gpFXYD家族成員的分子質(zhì)量、等電點等信息,并預(yù)測磷酸化位點。

1.2 青海湖裸鯉FXYD基因家族成員蛋白質(zhì)序列分析及染色體定位

利用mafft軟件對已獲取的青海湖裸鯉FXYD蛋白序列和Ensembl數(shù)據(jù)庫中斑馬魚、鯽(Carassiusauratus)、哲羅鮭(Huchotaimen)、金線鲃(Sinocyclocheilusgrahami)、鯉(Cyprinuscarpio)、花斑劍尾魚(Xiphophorusmaculatus)等6種硬骨魚類的FXYD蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對,并使用 RAxML 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)實驗室測序獲得的青海湖裸鯉基因組注釋文件中獲取的FXYD基因家族所在染色體位置信息,對FXYD基因家族成員在染色體分布進(jìn)行可視化分析,通過MapChart軟件繪制FXYD家族在染色體上的定位分布圖。利用MEME 4.12.0(http://meme-suite.org/tools/meme)在線程序,對所鑒定青海湖裸鯉FXYD蛋白氨基酸序列中保守基序進(jìn)行預(yù)測分析,參數(shù)設(shè)置如下:結(jié)構(gòu)區(qū)塊最大值設(shè)為5,寬度最小值設(shè)為6,最大值設(shè)為10,并利用SMART在線工具預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域(http://smart.embl-heidelberg.de)。

1.3 青海湖裸鯉FXYD共線性及進(jìn)化分析

通過BLASTALL方法,以青海湖裸鯉氨基酸序列為檢索序列,分別與青海湖裸鯉和斑馬魚進(jìn)行比對。為分析青海湖裸鯉中FXYD基因是否經(jīng)過基因復(fù)制以及復(fù)制方式,利用McscanX軟件進(jìn)行青海湖裸鯉自共線性分析以及青海湖裸鯉基因組與斑馬魚基因組之間的共線性分析,并利用KaKs Calculator軟件[20-21]計算基因?qū)χg的非同義突變率、同義突變率和進(jìn)化選擇壓力值。

1.4 青海湖裸鯉FXYD基因結(jié)構(gòu)分析

從青海湖裸鯉基因組中下載每個預(yù)測基因?qū)?yīng)的DNA和cDNA序列,使用基于網(wǎng)絡(luò)的方法分析內(nèi)含子等分布模式和拼接階段生物信息學(xué)工具GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析[22]。

1.5 試驗材料以及處理

試驗對象為野生青海湖裸鯉實驗室繁育F1代。試驗前期完成了青海湖裸鯉在不同鹽度條件下的轉(zhuǎn)錄組測序,方法為:將體長、體質(zhì)量接近的8月齡的青海湖裸鯉飼養(yǎng)于相同條件下 2 周,隨后隨機(jī)分為2組,其中對照組鹽度為 13,與青海湖鹽度一致;試驗組為淡水條件,鹽度為 0.1;處理 96 h 后,試驗組和對照組各3個平行,對青海湖裸鯉的鰓、腎組織進(jìn)行采樣,保存于液氮,用于 RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測序。

1.6 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析青海湖裸鯉FXYD基因表達(dá)模式

利用實驗室產(chǎn)生的青海湖裸鯉轉(zhuǎn)錄組(心臟、肝胰臟、腦組織、腎臟、鰓、骨骼肌、腸道、精巢和卵巢組織)數(shù)據(jù),以及實驗室產(chǎn)生的不同鹽度處理的鰓組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(表1),獲得青海湖裸鯉FXYD基因家族成員的基因表達(dá)量每1 000 000單位比對片段中,比對到目的基因1000堿基單位的片段數(shù)(FPKM),利用R語言Pheatmap包對表達(dá)量進(jìn)行可視化,探討FXYD基因家族成員的組織表達(dá)規(guī)律和在不同鹽度條件下的表達(dá)情況。

表1 試驗使用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

2 結(jié)果與分析

2.1 青海湖裸鯉FXYD基因家族成員的鑒定

利用FXYD結(jié)構(gòu)域作為檢索序列在青海湖裸鯉本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對搜索,結(jié)合青海湖裸鯉基因組數(shù)據(jù)庫注釋信息,共獲得16個青海湖裸鯉FXYD(gpFXYD)基因?；谇嗪：沲幣c斑馬魚、鯽、哲羅鮭、金線鲃、鯉、花斑劍尾魚、大西洋鮭FXYD的氨基酸序列(表2)構(gòu)建了最大似然樹(圖1),結(jié)果顯示,青海湖裸鯉包含5個FXYDs亞型,即gpFXYD1、gpFXYD5、gpFXYD6、gpFXYD7和gpFXYD11,且每個成員中均存在多個同源基因,并據(jù)此對gpFXYD基因進(jìn)行了命名,即:gpFXYD11a、gpFXYD11b、gpFXYD11c、gpFXYD1a、gpFXYD1b、gpFXYD1c、gpFXYD5a、gpFXYD5b、gpFXYD5c、gpFXYD5d、gpFXYD5e、gpFXYD6a、gpFXYD6b、gpFXYD6c、gpFXYD7a、gpFXYD7b。對gpFXYD基因在青海湖裸鯉染色體上進(jìn)行定位,可以看出gpFXYD基因主要分布于青海湖裸鯉5條染色體中(圖2)。其中g(shù)pFXYD5a、gpFXYD5c和gpFXYD11c分布在7號染色體,gpFXYD5b和gpFXYD5d分布在8號染色體,gpFXYD5e分布在10號染色體,gpFXYD1a、gpFXYD1b、gpFXYD6a、gpFXYD7a和gpFXYD11a分布在29號染色體,gpFXYD1c、gpFXYD6b、gpFXYD6c、gpFXYD7b和gpFXYD11b分布在30號染色體,第29和30號染色體上分布最多。利用Scansite(https://scansite4.mit.edu)Calculate Amino Acid Composition工具對gpFXYD蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點和疏水性等理化參數(shù)進(jìn)行分析。16個gpFXYD蛋白分子中氨基酸為42～343個,平均139個;分子質(zhì)量為4563.91～38 777.88 u,平均15 495.23 u;理論等電點3.89～9.78(表3)。多重序列比對結(jié)果顯示,所有g(shù)pFXYD均具有FXYD結(jié)構(gòu)域或FXYD樣結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖1 青海湖裸鯉與其他魚類FXYD 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of gpFXYD gene family of G. przewalskii ssp. przewalskii and other fishes

圖3 青海湖裸鯉FXYDs結(jié)構(gòu)域的多序列比對Fig.3 Multi-sequence alignment of the prediction phosphorylation site domain of FXYD gene family in G. przewalskii ssp. przewalskii

表2 本試驗使用的FXYD蛋白序列

表3 青海湖裸鯉FXYD基因家族理化性質(zhì)

2.2 青海湖裸鯉 FXYD 基因家族成員基因結(jié)構(gòu)、保守基序和功能結(jié)構(gòu)域分析

使用GSGD軟件對gpFXYD家族基因每個成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析,結(jié)果顯示,除gpFXYD 7亞型片段較短,其他亞型的 gpFXYDs 基因具有相似的序列結(jié)構(gòu),且內(nèi)含子與外顯子數(shù)目以及每個外顯子的長度也較為接近,都含有5個以上外顯子(EXON)區(qū),其中g(shù)pFXYD5以及gpFXYD1亞型含有較長的非編碼區(qū)(圖4a)。保守基序分析顯示gpFXYD家族共包含10種蛋白質(zhì)基序(motif)(表4),每個亞型的成員具有相同或類似的motif和排列順序(圖4b)。其中,gpFXYD1均包含motif1和motif10,gpFXYD5包含motif1、motif2和motif4,gpFXYYD6包含motif1、motif3、motif9,gpFXYD7和gpFXYD11都包含motif1,這表明相同亞型的gpFXYD成員具有相似的motif組成。雖然不同亞型基因的motif組成不同,但它們都具有重要的活性位點motif1,且共有的 motif 以基本相同的順序排列。Motif在不同亞型中的分布也有所不同,如motif4和motif7在gpFXYD1是分布于motif1之后,而在gpFXYD1和gpFXYD6均分布于motif1之前。功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),所有的gpFXYDs成員都具有FXYD結(jié)構(gòu)域和N-肉豆蔻酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(NMT),在gpFXYD5、gpFXYD6、gpFXYD7中分布有酪蛋白激酶II(CK-2)磷酸化結(jié)構(gòu)域(CK2_PHOSPHO_SITE)、N-糖基化結(jié)構(gòu)域(ASN_GLYCOSYLATION)、蛋白激酶C磷酸化結(jié)構(gòu)域(PKC_PHOSPHO_SITE)。而gpFXYD1家族還含有cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化結(jié)構(gòu)域(CAMP_PHOSPHO_SITE)(表4)。

圖4 青海湖裸鯉gpFXYD基因結(jié)構(gòu)和氨基酸保守基序分析Fig.4 gpFXYD gene structure and conserved amino acid motif analysis in G. przewalskii ssp. przewalskii

表4 青海湖裸鯉gpFXYDs結(jié)構(gòu)域分布

2.3 青海湖裸鯉FXYD共線性分析

利用MCScanX軟件對gpFXYDs進(jìn)行了共線性分析,結(jié)果顯示,在16個gpFXYD基因中有12個基因與斑馬魚的6個基因存在共線性關(guān)系。其中,位于青海湖裸鯉7號和8號染色體的gpFXYD5a/gpFXYD5b以及gpFXYD5c/gpFXYD5d與斑馬魚15號染色體的FXYD5呈現(xiàn)共線性。位于29號和30號染色體的gpFXYD6a/gpFXYD6b、gpFXYD11a/gpFXYD11b、gpFXYD7a/gpFXYD7b、gp-FXYD1b/gpFXYD1c分別與斑馬魚16號染色體的FXYD1、FXYD6、FXYD7和FXYD11呈共線性關(guān)系(圖5)。青海湖裸鯉自共線性分析顯示,gpFXYD6a/gpFXYD6b和gpFXYD11a/gpFXYD11b呈共線性關(guān)系,共線性分析表明全基因組復(fù)制事件引起了gpFXYD基因加倍。通過各個基因?qū)Ψ峭x突變率(Ka)、同義突變率(Ks)以及進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks),可以估算進(jìn)化選擇模式。進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks)>1表示正選擇,進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks)<1表示純化選擇,進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks)=1表示中性選擇。分析顯示,gpFXYD6a/gpFXYD6b、gpFXYD5a/gpFXYD5b、gpFXYD7a/gpFXYD7b以及gpFXYD11a/gpFXYD11b的進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks)< 1,表明它們都經(jīng)過了純化選擇(表5)。 gpFXYD1c/ gpFXYD1b以及gpFXYD5c/gpFXYD5d的進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks)> 1,表明gpFXYD1c和gpFXYD5c受到了正選擇。

圖5 青海湖裸鯉和斑馬魚FXYD 基因的共線關(guān)系Fig. 5 Syntenic analysis of FXYD genes in G. przewalskii ssp. przewalskii and Zebrafish D.rerio

表5 青海湖裸鯉 FXYD 復(fù)制基因?qū)Φ倪M(jìn)化選擇壓力值

2.4 青海湖裸鯉 FXYD基因表達(dá)模式分析

gpFXYD基因在青海湖裸鯉心臟、肝胰臟、腦組織、腎臟、鰓、骨骼肌、腸道、精巢和卵巢等不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示,gpFXYD同一亞型成員間的表達(dá)模式相似且具有組織特異性(圖6a)。其中,gpFXYD1基因在心臟的表達(dá)高于其他組織,在腦、鰓、肝胰臟和骨骼肌中表達(dá)量相似,在腎臟和性腺組織中表達(dá)量最低。gpFXYD5亞型在腎臟中的表達(dá)量最高,除了gpFXYD5e基因在精巢組織中表達(dá)較高,其他gpFXYD5成員在性腺中的表達(dá)量均較低。同時發(fā)現(xiàn),gpFXYD5a和gpFXYD5b基因以及gpFXYD5c和gpFXYD5d基因具有更為相似的表達(dá)模式,即gpFXYD5a和gpFXYD5b基因在心臟中的表達(dá)量高于肌肉和肝胰臟組織,而gpFXYD5c和gpFXYD5d基因則與之相反。肌肉組織中g(shù)pFXYD6基因的表達(dá)量整體顯著高表達(dá),其次是腦組織和精巢的表達(dá),在其他組織中g(shù)pFXYD6基因的表達(dá)量均較其他家族成員表達(dá)量低。gpFXYD7亞型中,gpFXYD7a基因在腦組織中的表達(dá)量最高,其他組織表達(dá)水平相似,未在轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)gpFXYD7b基因的表達(dá),這種現(xiàn)象極有可能是同源基因?qū)χ衅渲幸粋€基因發(fā)生了非功能化。gpFXYD11亞型在鰓組織的表達(dá)較高,gpFXYD11b基因在腸道和卵巢組織中表達(dá)較高,gpFXYD11a基因腎臟組織中表達(dá)較高。據(jù)此推測不同亞型可能在不同組織中發(fā)揮作用,同一亞型不同基因拷貝轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異可能與基因加倍后的新功能化和功能分化有關(guān)。

圖6 青海湖裸鯉FXYD基因家族表達(dá)圖譜 Fig. 6 Expression profiles of FXYD genes in G.przewalskii ssp. przewalskii

青海湖裸鯉gpFXYD基因在淡水和咸水條件下鰓和腎臟組織中的表達(dá)存在差異。gpFXYD基因各亞型在鰓、腎臟組織中的表達(dá)具有明顯的組織特異性,且表達(dá)水平在淡水組和咸水組之間差異較大(圖6b)。在鰓組織中,gpFXYD5a、gpFXYD6a和gpFXYD6b基因在咸水組中的表達(dá)顯著上調(diào)。腎臟組織中,gpFXYD6a基因在淡水組中的表達(dá)量較高,而gpFXYD11b、gpFXYD5d和gpFXYD6b基因在咸水組中表達(dá)上調(diào)。

3 討 論

3.1 青海湖裸鯉FXYD 基因家族進(jìn)化

青海湖裸鯉是生活在青海湖中唯一的鯉科魚類,對高鹽堿水環(huán)境有良好的適應(yīng)性,而維持青海湖裸鯉的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境之間離子梯度是保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和組織正常功能的首要條件。FXYD基因家族是一類小分子跨膜蛋白,其與鈉鉀 ATP 酶相互作用可以調(diào)控鈉鉀ATP酶的表達(dá)與活性,被認(rèn)為是重要的離子調(diào)節(jié)因子,在生物響應(yīng)鹽度脅迫和適應(yīng)鹽度變化中具有重要作用[16,23-24]。

筆者利用青海湖裸鯉基因組數(shù)據(jù)鑒定了16個完整的FXYD基因, 且每個gpFXYD基因中均包含了起始密碼子和終止密碼子,暗示其均可能具有翻譯能力,而非假基因?；诘鞍踪|(zhì)序列分析,gpFXYD成員具有完整的FXYD蛋白結(jié)構(gòu)域,目前已發(fā)現(xiàn)的FXYD在N端均包含1個由6個氨基酸序列組成的保守序列由保守的苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸以及跨膜區(qū)的兩個保守的甘氨酸組成,C端(-COOH)和N端(-NH2)的氨基酸序列可變。

因為魚類的基因變化更頻繁,在一些情況下,它們的基因比其他脊椎動物有更多的亞型[25],且由于膜外序列的保守性有限,筆者主要比對了青海湖裸鯉和其他硬骨魚類的系統(tǒng)發(fā)育情況,并對每個家族的亞型進(jìn)行命名。結(jié)果顯示,gpFXYD不僅具有FXYD特征序列且具有保守的甘氨酸以及亮氨酸殘基,同時,磷酸化的絲氨酸存在于所有的gpFXYD中[26]。有研究表明,磷酸化是FXYD與鈉鉀ATP酶相互作用的主要調(diào)控機(jī)制[27-31],本研究結(jié)果顯示,gpFXYD每個亞家族具有幾乎相同的預(yù)測磷酸化位點以及蛋白結(jié)構(gòu)域,說明青海湖裸鯉與其他硬骨魚成員[斑馬魚、青鳉和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)]的FXYD家族同源[11,32],且氨基酸序列具有較高相似性,表明了其結(jié)構(gòu)和功能的相似性。已有的研究表明,1個和2個絲氨酸殘基的磷酸化會產(chǎn)生不同的效果[33],而磷酸化位點的存在表明可能通過磷酸化調(diào)控其功能。本研究結(jié)果顯示,青海湖裸鯉每個FXYD家族成員的絲氨酸個數(shù)不一樣,說明每個家族成員可能存在不同的磷酸化調(diào)控機(jī)制。

3.2 青海湖裸鯉FXYD基因家族分析

全基因組復(fù)制是進(jìn)化的主要驅(qū)動力之一,也是產(chǎn)生新基因的來源[34]。硬骨魚類不同系譜在其長期的進(jìn)化過程中經(jīng)歷了2～6輪數(shù)目不等的大規(guī)?；蚪M復(fù)制事件,硬骨魚類的全基因組復(fù)制事件和鯉科魚類特有的全基因組復(fù)制事件與該類群物種輻射適應(yīng)以及對環(huán)境有較高適應(yīng)性密切相關(guān)[35-38]。為探討gpFXYD基因復(fù)制與復(fù)制方式,筆者選取斑馬魚的FXYD基因與gpFXYD基因進(jìn)行共線性分析。與斑馬魚相比,gpFXYD基因家族中g(shù)pFXYD1、gpFXYD5、gpFXYD6、gpFXYD7和gp-FXYD11都發(fā)生了加倍[34]。在16個gpFXYD基因中有12個基因與斑馬魚的6個基因存在共線性關(guān)系,表明他們起源于全基因組復(fù)制事件,由于青海湖裸鯉為四倍體(4n=92),斑馬魚為二倍體(2n=50),因此,大部分青海湖裸鯉與斑馬魚基因數(shù)目為2∶1關(guān)系。多倍體生物由于基因組的復(fù)制,使得同源基因擁有更多向不同功能分化的潛能,在青海湖裸鯉中,gpFXYD6a/gpFXYD6b、gpFXYD5a/gpFXYD5b、gpFXYD7a/gpFXYD7b以及gpFXYD11a/gpFXYD11b的進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks)<1,同時gpFXYD6a/gpFXYD6b和gpFXYD11a/gpFXYD11b呈自共線性關(guān)系,一般認(rèn)為純化選擇通常使得基因功能更保守。gpFXYD1c/ gpFXYD1b以及gpFXYD5c/gpFXYD5d進(jìn)化選擇壓力值(Ka/Ks)>1,表明gpFXYD1c和gpFXYD5c受到了正選擇,其變異可能與青海湖裸鯉適應(yīng)青海湖高鹽堿水環(huán)境相關(guān),從而保證青海湖裸鯉能更好地適應(yīng)鹽度的變化,推測這些基因可能是在復(fù)制過程中獲得了新功能[34,39-41]。

3.3 青海湖裸鯉FXYD基因的組織表達(dá)和功能分析

本研究結(jié)果豐富了青海湖裸鯉gpFXYD基因家族的信息,不僅為研究青海湖裸鯉鹽度適應(yīng)機(jī)制提供了參考,同時也為研究耐鹽魚類品種提供了素材。

4 結(jié) 論

(1)青海湖裸鯉中有16個gpFXYD基因,分為5種亞型,分別是gpFXYD1(3個)、gpFXYD5(5個)、gpFXYD6(3個)、gpFXYD7(2個)、gpFXYD11(3個),基因家族成員具有相似的motif分布和基因結(jié)構(gòu)。

(2)gpFXYD基因的5個亞家族都發(fā)生了擴(kuò)張,gpFXYD6a/gpFXYD6b、gpFXYD5a/gpFXYD5b、gpFXYD7a/gpFXYD7b以及gpFXYD11a/gpFXYD11b共4對復(fù)制基因發(fā)生了純化選擇;gpFXYD1c/gpFXYD1b以及gpFXYD5c/gpFXYD5d這2對復(fù)制基因發(fā)生了正選擇。

(3)gpFXYD基因家族中,gpFXYD7基因在青海湖裸鯉腦組織中特異性表達(dá),gpFXYD1、gpFXYD6基因主要在青海湖裸鯉骨骼肌中表達(dá),gpFXYD5基因主要在青海湖裸鯉腎組織中表達(dá),而gpFXYD11基因主要在青海湖裸鯉鰓和腎臟組織中特異表達(dá)。這表明gpFXYD基因家族的亞型具有相似的表達(dá)模式且顯現(xiàn)出不同的組織表達(dá)特異性。

(4)在高鹽條件下,gpFXYD5、gpFXYD6以及gpFXYD11基因在青海湖裸鯉腎臟和鰓組織中出現(xiàn)顯著的表達(dá)變化。相比淡水條件,咸水條件下,gpFXYD5a、gpFXYD6a和gpFXYD6b基因在鰓組織中表達(dá)較高,gpFXYD5d、gpFXYD6b和gpFXYD11b基因在腎臟組織中表達(dá)量較高。而淡水條件下,gpFXYD5c和gpFXYD6a基因在腎臟組織中被激活,表明gpFXYD5、gpFXYD6以及gpFXYD11基因可能與青海湖裸鯉在高鹽度條件下的離子運輸和滲透壓調(diào)節(jié)密切相關(guān)。