王路平,唐永濤,汪 晨,唐伯平,成永旭

( 1.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室,上海 201306;2.鹽城師范學院 濕地學院,江蘇省鹽土生物資源研究重點實驗室,江蘇 鹽城 224002 )

中國許多城市河道與湖泊都面臨水體氮、磷超標問題[1-2]。剛毛藻(Cladophora)屬綠藻綱剛毛藻科,對外界環(huán)境耐受程度大,具有很強的適應能力,使其在復雜的污水環(huán)境中生長成為可能,剛毛藻分布廣泛,作為凈水植物便于就地取材,避免了物種引入造成的生物入侵問題[3-4]。此外,剛毛藻具有快速繁殖和易于回收的特點,具有人為可控性,利用剛毛藻去除污水中的氮、磷具有經(jīng)濟環(huán)保和可控性強的優(yōu)勢[5]。因此,在目前大型凈水絲狀藻類中,剛毛藻是理想的凈水物種之一[6]。但在蝦、蟹養(yǎng)殖過程中,剛毛藻大量繁殖不僅會占據(jù)水體空間、遮擋光照,影響水草、微藻的生長,纏繞蝦蟹,而且老化腐爛后會引起水質(zhì)惡化、溶解氧下降等問題,引起蝦、蟹死亡[7-9]。

氮、磷對剛毛藻的生長至關重要[10],尤其是氮[11]。馬沛明[12]通過試驗證明,剛毛藻優(yōu)先利用氨氮。本試驗中,筆者選擇氨氮作為氮源來研究不同環(huán)境因子對剛毛藻吸收氮的影響,以期通過調(diào)控環(huán)境因子來控制剛毛藻吸收氮,進而為人為調(diào)控剛毛藻生物量提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種采集與鑒定

試驗用藻種采自上海海洋大學崇明基地河蟹塘。將采回的新鮮藻體除雜、反復清洗,置于光照培養(yǎng)箱中用純水暫養(yǎng)。用顯微鏡觀察法和分子方法(ITS-9F5′-CCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGGGTGTG-3′;ITS-7R5′-TCCCTTTTCGCTCGCCGTTACTA-3′)[13]進行種類鑒定。

1.2 試驗儀器與測定方法

1.2.1 試驗儀器

MGZ-120L-3三溫區(qū)光照培養(yǎng)箱(上海丙林電子科技有限公司)、紫外分光光度計(北京普析通用T6新世紀)、顯微鏡(奧林巴斯CX33)等。

1.2.2 測定方法

氨氮的測定采用納氏試劑分光光度法[14];谷氨酰胺合成酶活性、超氧化物歧化酶活性、總抗氧化能力的測定均采用南京建成科技有限公司試劑盒進行。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗時間程和氨氮濃度選擇

為確定合理的取樣時間和處理濃度,采取多氨氮濃度梯度及多時間點取樣法。將暫養(yǎng)的剛毛藻置于裝有無氮BG11培養(yǎng)基(用氯化鐵代替檸檬酸鐵銨,排除銨根離子的影響)的塑料培養(yǎng)箱中,然后氮饑餓培養(yǎng)48 h。選擇氯化銨作為氮源,在磷濃度為10 μmol/L條件下,根據(jù)預試驗結(jié)果,設置6個氨氮濃度組:20、40、80、120、180 μmol/L和300 μmol/L ,培養(yǎng)液體積為1 L,對照組不放藻,每組3個平行。用吸水紙將剛毛藻表面水分吸干,稱取1.0 g放入燒杯中,及時用玻璃棒將其攪拌分散,使其均勻分布在燒杯中,然后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度25 ℃、pH 8、光照度4500 lx)。在放入藻后的0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、5.0、7.0 h分別取水樣5 mL,用分光光度法測定水樣中氨氮濃度,并計算氨氮的吸收速率。

1.3.2 正交試驗

如上所述,對清洗的剛毛藻進行氮饑餓48 h。在剛毛藻穩(wěn)定吸收氨氮的時間程和濃度下,選擇溫度、pH、光照度3個環(huán)境因子,按照表1進行正交試驗設計。溫度、光照度通過光照培養(yǎng)箱進行調(diào)節(jié),pH通過0.10 μmol/L的氫氧化鈉和鹽酸進行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)液體積和剛毛藻的添加量與上述試驗相同,過程中不曝氣。在0 h和1.5 h取水樣測定氨氮含量,計算剛毛藻在0～1.5 h時的氨氮吸收速率。在1.5 h時采集剛毛藻樣品,測定藻體的谷氨酰胺合成酶活性、超氧化物歧化酶活性、總抗氧化能力。

表1 正交試驗設計[L9(33)正交表]

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

剛毛藻對氨氮的吸收速率計算公式如下:

v=[(c1-c2)V]/(m·t)

式中,v為吸收速率[μmol/(g·h)],c1為前一次取樣濃度(μmol/L),c2為后一次取樣濃度(μmol/L),V為前一次取樣時培養(yǎng)液的體積(L),m為剛毛藻的濕質(zhì)量(g),t為兩次取樣的時間間隔(h)。

用Excel計算每組試驗的平均值和標準誤差,用SPSS 19.0對氨氮的吸收速率和谷氨酰胺合成酶活性進行單因素方差分析。對正交試驗結(jié)果進行多因素方差分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 剛毛藻種類鑒定

通過顯微觀察、圖譜比對,發(fā)現(xiàn)該試驗用藻類為長筒形[(22～28) μm×(83～272) μm],具分支,葉綠體網(wǎng)狀貼壁,淀粉核、細胞核多個,其與剛毛藻屬物種相似性最高。將PCR擴增獲得的核糖體ITS序列提交到GeneBank中進行檢索,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與剛毛藻(Cladophorasp.)ZZ-2016(系列號KU186059.1)的相似性高達98.89%,基于此鑒定其為綠藻門剛毛藻屬物種。

2.2 氨氮線性吸收時間程和適宜濃度

培養(yǎng)介質(zhì)中氨氮濃度整體上不斷下降(圖1a)。在0.5～1.5 h時,培養(yǎng)介質(zhì)中氨氮濃度快速下降,而在1.5～7.0 h時,剛毛藻對氨氮的吸收速率逐漸減慢。對比不同濃度組,在氨氮初始濃度為80 μmol/L、0.5～1.5 h時間程內(nèi),剛毛藻對氨氮吸收呈線性關系(r2>0.99)。不同氨氮濃度組吸收速率隨時間變化的曲線見圖1b,在氨氮初始濃度為80 μmol/L、時間程為0.5～1.5 h時,0.5～1.0 h和1.0～1.5 h時間程的吸收速率均約為45.10 μmol/(g·h),吸收速率基本相等。另外,由圖1b可見,在0～0.5 h時,剛毛藻對氨氮的吸收速率較小。從整體上看,剛毛藻對氨氮的吸收速率呈現(xiàn)波動式變化。

圖1 剛毛藻對氨氮的吸收Fig. 1 Absorption of ammonia nitrogen by Cladophora

2.3 正交試驗

2.3.1 氨氮的吸收速率

根據(jù)上述試驗結(jié)果,選擇氨氮初始濃度為80 μmol/L的培養(yǎng)介質(zhì)進行正交試驗,采樣時間在1.5 h。各試驗組中剛毛藻對氨氮的吸收速率見圖2a,其中N5組剛毛藻對氨氮的吸收速率最高,而N8組的吸收速率最低。多因素方差分析結(jié)果(表2)顯示,溫度對剛毛藻吸收氨氮的速率有顯著影響(P<0.05),而pH和光照強度則無顯著影響(P>0.05),3個因子的F值大小排序為:溫度> pH>光照度。

圖2 不同試驗組剛毛藻氨氮吸收速率及對應的谷氨酰胺合成酶活性Fig. 2 The absorption rate of NH4+-N of Cladophora and corresponding GS activity in different experimental groups

表2 多因素方差分析(吸收速率)

2.3.2 酶活性

N5組的谷氨酰胺合成酶活性最高,而N8組的谷氨酰胺合成酶活性最低(圖2b)。另外,除N3組谷氨酰胺合成酶活性略低,谷氨酰胺合成酶曲線與氨氮吸收速率曲線整體走勢相似。對谷氨酰胺合成酶活性與氨氮吸收速率進行皮爾遜相關分析發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺合成酶活性與氨氮吸收速率呈極顯著正相關(P=0.001<0.01,r=0.898)。不同組超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力結(jié)果檢測表明,兩組曲線整體上走勢相似,最低值均出現(xiàn)在N5組,而超氧化物歧化酶活性最高值出現(xiàn)在N7組,總抗氧化能力最高值出現(xiàn)在N8組(圖3)。分別對超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力與氨氮吸收速率進行皮爾遜相關分析發(fā)現(xiàn),超氧化物歧化酶活性與氨氮吸收速率雖然呈負相關關系,但不呈顯著負相關(P=0.108>0.05,r=-0.572),而總抗氧化能力與氨氮吸收速率則呈顯著負相關(P=0.029<0.05,r=-0.719)。

圖3 不同試驗組的總超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力Fig. 3 The total SOD activity and T-AOC in different experimental groups

3 討 論

3.1 試驗時間程和氨氮濃度選擇

在研究環(huán)境因子如何影響藻類吸收營養(yǎng)時,確定適宜的取樣時間和濃度對準確獲取試驗結(jié)果至關重要。在本試驗中,初步確定時間程為0.5～1.5 h、氨氮濃度為80 μmol/L時,剛毛藻吸收氨氮效果較好。目前,有關淡水剛毛藻對氨氮穩(wěn)定吸收的時間程和適宜濃度尚未見報道,李儉平[15]曾研究了滸苔(Enteromorphaprolifera)對氨氮的吸收動力學,指出滸苔在0～1.5 h時呈線性吸收。本試驗中,剛毛藻在0～0.5 h時對氨氮的吸收速率處于較低水平,而在0.5～1.5 h時則呈現(xiàn)較高的線性吸收水平。筆者推測,0～0.5 h時間程可能是剛毛藻吸收氮有關酶的反應時間。本試驗中,初步確定剛毛藻在0.5～1.5 h時間程內(nèi)對氨氮呈線性吸收,且氨氮濃度為80 μmol/L時剛毛藻吸收氮效果較好。曹學彬等[16]對剛毛藻吸收營養(yǎng)鹽的研究也發(fā)現(xiàn),放入剛毛藻后,環(huán)境中的營養(yǎng)鹽濃度不會立即降低,其初入新環(huán)境需要適應生長時間。方焰星等[17]研究了水生植物的除氮效果,發(fā)現(xiàn)金魚藻(Ceratophyllumdemersum)、眼子菜(Potamogetondistinctus)等對氨氮去除效果較好,效率約為8.0 μg/(g?L?h)。陳巧玲等[18]研究發(fā)現(xiàn),挺水植物水生美人蕉(Cannaglauca)對氨氮的吸收效率約為0.13 μg/(g?L?h)。本試驗中,添加剛毛藻后7 h內(nèi)溶液中氨氮的濃度從80 μmol/L降至0 μmol/L,對氨氮的吸收效率達到160 μg/(g?L?h),說明剛毛藻具有較強的吸收氮能力,是處理污水的理想物種之一。另外,也解釋了在自然水域中為何剛毛藻具有明顯的營養(yǎng)競爭優(yōu)勢。狄文亮等[19]研究也發(fā)現(xiàn),添加剛毛藻對表流濕地凈水能力有明顯提升,而且金魚藻受到了剛毛藻因營養(yǎng)鹽競爭而造成的脅迫影響。

3.2 不同環(huán)境因子交叉作用對剛毛藻吸收氮的影響

多因素方差分析的F值可用于比較不同環(huán)境因子的影響強弱[20]。在上述濃度梯度下,不同環(huán)境因子對剛毛藻氨氮吸收速率的影響強弱排序為:溫度>pH>光照度。胡帥龍等[21]也發(fā)現(xiàn),溫度對營養(yǎng)鹽的吸收有重要影響,在初始總磷質(zhì)量濃度低于2 mg/L、溫度為20～25 ℃時,剛毛藻的總磷去除率可高達93.66%。然而,上述結(jié)論不同于李儉平[15]有關環(huán)境因子對滸苔氨氮吸收速率的影響強弱排序(光照度>溫度>pH),原因可能是海水與淡水環(huán)境中不同剛毛藻種類之間存在差異。葉碧碧等[22]對剛毛藻氮、磷吸收研究發(fā)現(xiàn),20 ℃、光照度3000 lx更有利于氮、磷的吸收。試驗中發(fā)現(xiàn),N5組的氨氮吸收速率最高,即環(huán)境條件為:25 ℃、pH 9、光照度4500 lx。本試驗中的溫度和光照值與曾令昭[23]的研究結(jié)果相似。關于pH對氮吸收的影響,馬淑娟等[24]發(fā)現(xiàn),堿性環(huán)境更有利于剛毛藻脫氮除磷。周軍[25]發(fā)現(xiàn):pH 8是影響藻類膜去除污水中氮的臨界值;當pH<8時,對氨氮的去除效果有限;當pH>8時,對氨氮的去除效果明顯。這與本試驗結(jié)論相似,同時說明pH是影響藻類氮吸收的重要因素之一。

3.3 酶活性與氮吸收的關系

谷氨酰胺合成酶在高等植物氮代謝中至關重要,是氮代謝的關鍵酶。無機氮必須同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機氮才能為植物體所吸收和利用,而谷氨酰胺合成酶是這一氨同化過程的關鍵酶[26]。若無谷氨酰胺合成酶的調(diào)控或調(diào)控紊亂,則植物體氮代謝紊亂,進而影響植物的光合作用和生理代謝等方面[27]。顏昌宙等[28]研究了不同濃度氨氮對輪葉黑藻(Hydrillaverticillata)的生理影響,發(fā)現(xiàn)在高濃度氨氮條件下谷氨酰胺合成酶活性增加顯著。氨氮吸收速率與谷氨酰胺合成酶活性的這種明確的響應關系,內(nèi)在生理原因是氨氮在谷氨酰胺合成酶和腺苷三磷酸的參與下,與谷氨酸反應,生成谷氨酰胺,進而在其他酶的參與下再合成其他類型的氨基酸[29],也即谷氨酰胺合成酶是氨氮由無機氮轉(zhuǎn)化成可利用有機氮的第一種酶,也是必不可少的酶。本試驗中,谷氨酰胺合成酶活性與氨氮吸收速率的極顯著正相關關系證實了氨氮吸收速率與谷氨酰胺合成酶活性的響應關系,顯示了谷氨酰胺合成酶在剛毛藻吸收氮中起重要作用。另外,本試驗結(jié)果顯示,只有溫度對氨氮吸收速率有顯著影響,推測可能是因為相對于pH和光照度,谷氨酰胺合成酶對溫度更加敏感。

超氧化物歧化酶作為重要的抗氧化酶,是植物細胞的第一道抗氧化防線[16],具有清除活性氧自由基的功能。機體防御體系中總抗氧化能力的作用主要是維持內(nèi)環(huán)境活性氧的動態(tài)平衡,清除過高的活性氧,使機體處于氧化還原相對穩(wěn)定的狀態(tài),代表體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物的總體水平[30]。超氧化物歧化酶和總抗氧化能力均是自由基損傷和酶促、非酶促系統(tǒng)清除氧自由基、抗氧化的敏感指標[31]。不利的環(huán)境條件會引發(fā)藻體的抗逆反應,表現(xiàn)為抗逆性酶活性等升高,而升高的超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力指標則反映了機體受脅迫的程度。如果將不同環(huán)境因子下的剛毛藻超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力指標與剛毛藻氨氮的吸收速率進行相關性分析,則可以間接反映環(huán)境因子與剛毛藻吸收氮的關系。如上文所述,超氧化物歧化酶活性與氨氮吸收速率呈非顯著負相關,說明超氧化物歧化酶活性的升高能阻礙剛毛藻的氨氮吸收速率,但不是唯一途徑或起主導作用。本試驗中,最高活性超氧化物歧化酶組并沒有對應最低的氨氮吸收速率即證明了上述推論。但總抗氧化能力與氨氮吸收速率呈顯著負相關,說明總抗氧化能力的升高能顯著阻礙剛毛藻對氨氮的吸收。對比超氧化物歧化酶和總抗氧化能力可知,超氧化物歧化酶僅是抗逆性酶的一種,而總抗氧化能力代表體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物的總體水平,說明環(huán)境因子對剛毛藻氨氮吸收的影響不是僅通過某一種酶發(fā)揮作用,更可能是通過多種酶以及非酶類發(fā)揮影響作用。廖秀睿等[32]對曲褶剛毛藻(C.flexuosa)無機氮(氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮)去除的研究表明,同為小分子無機氮,曲褶剛毛藻對氨氮的去除效率最高,原因可能是由于剛毛藻對氨氮吸收存在酶或非酶等多種調(diào)控途徑,使得其具有較高的吸收率。

氮作為剛毛藻生長所需的重要營養(yǎng)鹽,與其生物量大小直接相關[33]。筆者確定了剛毛藻吸收氮的最佳環(huán)境因子組合,試驗結(jié)果為調(diào)控剛毛藻的生長或生物量提供了依據(jù),同時可為預測和抑制剛毛藻暴發(fā)和凈化污水提供參考。

4 結(jié) 論

在氨氮濃度為80 μmol/L、時間程為0.5～1.5 h時,剛毛藻對氨氮呈線性吸收(r2>0.99)。溫度對剛毛藻氨氮吸收有顯著影響(P<0.05),而光照度和pH無顯著影響(P>0.05)。上述3種環(huán)境因子對剛毛藻吸收氨氮的影響順序為:溫度>pH>光照度。剛毛藻對氨氮吸收的最佳3因子組合為:25 ℃、pH 9、光照度4500 lx。另外,谷氨酰胺合成酶活性與剛毛藻氨氮吸收速率呈極顯著相關(P<0.01),超氧化物歧化酶活性與氨氮吸收速率呈負相關 (r=-0.572),而總抗氧化能力與氨氮吸收速率呈顯著負相關(P=0.029<0.05,r=-0.719),說明環(huán)境因子通過多種酶以及非酶類影響剛毛藻吸收氮。