鄒金鵬，岳浩峰，李海笑，劉崢，劉寧，曹志艷，董金皋

基于非靶向代謝組學(xué)分析StLAC2和StLAC6差異影響玉米大斑病菌的機(jī)制

鄒金鵬1,2，岳浩峰2，李海笑1,2，劉崢3，劉寧1,2，曹志艷，董金皋1,2

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001；2河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；3保定市教育科學(xué)研究所，河北保定 071066

【背景】漆酶作為多酚氧化酶，在真菌生長(zhǎng)發(fā)育及次級(jí)代謝等多方面發(fā)揮重要的作用。玉米大斑病菌（）基因組中含有多個(gè)漆酶基因，其中和對(duì)玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病性具有差異的影響?！灸康摹棵鞔_StLAC2和StLAC6對(duì)玉米大斑病菌的差異作用機(jī)制，挖掘差異代謝物，為開(kāi)發(fā)新的殺菌劑及病害防控新策略提供靶點(diǎn)?！痉椒ā坷脽o(wú)縫克隆的方法將和pHZ100-GFP質(zhì)粒連接，構(gòu)建的回補(bǔ)表達(dá)載體。利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入到基因缺失突變體的原生質(zhì)體中，并利用PCR、RT-qPCR和GFP熒光驗(yàn)證，對(duì)所獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，成功構(gòu)建回補(bǔ)菌株，并分析敲除及回補(bǔ)和對(duì)玉米大斑病菌胞內(nèi)外黑色素合成及抗氧化性的影響。以野生型、和基因敲除突變體為試驗(yàn)材料，利用非靶向代謝組學(xué)分析其差異代謝物，并利用KEGG分析StLAC2和StLAC6差異作用的機(jī)制?！窘Y(jié)果】StLAC2和StLAC6對(duì)病菌菌絲內(nèi)和分泌到培養(yǎng)基中的黑色素合成具有差異影響，且StLAC2影響病菌的抗氧化性。代謝組分析發(fā)現(xiàn)與玉米大斑病菌野生型菌株相比，敲除后無(wú)論菌絲中或分泌到培養(yǎng)基中的差異代謝物數(shù)量更多，KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要為脂類尤其是磷脂，的缺失造成多種黃酮多酚類代謝物下調(diào)。而1，8-二羥基萘型黑色素合成途徑的中間代謝物小柱孢酮和柱孢酮含量在Δ中顯著增加，在Δ中顯著降低?！窘Y(jié)論】StLAC2參與黑色素的聚合，StLAC6負(fù)調(diào)控玉米大斑病菌黑色素合成，StLAC2和StLAC6差異影響玉米大斑病菌中脂類代謝物和黑色素合成途徑的中間代謝物，缺失造成多種黃酮多酚類代謝物下調(diào)，導(dǎo)致抗氧化性降低。

玉米大斑病菌；漆酶；代謝組學(xué)；差異代謝物；黑色素

0 引言

【研究意義】漆酶（EC1.10.3.2）是一類在催化中心含有多個(gè)銅離子的多酚氧化酶，也被稱為多銅氧化酶[1]，在真菌中發(fā)揮重要作用。玉米（）是我國(guó)重要的糧食及經(jīng)濟(jì)作物之一，玉米病害的暴發(fā)嚴(yán)重影響我國(guó)糧食安全和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]。玉米大斑病（northern corn leaf blight，NCLB）是玉米的重要葉部病害之一，廣泛存在于世界各玉米產(chǎn)區(qū)，在大發(fā)生的年份減產(chǎn)可達(dá)20%左右，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%以上[3-6]。其病原菌玉米大斑病菌（）主要侵染玉米葉片，造成的病斑沿葉脈擴(kuò)展開(kāi)，表現(xiàn)為棕褐色壞死條紋，周圍有黃色或淡褐色褪綠圈，嚴(yán)重影響玉米光合作用導(dǎo)致產(chǎn)量下降[7]。研究玉米大斑病菌致病相關(guān)基因的功能及其調(diào)控病菌生長(zhǎng)發(fā)育、侵染致病及次生代謝的機(jī)制可為科學(xué)有效防治玉米大斑病提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】玉米大斑病菌基因組中含有多個(gè)漆酶基因，研究顯示漆酶參與了1, 8-二羥基萘（1, 8-DHN）黑色素和L-3, 4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）黑色素的合成，催化其單體聚合形成無(wú)定形黑色素高聚物，影響病菌致病性等[8]。例如黃瓜炭疽病菌（）中的漆酶基因缺失突變體的分生孢子顏色與野生型菌株相比明顯較淺，同時(shí)突變體的附著胞在黑化方面存在缺陷[9]。同樣桑椹菌核病菌（）中漆酶基因是影響黑色素合成的重要酶，在致病性中起關(guān)鍵作用[10]。漆酶還影響菌體的形態(tài)建成[11]，例如松杉靈芝（）中的漆酶基因在菌絲發(fā)育和子實(shí)體成熟過(guò)程中的表達(dá)量最高，其促進(jìn)松杉靈芝子實(shí)體成熟過(guò)程中色素的沉著和菌柄的伸長(zhǎng)[12]。在灰葡萄孢（）中，致病性相關(guān)的漆酶可以降解其侵染過(guò)程中葡萄產(chǎn)生的多種植物抗毒素，從而有利于灰葡萄孢的侵染定殖[13]。因此，對(duì)漆酶作用機(jī)制的深入研究有利于解析植物病原菌的致病機(jī)制。代謝組學(xué)根據(jù)研究目的的不同，可進(jìn)一步分為非靶向和靶向代謝組學(xué)，非靶向代謝組學(xué)是指采用LC-MS、GC-MS、NMR等技術(shù)無(wú)偏向性地檢測(cè)全部代謝物的動(dòng)態(tài)變化，并通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選差異代謝物，對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路分析，揭示其變化的生理機(jī)制[14]。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌中存在9個(gè)漆酶同工酶，其中StLAC2和StLAC6對(duì)玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病性等方面的影響存在差異，但具體機(jī)制尚不清楚，利用代謝組學(xué)檢測(cè)生物體內(nèi)代謝物的含量和種類變化，并推斷基因的表達(dá)與相關(guān)代謝物和代謝通路的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在繼續(xù)構(gòu)建回補(bǔ)菌株的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證和在玉米大斑病菌黑色素合成及抗氧化性等方面的差異作用，并進(jìn)一步利用LC-MS分析野生型和2個(gè)基因敲除突變體的菌絲及分泌到培養(yǎng)基中的差異代謝物，以期明確漆酶同工酶差異作用方式，為解析玉米大斑病菌致病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021—2022年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

玉米大斑病菌野生型菌株01-23（WT）、基因缺失突變體（Δ）基因回補(bǔ)菌株（Δ）和基因缺失突變體（Δ）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素實(shí)驗(yàn)室保存。接種于PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基，于25 ℃黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。液體培養(yǎng)使用改良的完全培養(yǎng)基[15]（complete medium，CM）。

1.2 StLAC6回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

1.2.1回補(bǔ)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的獲得 根據(jù)和pHZ100-GFP載體序列，設(shè)計(jì)帶有I、R I酶切位點(diǎn)的特異性引物（表1），擴(kuò)增全長(zhǎng)，通過(guò)無(wú)縫克隆的方法與pHZ100-GFP載體連接，構(gòu)建pHZ100-載體，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。利用PEG介導(dǎo)法，將構(gòu)建好的pHZ100-載體轉(zhuǎn)化到Δ的原生質(zhì)體中。挑取再生培養(yǎng)基上獲得的單菌落，接種于含有遺傳霉素G418抗性的PDA培養(yǎng)基上，篩選3代以上，獲得抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。

表1 試驗(yàn)中所用引物

1.2.2 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定：以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，用特異引物StLAC6-R/F和GFP-R/F（表1）擴(kuò)增目的片段及GFP，擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃∞，PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

轉(zhuǎn)化子的熒光定量RT-qPCR驗(yàn)證：按照真菌總RNA提取試劑盒的方法分別提取野生型、敲除突變體及轉(zhuǎn)化子的總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以為內(nèi)參，野生型菌株01-23、突變體Δ和轉(zhuǎn)化子的cDNA為模板，以RT-StLAC6-F/RT-StLAC6-R為特異引物（表1）分別檢測(cè)各菌株中的表達(dá)量。

1.3 菌株黑色素含量測(cè)定

液體CM培養(yǎng)基25 ℃靜置培養(yǎng)野生型菌株01-23、Δ和Δ，取培養(yǎng)8 d的菌絲及胞外培養(yǎng)基，根據(jù)黑色素在堿性環(huán)境下溶解，在酸性環(huán)境下沉淀且不溶于有機(jī)溶劑的特性，提取黑色素[16]并進(jìn)行定量分析，確定和基因缺失后對(duì)病菌胞內(nèi)外黑色素含量的影響。

1.4 菌株抗氧化性測(cè)定

選取同等生長(zhǎng)狀況的野生型菌株01-23、Δ、ΔΔ和Δ分別接種到含有30 mmol·L-1H2O2的普通PDA培養(yǎng)基平板上，黑暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)以明確和對(duì)病菌抗氧化性的影響。

1.5 代謝組學(xué)分析StLAC2和StLAC6的差異代謝產(chǎn)物

1.5.1 代謝組學(xué)分析樣品的采集及提取 將野生型菌株01-23、Δ和Δ接種于CM液體培養(yǎng)中，25 ℃靜置培養(yǎng)8 d。過(guò)濾收集菌絲，將帶有樣品的濾紙置于液氮中速凍5 min后利用冷凍干燥機(jī)（Labconco，美國(guó)）凍干24 h，-80 ℃保存；將胞外培養(yǎng)液利用冷凍干燥機(jī)凍干至恒重，-80 ℃保存，用于后續(xù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。將野生型菌株01-23、Δ、Δ的菌絲樣品分別命名為WT_IN、LAC2_IN和LAC6_IN，將野生型菌株01-23、Δ、Δ分泌到培養(yǎng)基的樣品分別命名為WT_OUT、LAC2_OUT和LAC6_OUT。

吸取適量液體樣本于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈﹕甲醇=1﹕1的提取液，渦旋混勻30 s后，低溫超聲提取30 min，將樣品靜置于-20 ℃，30 min，4 ℃，13 000×離心15 min，移取上清液，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL乙腈﹕水=1﹕1復(fù)溶，低溫超聲萃取5 min，4 ℃，13 000×離心5 min，移取上清液用于LC-MS分析。取等體積的所有樣本代謝物混合制備成質(zhì)控樣本（quality control，QC），以考察整個(gè)分析過(guò)程的重復(fù)性，非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司開(kāi)展。

1.5.2 LC-MS檢測(cè)條件 LC-MS分析的儀器平臺(tái)為賽默飛公司的超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPLC-Q Exactive系統(tǒng)。色譜條件和質(zhì)譜條件見(jiàn)XIE等[17]。

1.5.3 差異代謝物分析 對(duì)預(yù)處理后的矩陣文件進(jìn)行差異分析。R軟件包ropls（version 1.6.2）進(jìn)行主成分分析（PCA），并使用7次循環(huán)交互驗(yàn)證來(lái)評(píng)估模型的穩(wěn)定性。此外，進(jìn)行student’s檢驗(yàn)和差異倍數(shù)分析?；赩IP＞1，＜0.05得到的變量權(quán)重值VIP和student’s檢驗(yàn)值來(lái)確定代謝物為差異代謝物。差異代謝物通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https: //www.keggjp/ kegg/pathway.htm1）進(jìn)行代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的通路。Python軟件包scipy.stats進(jìn)行通路富集分析，并通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)獲得與試驗(yàn)處理最相關(guān)的生物學(xué)途徑。

2 結(jié)果

2.1 StLAC6回補(bǔ)菌株的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建好的pHZ100質(zhì)粒通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入野生型和Δ菌株原生質(zhì)體中，G418抗性篩選并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，的片段大小為1 803 bp，篩選回補(bǔ)菌株Δ（圖1-A）。利用RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，的表達(dá)量在Δ中顯著降低，Δ中表達(dá)量恢復(fù)，與野生型差異不顯著（圖1-B）。利用熒光顯微鏡觀察GFP標(biāo)簽的綠色熒光發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子相較于野生型有明顯的綠色熒光，并且定位于細(xì)胞壁上（圖1-C）。

2.2 StLAC2和StLAC6差異影響病菌黑色素的合成及抗氧化性

在PDA培養(yǎng)基上接種野生型菌株、ΔΔΔ和Δ，7 d后觀察發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)基本一致，菌落近圓形，邊緣整齊。野生型菌株菌落顏色呈現(xiàn)灰黑色，氣生菌絲較多，菌落較為茂密、蓬松；Δ菌落顏色呈現(xiàn)灰白色，氣生菌絲減少，菌絲致密平伏；Δ菌落顏色呈現(xiàn)黑褐色，氣生菌絲較多；Δ菌落氣生菌絲比較稀疏平坦，菌落顏色為灰色；Δ菌落邊緣比較整齊有規(guī)則，氣生菌絲比較茂盛菌落顏色為灰褐色，基本恢復(fù)到野生型菌株的形態(tài)（圖2）。

圖2 不同菌株菌落形態(tài)

對(duì)培養(yǎng)8 d的野生型菌株、Δ和Δ的胞內(nèi)外黑色素進(jìn)行提取及含量測(cè)定，結(jié)果顯示Δ胞內(nèi)外黑色素含量顯著下降，Δ胞內(nèi)外黑色素含量顯著增加（圖3）。漆酶差異影響黑色素合成及菌絲形態(tài)的機(jī)制需要進(jìn)一步通過(guò)比較差異代謝物進(jìn)行分析。

A：菌絲黑色素的含量the melanin content in the mycelium；B：細(xì)胞外培養(yǎng)液黑色素的含量the melanin content in the extracellular culture medium

在培養(yǎng)基中添加30 mmol·L-1H2O2培養(yǎng)野生型菌株和各突變菌株，分析StLAC2和StLAC6對(duì)抗氧化性的影響。結(jié)果顯示缺失后對(duì)H2O2更加敏感，缺失后對(duì)H2O2不敏感，可以正常生長(zhǎng)，和回補(bǔ)后對(duì)H2O2的敏感程度與野生型相似（圖4），表明StLAC2影響了玉米大斑病菌的抗氧化性。

圖4 野生型和各突變菌株的抗氧化性測(cè)定

2.3 代謝組樣品質(zhì)控分析

利用代謝組學(xué)分析培養(yǎng)8 d的野生型菌株、Δ和Δ菌絲內(nèi)代謝物和分泌的代謝物，在各樣品鑒定出的2 779種代謝物中，正離子模式下有1 519種，負(fù)離子模式下有1 260種。對(duì)各菌株菌絲內(nèi)和分泌到培養(yǎng)基的兩組樣品進(jìn)行PCA分析，結(jié)果顯示QC聚合度高，說(shuō)明QC重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果可靠，各組內(nèi)樣本間聚合度高，組內(nèi)重復(fù)性好；組間樣本代謝物呈現(xiàn)分離趨勢(shì)，說(shuō)明各菌株菌絲內(nèi)和分泌到培養(yǎng)基的代謝物具有明顯差異（圖5）。

A：陽(yáng)離子模式Cationic mode；B：陰離子模式Anion mode

2.4 差異代謝物分析

2.4.1 整體分析 對(duì)野生型菌株、Δ和Δ菌絲內(nèi)和分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示與野生型菌株相比，Δ菌絲內(nèi)的差異代謝物有608個(gè)顯著上調(diào)，有599個(gè)顯著下調(diào)；Δ分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物有283個(gè)顯著上調(diào)，有396個(gè)顯著下調(diào)；Δ菌絲內(nèi)的差異代謝物有766個(gè)顯著上調(diào)，有253個(gè)顯著下調(diào)；Δ6分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物有281個(gè)顯著上調(diào)，有260個(gè)顯著下調(diào)（圖6）。

進(jìn)一步對(duì)已知結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行Venn分析，以明確同工酶影響代謝物的重疊關(guān)系，鑒別和缺失導(dǎo)致的共有和特有的差異代謝物，在菌絲內(nèi)所有上調(diào)代謝物中，其中兩個(gè)基因共同影響的代謝物313個(gè)，253個(gè)為Δ所特有，422個(gè)為Δ所特有；在菌絲內(nèi)所有下調(diào)代謝物中，其中共同下調(diào)的有140個(gè)代謝物，428個(gè)為Δ所特有，71個(gè)為Δ所特有。在分泌到培養(yǎng)基中的所有差異代謝物中，其中共同上調(diào)的有59個(gè)代謝物，220個(gè)為Δ所特有，213個(gè)為Δ所特有；其中共同下調(diào)的有145個(gè)代謝物，242個(gè)為Δ所特有，111個(gè)為Δ所特有（圖7）。以上結(jié)果表明敲除主要導(dǎo)致病菌代謝物合成受阻，而敲除更多的導(dǎo)致了菌絲內(nèi)代謝物含量增加，且兩個(gè)基因影響的代謝物具有明顯的區(qū)別。

2.4.2 KEGG功能通路富集和分類分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)敲除和敲除引起的差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，結(jié)果顯示，敲除后菌絲內(nèi)差異代謝物主要富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嘌呤代謝、嘧啶代謝、花生四烯酸代謝等通路，分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物主要富集在甘油磷脂代謝、苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、酪氨酸代謝等通路；敲除后菌絲內(nèi)差異代謝物主要富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝等通路，分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物主要富集在酪氨酸代謝、亞油酸代謝、甘油磷脂代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等（圖8）。

A：ΔStLAC2菌絲內(nèi)差異代謝物ΔStLAC2 differential metabolites in mycelium；B：ΔStLAC6菌絲內(nèi)差異代謝物ΔStLAC6 differential metabolites in mycelium；C：ΔStLAC2分泌到培養(yǎng)基差異代謝物ΔStLAC2 differential metabolites secreted into the culture medium；D：ΔStLAC6分泌到培養(yǎng)基差異代謝物ΔStLAC6 differential metabolites secreted into the culture medium。圖8同The same as Fig. 8

將差異代謝物進(jìn)行KEGG化合物分類，結(jié)果顯示在上調(diào)的差異代謝物中磷脂類代謝物數(shù)量最多（圖9-A），而下調(diào)的代謝物包括磷脂、氨基酸、核苷類和單糖類化合物富集較多（圖9-B）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲除導(dǎo)致多種核酸類化合物上調(diào)，敲除還導(dǎo)致多種單糖類化合物下調(diào)。

由于發(fā)現(xiàn)差異代謝物中含有磷脂、脂肪酸、類二十烷酸等多種脂類物質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)一步對(duì)代謝組結(jié)果中的脂類差異代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二酰甘油、磷脂等多種代謝物在兩種突變體中的差異有明顯區(qū)別，包括鞘磷脂類、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油等。在Δ中二酰甘油類代謝物含量增加，在Δ中磷脂酰甘油和鞘磷脂類代謝物含量明顯增加而Δ中變化較小或差異不顯著（表2）。

2.5 StLAC2影響黃酮皂苷類代謝物的生物合成

由于Δ的抗氧化性降低，因此分析了代謝組結(jié)果中抗氧化活性物質(zhì)含量的變化，結(jié)果顯示缺失導(dǎo)致3, 7-二羥基黃酮、甘草黃酮A、5-羥基-4’, 7, 8-三甲氧基黃酮和6-羥基-4’-甲氧基黃酮等多種黃酮皂苷類代謝物下調(diào)（圖10）。黃酮類代謝物主要影響生物的抗氧化性，其含量在Δ中含量降低，推測(cè)StLAC2參與了黃酮類物質(zhì)的合成。

A：菌絲內(nèi)差異代謝物Differential metabolites in mycelium；B：分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物Differential metabolites secreted into the culture medium

2.6 StLAC2和StLAC6差異影響DHN黑色素中間代謝產(chǎn)物

由于StLAC2和StLAC6差異影響了玉米大斑病菌黑色素的合成，進(jìn)一步檢測(cè)代謝組結(jié)果中DHN黑色素途徑中間代謝物小柱孢酮和柱孢酮的含量，發(fā)現(xiàn)小柱孢酮和柱孢酮在中含量增加，在中含量降低（圖11）。由此可以推測(cè)漆酶基因參與了黑色素的聚合，但敲除導(dǎo)致DHN黑色素合成中間代謝產(chǎn)物減少并促進(jìn)了其聚合物黑色素的合成。

3 討論

3.1 玉米大斑病菌漆酶同工酶StLAC2和StLAC6具有明顯的功能差異

漆酶屬于多銅氧化酶，作用底物廣泛可以催化多種多酚類物質(zhì)，在真菌中漆酶的主要功能涉及色素合成、生長(zhǎng)發(fā)育、致病性以及防御作用。研究發(fā)現(xiàn)許多生物編碼多個(gè)漆酶同工酶基因且不同漆酶同工酶氨基酸序列存在較大差異，其基因功能也存在差異。例如對(duì)擬南芥漆酶基因家族功能的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶可以抑制根的伸長(zhǎng)，可以使其更早開(kāi)花，使其種子顏色變成淡黃色，說(shuō)明漆酶基因在不同植物器官的發(fā)育方面具有不同作用[18]。番茄枯萎病菌（）的3個(gè)漆酶基因、和被敲除后不影響其致病性，其中調(diào)控菌絲的生長(zhǎng)、氧化脅迫和碳源代謝等[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)在玉米大斑病菌基因組中存在9個(gè)漆酶樣多銅氧化酶基因，其同源性介于19.79%—48.70%，其中和聚類在一起，且為主要表達(dá)的漆酶[20]，本研究發(fā)現(xiàn)敲除后黑色素含量降低，相反敲除后黑色素含量增加；而且敲除后對(duì)H2O2更加敏感，而不影響病菌抗氧化性，表明兩個(gè)漆酶同工酶行使不同功能。前期研究表明StLAC2和StLAC6氨基酸序列的同源性僅為36.99%[20]，因此筆者推測(cè)可能是由于蛋白同源性較低，在蛋白結(jié)構(gòu)上存在較大差異，導(dǎo)致StLAC2和StLAC6在功能上有明顯差異，有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究以明確同工酶功能差異的原因。本研究中和基因回補(bǔ)后并沒(méi)有完全恢復(fù)到野生型的表型，在菌落形態(tài)上有一定的差異，推測(cè)其回補(bǔ)時(shí)使用帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒，導(dǎo)致其表達(dá)與野生型菌株存在區(qū)別。

A：上調(diào)差異代謝物Up-regulated differential metabolites；B：下調(diào)差異代謝物Down-regulated differential metabolites

表2 主要影響的脂類差異代謝物

圖10 注釋為黃酮類代謝物的箱式圖

圖11 黑色素合成中間代謝產(chǎn)物的箱式圖

3.2 StLAC2和StLAC6通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)黑色素合成產(chǎn)生相反的影響

玉米大斑病菌能夠產(chǎn)生黑色素，黑色素在附著胞侵入寄主表皮細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[21]。DHN黑色素被認(rèn)為是重要的毒力因子，通過(guò)讓附著胞積累足夠的膨壓從而機(jī)械穿透寄主細(xì)胞，黑色素缺乏的突變菌株不能形成具有正常侵染能力的附著胞，喪失了侵染能力，最終導(dǎo)致致病性喪失[22-23]。在稻瘟病菌（）、灰葡萄孢中DHN黑色素合成以丙二酰輔酶A或乙酰輔酶A為前體物質(zhì)[24]，通過(guò)聚酮合酶催化醋酸鹽合成1, 3, 6, 8-4THN，然后經(jīng)還原酶（1, 3, 6, 8-tetra-HN reductase）催化生成小柱孢酮，在小柱孢酮脫水酶催化的下合成1, 3, 8 THN，經(jīng)還原酶（1, 3, 8-tetra-HN reductase）催化合成柱孢酮，在脫水酶的催化下合成1, 8-DHN，最后經(jīng)漆酶氧化聚合形成1, 8-DHN黑色素[25]，本文通過(guò)代謝組分析發(fā)現(xiàn)上述中間代謝物中的小柱孢酮和柱孢酮含量在中增加，表明敲除導(dǎo)致DHN合成中間代謝產(chǎn)物的積累，StLAC2直接參與了玉米大斑病菌黑色素的聚合。

磷脂類代謝物中鞘磷脂是重要的信號(hào)物質(zhì)，介導(dǎo)了肌醇磷酰神經(jīng)酰胺生成二酰甘油。有報(bào)道顯示在新生隱球菌中二酰甘油通過(guò)激活蛋白激酶C調(diào)控漆酶的表達(dá)，并且激活黑色素合成，參與致病[26]。本研究發(fā)現(xiàn)在玉米大斑病菌敲除導(dǎo)致了黑色素合成增加，通過(guò)代謝組分析發(fā)現(xiàn)缺失突變體中二酰甘油類化合物含量增加，推測(cè)其通過(guò)激活蛋白激酶C，促進(jìn)了黑色素的合成，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 StLAC2影響玉米大斑病菌抗氧化性及脂類代謝

的缺失主要影響黃酮皂苷類等多酚化合物。趙珊等[27]測(cè)定了多酚、黃酮、抗壞血酸等功能成分的含量及對(duì)應(yīng)較高的抗氧化活性，證明黃酮類多酚物質(zhì)影響甘薯葉的抗氧化能力。黃酮類差異代謝物主要在Δ中降低，如3, 7-二羥基黃酮、甘草黃酮A等，黃酮類代謝物屬于多酚類，漆酶可以催化黃酮類多酚物質(zhì)，因此推測(cè)StLAC2通過(guò)影響黃酮類物質(zhì)的合成導(dǎo)致Δ抗氧化能力下降。

前期研究表明，基因缺失突變體中線粒體數(shù)量更多，且不產(chǎn)生分生孢子[28]。線粒體的完整性依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)脂質(zhì)的攝取，線粒體在脂質(zhì)代謝中起著核心作用，并與其他細(xì)胞器如脂滴或過(guò)氧化物酶體連接[29]，線粒體是磷脂和磷脂酰甘油合成所必需的[30]，而Δ中代謝物磷脂酰甘油含量明顯增加。磷脂酰甘油類化合物是細(xì)胞膜的主要成分，而且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與病菌菌絲形態(tài)直接相關(guān)，同時(shí)對(duì)于分生孢子的形成具有重要作用[31-32]。本文通過(guò)代謝組分析發(fā)現(xiàn)敲除導(dǎo)致磷脂酰膽堿及其水解產(chǎn)物L(fēng)ysoPC含量發(fā)生不同程度的變化，表明的缺失可能通過(guò)影響磷脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)造成分生孢子的合成受到抑制。

4 結(jié)論

1, 8-二羥基萘型黑色素合成途徑的中間代謝物小柱孢酮和柱孢酮含量在?中增加，在中降低，StLAC2和StLAC6對(duì)玉米大斑病菌黑色素合成具有相反的影響；StLAC2和StLAC6差異影響玉米大斑病菌中脂類代謝物，同時(shí)的缺失造成多種黃酮多酚類代謝物下調(diào)，導(dǎo)致抗氧化性降低。

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Mechanism of StLAC2 and StLAC6 differentially affectingbased on non-targeted metabonomics analysis

ZOU JinPeng1,2, YUE HaoFeng2, LI HaiXiao1,2, LIU Zheng3, LIU Ning1,2, CAO ZhiYan1,2, DONG JinGao1,2

1College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei;2Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation, Baoding 071001, Hebei;3Academy of Educational Sciences of Baoding, Baoding 071066, Hebei

【Background】As a polyphenol oxidase, laccase plays an important role in fungal growth, development and secondary metabolism. A plurality of laccase genes are encoded in the genome of, among whichandhave differential effects on the growth, development, and pathogenicity of.【Objective】To clarify the differential mechanisms of StLAC2 and StLAC6 onand explore new targets for developing new fungicides and disease control strategies by mining differential metabolites.【Method】was connected with pHZ100-GFP plasmid by seamless cloning, and the complementary expression vector ofwas constructed. Using PEG-mediated protoplast transformation method, the constructed vector was transferred into the protoplast ofgene knockout mutant, and the positive transformants were identified by PCR, RT-qPCR and GFP fluorescence verification, and therevertant strain was successfully constructed. The effects of knocking out and revertingandon melanin synthesis and oxidation resistance in and out ofwere analyzed. Taking wild-type (WT),andgene knockout mutants as experimental materials, the differential metabolites were analyzed by non-targeted metabonomics, and the mechanism of the differential action of StLAC2 and StLAC6 was analyzed by KEGG.【Result】StLAC2 and StLAC6have differential effects on melanin synthesis in mycelium and secreted into culture medium, and StLAC2 also affects antioxidant activityof. Metabolomic analysis found that compared with the WT strain of, there were more differential metabolites in the mycelium or secreted into the culture medium after knocking out, and KEGG analysis showed that the differential metabolites were mainly lipids, especially phospholipids. Meanwhile, the absence of thecaused down-regulation of various flavonoids and polyphenols. The contents of intermediates of the 1, 8-dihydroxynaphthalene melanin biosynthesis pathway, scytalone and vermelone, significantly increased in Δand decreased in Δ.【Conclusion】TheStLAC2 participates in melanin polymerization, the StLAC6 negatively regulates melanin biosynthesis in, and the differential effects of StLAC2 and StLAC6 affect lipid metabolism and intermediates of the melanin biosynthesis pathway in. The absence ofcaused down-regulation of various flavonoids and polyphenols, leading to decreased antioxidant activity.

; laccase; metabonomics; differential metabolite; melanin

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.006

2023-05-11；

2023-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31901827，32072370）、河北省自然科學(xué)基金（C2020204039，C2021204136）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02-25）、中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金（226Z6502G）

鄒金鵬，E-mail：17338233032@163.com。通信作者劉寧，E-mail：lning121@126.com。通信作者曹志艷，E-mail：caoyan208@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）