郭奎，張澤楠，王垚鑫，李帥杰，初曉雨，郭巍，胡哲，王曉鈞

基于單克隆抗體的非洲馬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用

郭奎，張澤楠，王垚鑫，李帥杰，初曉雨，郭巍，胡哲，王曉鈞

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，哈爾濱 150069

【目的】為有效應(yīng)對(duì)非洲馬瘟（African horse fever, AHS）傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)，研究建立一種基于單克隆抗體（Monoclonal antibody, Mab）的非洲馬瘟病毒（African horse fever virus, AHSV）特異性的間接ELISA（indirect ELISA, iELISA）抗體檢測方法，利用該方法對(duì)我國馬匹進(jìn)行非洲馬瘟抗體監(jiān)測。為有效診斷非洲馬瘟提供血清學(xué)檢測手段?！痉椒ā渴紫壤肁HSV VP7抗原免疫小鼠制備針對(duì)VP7抗原的單克隆抗體；其次通過對(duì)包被抗體濃度、蛋白濃度、血清稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度等反應(yīng)條件的優(yōu)化建立AHSV iELISA抗體檢測方法。利用1 000份血清確定該方法的臨界值，并評(píng)估該方法的敏感性和特異性。由3位試驗(yàn)操作者分別對(duì)AHSV 敏控陽性血清進(jìn)行加速試驗(yàn)測定效價(jià)，評(píng)估該方法的穩(wěn)定性。通過利用建立的方法對(duì)已知的10份AHSV陽性血清和400份陰性血清進(jìn)行檢測并與國外商品化試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較；最后用該方法對(duì)我國2021年18個(gè)省份或地區(qū)的947份臨床樣本進(jìn)行檢測來評(píng)估我國馬匹中AHSV感染風(fēng)險(xiǎn)?！窘Y(jié)果】獲得了5株針對(duì)AHSV VP7抗原的單克隆抗體。通過對(duì)5株單克隆抗體篩選確定3G9單克隆抗體捕獲抗原性能最佳。利用3G9抗體作為包被抗體，通過對(duì)不同反應(yīng)條件優(yōu)化建立了AHSV iELISA抗體檢測方法。確定該方法的臨界值為0.25；經(jīng)比對(duì)試驗(yàn)證實(shí)本研究建立的AHSV iELISA方法的敏感性與商品化試劑盒相當(dāng)。3位操作者分別對(duì)敏控血清進(jìn)行檢測，組內(nèi)變異系數(shù)范圍分別為3.19%—7.02%、0%—3.11%、0.27%—5.76%，組間變異系數(shù)為1.17%—5.03%。37 ℃加速試驗(yàn)表明AHSV陽性血清7 d內(nèi)效價(jià)穩(wěn)定，因此證明該方法具有良好的穩(wěn)定性。該方法與商品化試劑盒進(jìn)行比較兩者總體符合率為100%。通過對(duì)我國18個(gè)省或地區(qū)的947份馬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明AHSV抗體陽性率為0%?！窘Y(jié)論】成功篩選到了針對(duì)AHSV VP7的單克隆抗體，建立了一種基于單克隆抗體的AHSV iELISA抗體檢測方法，該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好，可以實(shí)現(xiàn)臨床樣本中AHSV抗體的檢測，因此可以作為AHS血清學(xué)監(jiān)測的一種有效工具。

非洲馬瘟病毒；單克隆抗體；間接ELISA；應(yīng)用

0 引言

【研究意義】非洲馬瘟（African horse sickness, AHS）被列為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。我國是AHS歷史無疫國，并已獲得OIE認(rèn)可。在2020年距離我國較近的泰國發(fā)生了AHS疫情[1]，此外AHS最重要的傳播媒介擬蟻庫蠓在我國華南地區(qū)已有相關(guān)報(bào)道，因此AHS具有傳入我國的潛在風(fēng)險(xiǎn)?；诜侵揆R瘟病毒（African horse sickness virus, AHSV）VP7抗原的ELISA方法可用于檢測AHSV群特異性抗體并在2002年獲得歐盟的認(rèn)可，但目前我國仍沒有自主研發(fā)相關(guān)商品化產(chǎn)品，其來源主要還是依靠進(jìn)口。為及時(shí)有效應(yīng)對(duì)AHS傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)，研發(fā)AHSV的ELISA抗體檢測方法至關(guān)重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】AHS主要通過庫蠓等吸血昆蟲叮咬傳播，主要癥狀為發(fā)熱、皮下水腫和病毒血癥，嚴(yán)重時(shí)伴有組織和臟器出血，馬屬動(dòng)物中馬最易感，病死率可高達(dá)95%，騾驢次之[2-3]。該病的臨床癥狀可分為4種類型，即肺型、心型、混合型和發(fā)熱型[4-5]。盡管AHS的一些臨診癥狀和病理變化很典型，例如，患亞急性AHS的馬匹經(jīng)常出現(xiàn)眶上水腫，結(jié)合相應(yīng)病史足以做出初步診斷，但其他一些癥狀和病變的特異性較低，容易與其他疾病相混淆，如馬器質(zhì)性腦病、馬傳染性貧血、亨德拉病毒病、馬病毒性動(dòng)脈炎、馬梨形蟲病和紫癜性出血病，為進(jìn)行鑒別診斷，實(shí)驗(yàn)室檢測對(duì)疫病確診至關(guān)重要。AHSV包含9個(gè)血清型，即AHSV1—9型[6]，基因組由10個(gè)雙鏈RAN片段組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP7）和4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1, NS2, NS3 和 NS3a）[7]。VP2蛋白基因序列在不同血清型間變化范圍是47.6% —71.4%，是最重要的血清型特異性抗原[8]；而VP7基因是AHSV最重要的血清群特異性抗原基因，在各血清型間高度保守，不同血清型之間同源性為94.3%—99.5%，因此VP7基因及其編碼蛋白也是核酸檢測[9-14]及血清學(xué)[15-18]檢測的重要靶標(biāo)。目前AHSV的實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、病毒中和試驗(yàn)、免疫印跡和微量補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗體檢測，其中ELISA是最主要的血清學(xué)檢測方法[15-17, 19-26]。HAMBLIN等[15]利用AHSV作為包被抗原和全病毒制備的豚鼠多抗建立了競爭ELISA（Competitive ELISA, cELISA）檢測方法，驗(yàn)證了利用AHSV-4獲得的豚鼠血清能識(shí)別9個(gè)血清型抗原，并且相比AHSV-1 制備的血清特異性更好。此外基于VP7建立的ELISA方法更加廣泛，Maree等[20]利用桿狀病毒表達(dá)的VP7建立了iELISA檢測方法并證明了此方法比病毒中和試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)具有更高的敏感性；Wade-Evans[16]以VP7建立了cELISA檢測方法并證明包被VP7蛋白比包被全病毒時(shí)檢測敏感性更好。KWEON等[17]以VP7建立了cELISA，通過對(duì)樣品檢測驗(yàn)證了其特異性比iELISA更好。但目前國內(nèi)ELISA研究主要以集中在VP7建立iELISA方法[21, 23-24, 26]，2008年高志強(qiáng)等[26]利用拼接表達(dá)的VP7建立了iELISA方法并初步驗(yàn)證了其具有良好的特異性；2012年曹琛福等[21]直接利用桿狀病毒表達(dá)獲得裂解液作為包被抗原建立了iELISA方法，穩(wěn)定性及特異性仍需進(jìn)一步評(píng)估；2013年潘佳亮等[23]基于原核表達(dá)獲得的VP7蛋白建立了iELISA方法，并驗(yàn)證具有良好的敏感性和特異性。2014年鄭小龍等[24]基于VP7蛋白建立了lgM捕獲ELISA用于AHS的早期診斷但敏感性不及商品化試劑盒?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管國內(nèi)外有關(guān)AHSV ELISA抗體檢測方法的研究較多，目前國際可以用的試劑盒僅有西班牙英吉納公司的AHSV cELISA試劑盒，而國內(nèi)市場仍沒有自主研發(fā)的商品化的ELISA相關(guān)試劑盒，究其原因與試劑盒特異性和穩(wěn)定性有很大關(guān)系。iELISA相比cELISA敏感性高但特異性不強(qiáng)，多假陽性，前期我們利用純化后的VP7蛋白作為包被抗原建立了一種AHSV iELISA抗體檢測方法，通過大量樣品（＞500）證實(shí)了該方法存在大量假陽性結(jié)果，為了克服iELISA假陽性的問題，本研究采用單克隆抗體包被后捕獲VP7抗原的策略建立了AHSV iELISA方法，既保留常規(guī)iELISA的敏感性又增加了特異性。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在建立一種特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好的AHSV iELISA抗體檢測方法，為國內(nèi)AHS的診斷提供一種有效的血清學(xué)檢測工具。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年7月至2022年5月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由馬傳染病與慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)進(jìn)行。

1.1 質(zhì)粒和菌株及樣品

大腸桿菌Rosetta（DE3）化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；根據(jù)非洲馬瘟診斷技術(shù)（GB/T 21675-2008）提供的VP7基因序列（GenBank: KT030566.1）對(duì)VP7基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并將密碼子優(yōu)化后的VP7基因合成到pET32a載體上。

1.2 主要試劑

IPTG購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker DM 2000、T4 DNA連接酶購自上海生工生物工程有限公司；瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的抗馬IgG二抗（KPL）。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Gel Extraction Kit）、高純度質(zhì)粒小提試劑盒（Pureplasmid Mini Kit）等均購自康為世紀(jì)有限公司；1640培養(yǎng)基購自Sigma公司；胎牛血清購自Ausbian公司；馬傳染性貧血病毒（equine infections anemin virus, EIAV）、馬流感病毒（equine innuenza virus, EIV）、馬皰疹病毒（equine herpes virus, EHV）、馬動(dòng)脈炎病毒（equine arteritis virus, EAV）、馬泰勒蟲（）、駑巴貝斯蟲（,）馬鏈球菌（）、馬流產(chǎn)沙門氏菌（Abortus equiAbortus）、鼠傷寒沙門氏菌（）、都柏林沙門氏菌（Dublin）、腸炎沙門氏菌（）等標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。1 000份AHSV陰性血清；1份AHSV VP7特異性陽性參考血清（效價(jià)32×，由純化的AHSV VP7抗原免疫馬后獲得），用來作為試劑盒敏感性控制血清（敏控血清）：封閉液（I和II）、樣品稀釋液（I和II）和HRP偶聯(lián)物稀釋液（I、III和IV））等均保存于該實(shí)驗(yàn)室。10份AHSV陽性血清由香港漁護(hù)署贈(zèng)送（AHSV減毒活疫苗免疫馬血清或血漿）；947份臨床血清來自我國2021年18個(gè)省份或地區(qū)。

1.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將合成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Rosetta，37 ℃培養(yǎng)12—14 h。將陽性菌落，接種于5 mL含有1 μg·mL-1的氨芐青霉素抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下170 r/min震蕩培養(yǎng)16 h，以1﹕100比例接種于Amp/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 170 r/min培養(yǎng)，等到菌液OD600nm為0.6—0.8時(shí)，加入終濃度為0.6 mmol·L-1的IPTG，24 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)6 h后，取4 mL菌液進(jìn)行富集菌體并加入1.5 mL PBS進(jìn)行超聲破碎；破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。沉淀同樣用等量PBS沖洗兩遍，再用等量PBS重懸。分別取40 μL上清樣品和沉淀重懸樣品，并各加入10 μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻，95 ℃煮沸5min，取20 μL處理的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后用于考馬斯亮藍(lán)染色。利用親和層析分析方式純化目的蛋白以及pET32a空載體蛋白[27]，SDS-PAGE后以AHSV陽性血清為一抗（1﹕200稀釋），抗馬IgG抗體為二抗（1﹕5 000稀釋）進(jìn)行Western blot分析。

1.4 單克隆抗體制備及鑒定

利用常規(guī)方式對(duì)小鼠進(jìn)行免疫及雜交瘤細(xì)胞株篩選[28]。利用SBA ClonotypingTM System/HRP試劑盒按照說明書對(duì)篩選出的單克隆抗體亞類進(jìn)行鑒定。

1.5 AHSV iELISA反應(yīng)策略及抗體的篩選

將5種不同的單克隆抗體進(jìn)行包被后，按照順序依次加入抗原、陽性血清及酶標(biāo)二抗，對(duì)5株抗體的捕獲抗原能力進(jìn)行鑒定。具體步驟如下：（1）將5株純化后單克隆抗體分別按照2 μg·mL-1濃度包被（100 μL/孔），4 ℃包被過夜（＞12 h）；（2）封閉后加入0.25 μg·mL-1（100 μL/孔）VP7抗原，37 ℃作用30 min；（3）PBST洗滌2次后，加入1﹕400稀釋的AHSV陽性血清，37 ℃作用30 min；（4）PBST洗滌2次后，加入1﹕20 000稀釋的酶標(biāo)二抗，37 ℃作用30 min；（5）PBST洗滌2次后，加入底物（100微升/孔）37 ℃避光顯色10 min；（6）加入2 mol·L-1H2SO4進(jìn)行終止，在OD450nm讀值。根據(jù)陽性血清OD450nm值的大小評(píng)估5株單克隆抗體捕獲VP7抗原的能力。

1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別對(duì)包被抗體濃度（200、 100和50 μg·mL-1）、抗原濃度（0.25、 0.125、0.06 μg·mL-1）、血清稀釋度（1﹕100、 1﹕200和1﹕400）及酶標(biāo)抗體工作濃度（1﹕10 000、1﹕20 000、1﹕30 000和1﹕40 000）進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化和篩選，以P/N比值最大確定最佳反應(yīng)條件。在最佳反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上對(duì)封閉液（I和II）、樣品稀釋液（I和II）和HRP偶聯(lián)物稀釋液（I、III和IV）進(jìn)行篩選。

1.7 AHSV iELISA抗體檢測方法臨界值的確定

應(yīng)用優(yōu)化的AHSV iELISA抗體檢測方法對(duì)1 000份AHSV陰性血清進(jìn)行檢測，利用以下公式進(jìn)行計(jì)算S/P值，計(jì)算全部陰性血清S/P值的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），并確定X+3SD作為該方法檢測臨床AHSV抗體陽性和陰性的臨界值。當(dāng)待檢血清樣品的S/P值大于臨界值時(shí)判為陽性。

1.8 AHSV iELISA特異性、敏感性和穩(wěn)定性

利用優(yōu)化出的最佳反應(yīng)條件對(duì)AHSV陽性血清、馬傳染性貧血病病毒（EIAV）、馬動(dòng)脈炎病毒（EAV）、馬皰疹病毒（EHV）、馬流感病毒（EIV）、馬泰勒蟲（）、馬巴貝斯蟲（）、馬腺疫鏈球菌（）、馬流產(chǎn)沙門氏菌（Abortusequi）、鼠傷寒沙門氏菌（Typhimurium）、都柏林沙門氏菌（Dublin）、腸炎沙門氏菌（Enteritidis）大腸桿菌陽性血清等陽性血清進(jìn)行檢測，評(píng)估 AHSV iELISA抗體檢測方法的特異性。采用本方法對(duì)AHSV陽性血清進(jìn)行檢測并與商品化的AHSV cELISA方法比較敏感性。將配制的AHSV iELISA試劑放置37 ℃進(jìn)行加速試驗(yàn)驗(yàn)證其穩(wěn)定性，由3位實(shí)驗(yàn)操作者分別對(duì)AHSV陽性敏控血清進(jìn)行效價(jià)測定試驗(yàn)，每人做2個(gè)重復(fù)共6個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)成立的條件為陽性對(duì)照血清OD450nm值＞0.8，陰性對(duì)照血清OD450nm值＜0.25。

1.9 AHSV iELISA與商品化試劑盒檢測性能的評(píng)估

利用本研究建立的AHSV iELISA方法對(duì)10份AHSV陽性血清和400份陰性血清進(jìn)行檢測，并與商品化AHSV cELISA檢測結(jié)果進(jìn)行比較。計(jì)算AHSV iELISA 的檢測敏感性和檢測特異性。檢測敏感性（%）= [檢測出的陽性樣品數(shù)量/已知陽性樣品數(shù)量]×100；檢測特異性（%）= [檢測出的陰性樣品數(shù)量/已知陰性樣品數(shù)量]×100 。

1.10 AHSV iELISA方法的應(yīng)用

利用AHSV iELISA對(duì)我國2021年18個(gè)省份或地區(qū)共947份臨床血清進(jìn)行檢測，了解我國馬匹AHSV感染情況。

2 結(jié)果

2.1 VP7蛋白的表達(dá)

通過SDS-PAGE分析顯示，重組pET32a-VP7菌破碎后上清和沉淀中均出現(xiàn)一條相對(duì)分子質(zhì)量約52 kDa的蛋白條帶（圖1），證明重組蛋白獲得表達(dá)并主要以包涵體形式存在。Western blot 分析表明AHSV陽性血清與重組蛋白（圖2）發(fā)生特異性反應(yīng)，證實(shí)重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M：蛋白marker；1：VP7蛋白誘導(dǎo)后上清；2：VP7蛋白誘導(dǎo)后沉淀

M：蛋白marker；1：pET32a載體；2：純化的VP7蛋白

2.2 單克隆抗體的鑒定

通過3次亞克隆共篩到5株能識(shí)別VP7融合蛋白的單克隆抗體。按照SBA ClonotypingTMSystem/ HRP試劑盒說明書對(duì)篩選出的單克隆抗體亞類進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明3G9、6G4株單克隆抗體亞類IgG1，3E9株單克隆抗體亞類IgG2a，5E2株單克隆抗體亞類IgG2b，5株單克隆抗體輕鏈均為κ型。間接ELISA的方法測定5株雜交瘤細(xì)胞株純化后抗體的效價(jià)： 3G9、3E9和6G4效價(jià)最高，達(dá)到8.2×105；其次是8B5，效價(jià)為4.1×105；5E2效價(jià)最低，效價(jià)為2.0×105。

2.3 包被抗體的篩選

ELISA結(jié)果表明僅3G9作為包被抗體時(shí)檢測AHSV陽性血清OD450nm值最高（圖略），所以3G9抗體作為包被抗體捕獲VP7抗原的能力最強(qiáng)，因此后續(xù)AHSV iELISA方法反應(yīng)條件的優(yōu)化以3G9抗體作為包被抗體進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 最佳反應(yīng)條件的確定

通過對(duì)包被抗體濃度、抗原濃度、血清稀釋度及酶標(biāo)抗原工作濃度進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，確定反應(yīng)策略的最佳反應(yīng)體系。最終確定條件為：包被抗體濃度為2 μg·mL-1、抗原濃度為0.25 μg·mL-1、血清稀釋度為1﹕400倍稀釋、酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?﹕20 000倍稀釋。在最佳反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，根據(jù)S/P值確定最佳封閉液為I號(hào)，最佳樣品稀釋液為II號(hào)，最佳酶標(biāo)抗體稀釋液為I號(hào)。

2.5 AHSV iELISA抗體檢測方法臨界值的確定

根據(jù)1 000份陰性血清的檢測結(jié)果確定臨界值。通過生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法計(jì)算出臨床血清檢測時(shí)陽性和陰性血清的臨界值（X+3SD）為0.232，為了方便臨床使用將臨界值定為0.25，當(dāng)臨床樣品S/P值高于0.25時(shí)判定為陽性。

2.6 AHSV iELISA抗體檢測方法特異性鑒定

通過對(duì)不同陽性血清進(jìn)行檢測評(píng)估AHSV iELISA抗體檢測方法的特異性，結(jié)果顯示，該方法僅與AHSV陽性血清呈陽性反應(yīng)，因此證明該方法具有良好的特異性。

2.7 AHSV iELISA敏感性

首先對(duì)AHSV陽性血清（香港漁護(hù)署贈(zèng)送血清）進(jìn)行2倍比稀釋，然后將稀釋后的血清分別采用本研究建立的基于單克隆抗體的AHSV iELISA和商品化的AHSV cELISA方法同時(shí)檢測，比較兩種方法檢測陽性血清的最大稀釋度。結(jié)果表明AHSV iELISA檢測陽性血清最大稀釋度為16倍（圖3-A），與商品化cELISA（＞50%判定陽性）檢測陽性血清的最大稀釋度一致（圖3-B）。

圖3 AHSV iELISA和商品化cELISA的敏感性鑒定

2.8 AHSV iELISA抗體檢測方法的穩(wěn)定性

由3位試驗(yàn)操作者分別對(duì)AHSV陽性敏控血清2倍比稀釋后進(jìn)行效價(jià)測定，3位操作者檢測結(jié)果的組內(nèi)變異系數(shù)范圍分別為3.19%—7.02%、0—3.11%、0.27%—5.76%，組間變異系數(shù)范圍為1.17%—5.03%。組內(nèi)、組間變異系數(shù)均＜10%，因此證明該方法具有良好的穩(wěn)定性（表1）。加速試驗(yàn)表明在加速第0—8天時(shí)不同血清稀釋度下的S/P值均比較平緩，對(duì)AHSV iELISA試劑盒保存期加速試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)加速第8天時(shí)，操作者1、操作者3檢測出AHSV敏控血清OD450nm值均＞0.8，AHSV敏控血清效價(jià)為32×，操作者2所做陽性血清OD450nm值=0.798略低于0.8，試驗(yàn)不成立但敏控血清效價(jià)仍滿足32×。在加速第7天時(shí)，3位操作者的試驗(yàn)均成立，測定效價(jià)均為32×，試劑盒合格，因此證明該方法具有良好的穩(wěn)定性（圖4）。

表1 AHSV iELISA組內(nèi)、組間重復(fù)性結(jié)果

圖4 不同天數(shù)下S/P值的結(jié)果

2.9 AHSV iELISA與商品化cELISA的比較

應(yīng)用本研究建立的AHSV iELISA對(duì)10份AHSV陽性血清和400份AHSV陰性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明AHSV iELISA的檢測敏感性和檢測特異性均為100%。將AHSV iELISA檢測結(jié)果與商品化AHSV CELISA檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明AHSV iELISA和商品化AHSV C ELISA陽性符合率和陰性符合率均為100%（表2）。

2.10 AHSV iELISA檢測臨床樣品

利用AHSV iELISA對(duì)我國18個(gè)省份或地區(qū)共947份臨床血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明18個(gè)省的樣品中AHSV抗體陽性率為0。

“+”代表陽性結(jié)果，“-”代表陰性結(jié)果

"+" positive result, "-" negative result

3 討論

3.1 關(guān)于AHSV ELISA檢測產(chǎn)品的現(xiàn)狀和不足

目前關(guān)于AHS的血清學(xué)診斷，國內(nèi)外學(xué)者做出了大量工作，國外研究多集中在以VP7蛋白建立的AHSV cELISA，而國內(nèi)學(xué)者多以VP7建立的iELISA方法。我國學(xué)者雖然在早期建立了AHSV iELISA檢測方法但均沒有實(shí)現(xiàn)商品化[21, 23-24, 26]，目前商品化的AHSV ELISA診斷產(chǎn)品以西班牙英吉納公司的AHSV cELISA試劑盒為主。我國是AHS歷史無疫國并已獲得OIE認(rèn)定，盡管目前我國沒有AHS疫情，但隨著鄰近國家AHS 疫情的暴發(fā)AHS仍有傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)，因此研發(fā)相關(guān)診斷產(chǎn)品作為對(duì)AHS防范的戰(zhàn)略儲(chǔ)備具有重要意義。

3.2 AHSV iELISA方法與前人研究方法的對(duì)比

通常iELISA中包被蛋白通常來自原核表達(dá)系統(tǒng)，在純化后目的蛋白中仍會(huì)有一定量大腸桿菌抗原殘留，而大腸桿菌是一種自然界常在菌，部分動(dòng)物血清中會(huì)有大腸桿菌抗體存在。當(dāng)進(jìn)行目的蛋白包被時(shí)殘留的大腸桿菌也會(huì)吸附到板子上，如果待檢血清中含有大腸桿菌抗體時(shí)則會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。前期我們通過原核表達(dá)系統(tǒng)并利用親和層析方式獲得了較高純度的VP7蛋白，將VP7蛋白直接作為包被抗原建立了常規(guī)iELISA方法，并驗(yàn)證該方法的敏感性比商品化試劑盒提高了4—8倍。但利用該方法對(duì)大腸桿菌陽性血清和臨床樣品（＞500份）進(jìn)行檢測時(shí)卻出現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且不同批次蛋白包被檢測結(jié)果差異大。為了提高iELISA檢測的特異性，本研究建立了基于單克隆抗體的iELISA方法。該方法利用單克隆抗體特異性將VP7單克隆抗體先包被到ELISA板子中然后加入VP7蛋白孵育，此步驟VP7單克隆抗體可以特異性捕獲VP7蛋白，減少了VP7蛋白中非特異性大腸桿菌蛋白的干擾，從而提高了檢測的特異性。關(guān)于AHSV ELISA檢測方法，我國學(xué)者先前也進(jìn)行了研究。曹琛福等[21]以桿狀病毒表達(dá)的裂解液作為包被抗原建立iELISA方法并對(duì)150多份血清進(jìn)行了檢測，抗體檢測結(jié)果均為陰性，但該方法以裂解液直接作為包被抗原，其各個(gè)批次間穩(wěn)定性及特異性需進(jìn)一步評(píng)估；高志強(qiáng)等[26]和潘佳亮等[23]利用原核表達(dá)的VP7蛋白建立的iELISA方法，對(duì)少量馬傳染病病毒陽性血清進(jìn)行了特異性驗(yàn)證，但均未對(duì)大腸桿菌陽性血清和其他細(xì)菌性和寄生蟲性陽性血清驗(yàn)證，因此其特異性仍需進(jìn)一步評(píng)估。鄭小龍等[24]基于VP7蛋白建立了IgM捕獲ELISA對(duì)180份血清進(jìn)行檢測與商品化試劑盒符合率為97.7%，敏感性不及商品化試劑盒。相比曹琛福的研究，本研究建立的AHSV iELISA方法中所涉及的單克隆抗體以及VP7蛋白均為純化后獲得，在批間重復(fù)性、特異性上更好；與高志強(qiáng)等和潘佳亮等研究相比本方法在特異性上評(píng)估上更全面，不僅對(duì)馬傳染性貧血病等病毒陽性血清進(jìn)行了驗(yàn)證，還對(duì)寄生蟲和細(xì)菌病的陽性血清進(jìn)行了評(píng)估，因此特異性評(píng)估結(jié)果更加可靠；相比鄭小龍的研究結(jié)果，本方法與商品化試劑盒的總體符合率更高，達(dá)到100%。本方法用于臨界值確定的樣品數(shù)量相比先前研究多20倍以上，因此臨界值結(jié)果的確定可信度更高。

3.3 我國馬匹AHSV感染狀況監(jiān)測及應(yīng)對(duì)

目前尚無針對(duì)AHS的特異性治療方法，檢疫隔離、病媒控制、疫苗接種等支持性治療仍是控制該病的有效方法。目前，在非洲流行地區(qū)，一價(jià)和多價(jià)減毒活疫苗均可用于預(yù)防AHS，多價(jià)減毒活疫苗對(duì)所有9種血清型的AHSV都提供廣泛的保護(hù)[29-30]。然而，由于與減毒活疫苗相關(guān)的安全問題，如毒力返強(qiáng)、與流行AHSV毒株發(fā)生重組，多價(jià)LAV尚未在歐洲和其他國家注冊使用[12]，此外，近期Aksular等證實(shí)單劑量的AHSV VP2亞單位疫苗在小鼠模型中提供完全的臨床保護(hù)[31]。目前我國沒有AHS疫情，但常規(guī)檢疫對(duì)了解我國馬匹AHSV感染情況具有重要意義，此外在血清學(xué)檢測是陽性結(jié)果時(shí)，應(yīng)結(jié)合馬匹是否進(jìn)行減毒疫苗免疫方可對(duì)疾病進(jìn)行確診。本研究對(duì)我國18個(gè)省份947份馬屬動(dòng)物血清進(jìn)行了AHSV抗體監(jiān)測，目前我國馬匹還沒有出現(xiàn)AHSV感染情況，但吸取非洲豬瘟傳入我國的教訓(xùn)，對(duì)我國馬群中AHSV的抗體監(jiān)測是十分有必要的。隨著我國亞運(yùn)會(huì)召開、馬屬俱樂部等興起和馬屬動(dòng)物無疫區(qū)建設(shè)等，市場對(duì)該病的檢測需求越來越大，但國內(nèi)市場上AHS診斷產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)商品化的較少，主要還是依靠進(jìn)口，而進(jìn)口試劑盒存在價(jià)格昂貴、貨期長等因素，使我國馬匹AHS的監(jiān)測可能會(huì)處于被動(dòng)狀態(tài)，因此，面對(duì)市場需要增大以及進(jìn)口試劑盒貨期長等不利因素，應(yīng)積極推動(dòng)國內(nèi)AHS診斷產(chǎn)品的上市。目前，本研究研發(fā)的AHSV iELISA試劑盒正在進(jìn)行孵化，該產(chǎn)品可用于國內(nèi)AHS疫病疫情快速檢測，為我國AHS血清學(xué)監(jiān)測提供了一種特異、穩(wěn)定的檢測工具。

4 結(jié)論

成功建立了一種基于單克隆抗體的非洲馬瘟病毒iELISA抗體檢測方法，該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，與商品化試劑盒符合率為100%，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣本中非洲馬瘟病毒抗體的檢測，因此可以作為我國馬匹中非洲馬瘟病毒抗體檢測的一種有效工具。通過對(duì)我國馬匹進(jìn)行較大規(guī)模非洲馬瘟病毒抗體監(jiān)測，目前我國馬匹尚無非洲馬瘟病毒感染情況。

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Development and Application of a Mab-Based iELISA for the Detection of Antibodies Against African Horse Fever Virus

GUO Kui, ZHANG ZeNan, WANG YaoXin, LI ShuaiJie, CHU XiaoYu, GUO Wei, HU Zhe, WANG XiaoJun

State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069

【Objective】In order to effectively address the risk of introduction of African horse fever into China, this study aimed to develop an indirect ELISA (iELISA) antibody test specific for African horse fever virus (AHSV) based on monoclonal antibodies, so as to monitor the antibody status of African horse fever in horses in China.【Method】Firstly, Mabs against VP7 antigen were prepared by immunizing mice with the VP7 antigen. Secondly, the ELISA method was developed by optimizing the amount of coating Mab, antigen and secondary antibody concentrations. Negative sera (n=1 000) were used to establish the baseline for a negative population, and then the specificity and sensitivity of it was estimated. The stability of the method was determined by an accelerated test using AHSV-positive reference sera by three independent operators. 10 known positive sera and 400 negative sera for African horse fever were tested using the established method and compared with the results of foreign commercial kits. Finally, the method was tested on 947 clinical samples from 18 provinces or regions in China in 2021 to assess the risk of African horse fever in horses in China.【Result】 Five Mabs were obtained against the VP7 antigen of AHSV, and the 3G9 Mab had the best antigen capture performance. Using the 3G9 Mab as the capture antibody, an ELISA method for the detection of AHSV was established by optimizing different reaction conditions. A cut-off value of 0.25 was selected in AHSV iELISA. The sensitivity of ELISA method was comparable with that of commercial kits and the sensitivity of both methods was consistent. The intra-group coefficients of variation from 3 operators ranged from 3.19% to 7.02%, 0% to 3.11%, and 0.27% to 5.76%, respectively, and the inter-group coefficients of variation for the three operators ranged from 1.17 to 5.03%. The accelerated test at 37 °C demonstrated that the components of the testing kit had good stability over 7 days, thus demonstrating the stability of the method. The results showed that the agreement between the AHSV iELISA and commercial AHSV C ELISA kits were 100%. In this study, a serological survey on AHSV was performed by using 947 serum samples collected from 18 provinces of China in 2021, and the results showed that the positive rates were 0%. 【Conclusion】 A Mab-based AHSV iELISA method was established for the detection of AHSV antibodies, which had the good specificity and sensitivity, and could be a promising candidate tools for use serological surveillance for AHS.

African horse fever virus; monoclonal antibody; indirect ELISA; application

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.015

2022-5-25；

2022-10-23

十四五國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2021YFD1800500）

郭奎，E-mail：guokuiking@163.com。通信作者王曉鈞，E-mail：wangxiaojun@caas.cn。通信作者胡哲，E-mail：huzher@126.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）