賀丹，尤嘯龍，何松林，張明星，張佼蕊，華超，王政，劉藝平

芍藥胼胝質(zhì)合成酶基因家族鑒定及功能分析

1河南農(nóng)業(yè)大學風景園林與藝術(shù)學院，鄭州 450002；2河南科技學院園藝園林學院，河南新鄉(xiāng) 453003

【目的】CalS家族在調(diào)控植物胼胝質(zhì)合成方面具有重要作用，鑒定芍藥CalS家族成員，并進行生物信息學和表達模式分析，為芍藥屬遠緣雜交不親和研究提供依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^熒光顯微鏡觀察自交、雜交柱頭內(nèi)花粉管生長過程及花粉萌發(fā)情況；測定柱頭所含胼胝質(zhì)、內(nèi)源脫落酸含量（ABA）以及-1,3-葡聚糖酶活性；分段克隆8個并進行序列分析；使用Expasy、MEME、TBtools、MEGA 7.0等軟件和在線工具預測PlCalS家族成員蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)、保守基序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；利用qRT-PCR技術(shù)檢測8個在自交24 h、雜交24 h、雜交36 h的相對表達水平；對CalS5進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析響應不同濃度ABA處理的表達特征?！窘Y(jié)果】花粉管熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)雜交柱頭內(nèi)發(fā)生較為嚴重的胼胝質(zhì)堵塞從而影響花粉管的正常生長及花粉的萌發(fā)。測定柱頭內(nèi)胼胝質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)多數(shù)時期自交柱頭均低于同時期雜交柱頭的含量，柱頭內(nèi)-1,3-葡聚糖酶活性、ABA含量變化均具有一定的規(guī)律性。通過對結(jié)構(gòu)域的完整性分析鑒定芍藥PlCalS基因家族成員，后經(jīng)同源性比對分析命名8個，均含有15個保守基序且在PlCalS基因家族中的分布類似。多物種系統(tǒng)進化關系表明，CalS家族可分為3個分支，PlCalS家族僅分布在2個分支，其中與牡丹、擬南芥和番茄的親緣關系較近。生物信息學分析結(jié)果表明8個家族成員編碼1 745—1 951個氨基酸，原子總數(shù)為28 583—31 870個，等電點為7.99—9.13。對轉(zhuǎn)錄組FPKM值的分析表明，PlCalS家族成員在相同時期雜交處理中有較高表達，相同處理情況下在雜交36 h時高表達；熒光定量PCR表明，8個基因的相對表達量在自交24 h時均低于雜交24 h和雜交36 h。經(jīng)兩個濃度的ABA處理，發(fā)現(xiàn)對高濃度的ABA更為敏感?！窘Y(jié)論】芍藥CalS家族有8個基因成員且具有較高的保守性，8個家族成員對芍藥胼胝質(zhì)的生成起重要調(diào)控作用；大部分時期在雜交柱頭的表達量高于自交柱頭，可能參與胼胝質(zhì)異常沉積的過程；芍藥雜交柱頭異源花粉的刺激可能會增強某個ABA合成途徑，ABA可能通過正調(diào)控胼胝質(zhì)基因誘導胼胝質(zhì)的積累，從而抑制花粉的萌發(fā)與花粉管的伸長，影響授粉親和性。

芍藥屬；遠緣雜交不親和；CalS基因家族；表達分析

0 引言

【研究意義】芍藥（）與牡丹（）同為芍藥科芍藥屬，其花大色艷、花型豐富，具有很高的觀賞價值和藥用價值[1-2]。我國芍藥屬種質(zhì)資源豐富，利用其豐富的種質(zhì)資源進行組內(nèi)及組間雜交育種是改良芍藥性狀、培育新品種的主要途徑[3-4]。芍藥與牡丹的遠緣雜交后代稱為伊藤雜種，其植株花色豐富、生長旺盛、花期長、抗性強，莖干挺拔適合做切花，人們對其展開了大量的育種工作[5-7]。但是目前能夠被市場認可的伊藤雜種僅僅有數(shù)十個，主要原因是組間遠緣雜交存在嚴重的不親和現(xiàn)象[8-9]。因此，闡明芍藥屬組間遠緣雜交不親和的機理，尋找克服不親和的方法是提高芍藥屬育種效率的關鍵?！厩叭搜芯窟M展】芍藥屬遠緣雜交不親和的主要原因是花粉-柱頭無法正常識別，主要表現(xiàn)為授粉后，柱頭和花粉管中產(chǎn)生大量的胼胝質(zhì)阻礙花粉管生長，最終導致受精失敗[10-12]。在百合、杜鵑等觀賞植物中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象[13-14]。花粉管的生長與許多因素有關，細胞壁在促進花粉管完整性方面起重要作用[15]。胼胝質(zhì)是一種-1,3-葡聚多糖，存在于高等植物的細胞壁中，參與花粉外壁形成、花粉發(fā)育及花粉管生長[16-17]。在花粉管生長過程中，胼胝質(zhì)若出現(xiàn)異常沉積，花粉管頂端就會形成胼胝質(zhì)塞，阻礙花粉管頂端正常極性生長的胞吐與胞吞作用，導致花粉管生長停止[18-19]。親和花粉管與不親和的花粉管相比，親和的花粉管細胞壁較薄，染色分布均勻，胼胝質(zhì)栓塞有規(guī)律地均勻分離，而不親和的花粉管壁變厚，染色非常明亮，胼胝質(zhì)栓塞沉積[20]。胼胝質(zhì)合成酶（callose synthase，CalS）又稱葡聚糖合成酶類似物（glucan syinthase like，GSL），是控制胼胝質(zhì)合成的關鍵酶類。目前在擬南芥中鑒定出了12個胼胝質(zhì)合成酶基因，其中、、、和共5個基因參與小孢子和配子發(fā)生，從而影響花粉發(fā)育[21-22]。編碼一種直接影響花粉管胼胝質(zhì)的花粉特異性蛋白，在花粉形成過程中主要參與了胼胝質(zhì)壁的合成，將敲除或者過表達，都會導致花粉活力和育性下降[23-24]。在梨花粉管生長中，可以適度促進花粉管生長，并在實現(xiàn)受精過程中發(fā)揮重要作用，從而推測在控制梨花粉管中胼胝質(zhì)合成中起著關鍵作用[17]。在玫瑰的遠緣雜交研究中，克隆得到了一個，通過生物信息學分析初步推測很可能參與調(diào)控了玫瑰的遠緣雜交不親和性[25]。同時胼胝質(zhì)的沉積與降解會受到脫落酸（abscisic acid）、乙烯（ethylene）等激素的調(diào)控[26-27]。‘錦橙’啟動子中存在有脫落酸響應元件，經(jīng)ABA處理后該元件會結(jié)合ABA誘導的表達，從而促進胼胝質(zhì)的生成[28]?！颈狙芯壳腥朦c】芍藥遠緣雜交不親和的相關研究已有報道，但是對于其不親和的分子機制，特別是胼胝質(zhì)的產(chǎn)生與沉積及其基因家族的功能還有待研究。【擬解決的關鍵問題】本研究以芍藥自交親和與雜交不親和關鍵時期[29]的柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（NCBI登錄號：PRJNA592882）為基礎，通過生物信息學進行芍藥CalS基因家族成員的鑒定與克隆，并進行表達分析。同時探究ABA對表達的調(diào)控，為解決芍藥屬遠緣雜交不親和提供理論與技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料種植在河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種苗工程研究中心，2021年5月以芍藥品種‘粉玉奴’為母本，牡丹品種‘鳳丹白’為父本，進行‘粉玉奴’自交及‘粉玉奴’ב鳳丹白’雜交試驗。于授粉后2、4、6、8、10、12、24和36 h取自交及雜交組合的柱頭，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存，每個時間段重復采樣3次。

1.2 花粉管熒光顯微觀察與生理指標測定

授粉后8個時間段采集的自交與雜交的柱頭，經(jīng)FAA固定液固定后使用熒光顯微鏡在紫外光源下觀察花粉管生長及花粉黏附與萌發(fā)情況，具體方法參考賀丹[29]。

使用植物胼胝質(zhì)ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）測定胼胝質(zhì)含量；使用-1,3-葡聚糖酶（-1,3-GA）活性檢測試劑盒（索萊寶）測定-1,3-葡聚糖酶活性；采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定脫落酸（ABA）含量，方法參照試劑盒操作說明書，所有測定重復3次。

1.3 芍藥PlCalS的鑒定及命名

以擬南芥CalS家族的蛋白質(zhì)序列作為參考序列，與牡丹基因組數(shù)據(jù)庫、芍藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在TBtools軟件進行同源比對，篩選出含有FKS1和-1,3-葡聚糖合成酶結(jié)構(gòu)域的序列，經(jīng)NCBI Blast去除重復序列后，結(jié)合CCD在線網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）對候選基因序列進行二次篩選，確定符合條件的序列結(jié)構(gòu)完整，根據(jù)它們是否具有相應的保守結(jié)構(gòu)域，最終確定芍藥轉(zhuǎn)錄組中CalS基因家族成員的數(shù)量。根據(jù)分析結(jié)果，以基因功能為參照進行序列命名。

1.4 芍藥PlCalS的克隆

以芍藥‘粉玉奴’自交、芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與其他物種序列為基礎，使用Primer 5軟件設計擴增引物（表1）。由于PlCalS基因家族編碼區(qū)較長，全長擴增難以一次完成且成功與T載體進行鏈接，因此，以芍藥‘粉玉奴’自交24 h柱頭的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，對8條的CDS序列分段進行PCR擴增。PCR反應體系和反應程序參照賀丹等[30]。將所得產(chǎn)物電泳純化，經(jīng)檢測符合要求后存于-20 ℃冰箱。

1.5 芍藥PlCalS生物信息分析

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫（https://web.expasy.org/ protparam/）中的在線網(wǎng)頁ProtParam（https://web. expasy.org/protparam/）、TMHMM（http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和（http://www.detaibio.com/ tools/signal-peptide.html）分析氨基酸序列的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽信息；在線網(wǎng)站MEME（https://meme-suite.org/meme/）預測PlCalS家族蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域；MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 芍藥PlCalS表達分析

采用CTAB法分別提取自交24 h、雜交24、36 h柱頭的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于實時熒光定量PCR，熒光引物設計如表2所示。使用TB Green? Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara，日本），過程按照試劑盒說明書進行，反應體系、擴增程序及數(shù)據(jù)處理參照賀丹等[31]。

表1 分段擴增引物

表2 熒光定量引物序列

1.7 PlCalS5生物信息分析

使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值設置為1 000。在NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastp搜索同源序列，用DNAMAN 8.0軟件對編碼蛋白的氨基酸序列進行翻譯并分析PlCalS5氨基酸序列與其他物種CalS5氨基酸序列的同源性。

1.8 不同濃度ABA處理下PlCalS5表達情況分析

取30株芍藥‘粉玉奴’實生苗的60片成熟葉，用打孔器在避開主脈的葉片區(qū)域打下7 mm直徑的圓葉片，混合后隨機裝入錐形瓶中，分別加入無菌水、脫落酸（10 μmol·L-1、100 μmol·L-1）搖晃使葉片浸沒，之后封口，分別于處理2、4、6、8、10、12、24和36 h后進行取樣，每個時期不同處理均取3份樣品（0.2 g左右）過液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱備用。提取RNA后進行反轉(zhuǎn)錄，稀釋后用于qRT-PCR檢測，引物設計如表2所示。以同時期無菌水處理為對照組，采用2-??CT法計算植株經(jīng)ABA處理后的相對表達量。使用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并繪圖，用IMB SPSS statistics 20進行檢驗（=0.05）。

2 結(jié)果

2.1 花粉管生長情況觀察及生理指標的測定

授粉后2—12 h，自交雌蕊中的花粉管匯集呈明顯的花粉管束（圖1）；雜交雌蕊中大量花粉管扭曲、纏繞，并伴有胼胝質(zhì)堆積（圖2）。授粉后24和36 h，自交雌蕊中花粉管繼續(xù)伸長生長（圖1-G、H）；雜交雌蕊萌發(fā)的花粉管中胼胝質(zhì)堆積嚴重（圖2-G、H）。

授粉后自交柱頭的胼胝質(zhì)含量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖3），在授粉后4 h達到最大值，36 h下降到最低值。雜交柱頭的胼胝質(zhì)含量整體呈上升趨勢，在6 h后稍微下降，隨后升高，在24 h達到最高值。同時間段對比自交與雜交的胼胝質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，前期自交高于雜交，在4 h后雜交胼胝質(zhì)含量上升較快，顯著高于自交。

授粉后自交柱頭的?1,3-葡聚酶含量整體呈上升趨勢，在授粉后24 h達到最大值。雜交柱頭的?1,3-葡聚酶含量整體也呈上升趨勢，在8 h后略微下降，隨后升高，在24 h達到最高值。同時間段自交與雜交的?1,3-葡聚酶含量對比發(fā)現(xiàn)，前期差異不大，6 h后，雜交?1,3-葡聚酶含量上升較快，顯著高于自交（圖4）。

授粉后自交柱頭ABA含量整體呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，在授粉后12 h達到最高值。雜交柱頭的ABA含量整體呈上升趨勢，在10 h時有所下降，隨后升高，在24 h達到最高值。同時間段對比自交和雜交ABA含量發(fā)現(xiàn)，前期自交與雜交相差不顯著，在24 h后雜交ABA含量上升，顯著高于自交（圖5）。

Pg：花粉粒；Cs：胼胝質(zhì)；Pt：花粉管。A：2 h；B：4 h；C：6 h；D：8 h；E：10 h；F：12 h；G：24 h；H：36 h。下同

2.2 芍藥PlCalS的鑒定

從芍藥柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到8條編碼胼胝質(zhì)合成酶基因的序列，根據(jù)分析結(jié)果將8條芍藥命名為、（GeneBank登錄號為：OM988002、OM988003、OM988004、OM988005、OM988006、OM988007、OM988008、OM988009）。對基因的表達量聚類分析，發(fā)現(xiàn)這8個基因在9個樣品中均顯示表達差異（圖6），自交24 h與雜交24 h相比，該家族基因在雜交柱頭中的表達量高于自交柱頭；雜交24 h與雜交36 h相比，該家族基因的表達量隨時間延長而增高，其中上調(diào)表達趨勢較為明顯。

2.3 芍藥PlCalS克隆與序列分析

從芍藥柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到、的基因序列，設計引物進行驗證。經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序，結(jié)果表明、的開放閱讀框分別為5 841、5 238、5 856、5 748、5 733、5 712、5 349和5 343 bp。

圖4 柱頭授粉后β?1,3-葡聚酶含量變化

圖5 柱頭授粉后ABA含量變化

2.4 芍藥PlCalS的生物信息學分析

2.4.1 編碼蛋白的理化性質(zhì) 經(jīng)克隆驗證8條芍藥PlCalS家族基因編碼蛋白1 780—1 951 aa，原子總數(shù)和等電點范圍分別為28 583（）—31 870（）、7.99（）—9.13（），其不穩(wěn)定性系數(shù)在36.40（）—42.27（），除外，其他均為親水性蛋白。這8條均存在跨膜區(qū)，但沒有信號肽切割位點（表3）。8個PlCalS蛋白都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

2.4.2 蛋白結(jié)構(gòu) 利用SMART網(wǎng)站對PlCalS家族進行注釋，發(fā)現(xiàn)PlCalS家族較為保守，所有成員含有相同的Motif 1—15；8個都包含Glucan_synthase結(jié)構(gòu)域和FKS1結(jié)構(gòu)域，只有、和含有Vta1結(jié)構(gòu)域（圖7）。

PL0101、PL0102、PL0103分別為自交24 h芍藥柱頭測序樣品的3個生物學重復；PL0201、PL0202、PL0203為雜交24 h柱頭的3個重復；PL0301、PL0302、PL0303為雜交36 h的3個生物學重復

表3 PlCalS家族基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

圖7 芍藥PlCalS蛋白的保守Motif分析

2.4.3 進化分析 CalS家族系統(tǒng)進化樹由36條序列組成，其中芍藥、牡丹、葡萄均為8條，擬南芥12條。牡丹、擬南芥和葡萄在3個分支均有出現(xiàn)，芍藥只出現(xiàn)在兩個分支中。其中、、與的親緣關系較近（圖8）。

2.5 芍藥PlCalS在不同柱頭不同時期的表達分析

除外，其余7個基因在3個時期雜交處理的相對表達量均高于自交時期；其中、、、在相同時期時，自交柱頭的相對表達量低于雜交柱頭；在相同的雜交柱頭中，基因的相對表達量隨時間變長而增高（圖9）。

2.6 PlCalS5的生物信息學

在NCBI比對出與芍藥PlCalS5蛋白序列相似度排名前九的植物，并下載9個物種的CalS5蛋白序列，從牡丹基因組中篩出牡丹PsCalS5的蛋白序列，多序列比對結(jié)果如圖10所示。表明芍藥PlCalS5與牡丹PsCalS5蛋白質(zhì)的相似度最高，且各序列之間差異性不大，推斷它們的功能相似或接近。MEME在線軟件共鑒定出3個相同的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域。

在NCBI中下載葡萄、番瓜、黃瓜、麻花、山茶、山荊子、白櫟、蘋果和河岸葡萄9個物種的CalS5蛋白序列，從牡丹基因組中篩出牡丹PsCalS5的蛋白序列，以11個物種的CalS5蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖11）。結(jié)果表明芍藥PlCalS5與牡丹PsCalS5親緣關系最近。

2.7 不同濃度ABA處理下的PlCalS5表達

經(jīng)過ABA兩個濃度（10和100 μmol·L-1）處理后，的相對表達量如圖12所示，除了2和4 h外，在6、8、10和12 h處理中，的表達量均高于同時期的對照處理。而在24和36 h，對ABA的處理敏感，在10 μmol·L-1濃度的ABA處理中分別達到同期對照的3.4倍與5.4倍（圖12-A），在100 μmol·L-1濃度的ABA處理中分別達到同期對照的4.5倍與12.0倍（圖12-B）。

3 討論

3.1 花粉管熒光顯微觀察與生理指標分析

胼胝質(zhì)在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，參與了植物的胞間連絲和篩孔調(diào)控、花粉發(fā)育、維管分化、胞質(zhì)分裂過程中的細胞板形成等過程[32-33]。胼胝質(zhì)的異常沉積會導致花粉管出現(xiàn)生長緩慢、扭曲纏繞、生長無方向性等現(xiàn)象[10]，?1,3-葡聚糖酶具有降解胼胝質(zhì)的功能[34-35]。本研究在芍藥自交與雜交的花粉管萌發(fā)熒光觀察中發(fā)現(xiàn)，雜交雌蕊花粉管相對于自交會伴有胼胝質(zhì)的沉積而使花粉管堵塞、扭曲、纏繞，在其他觀賞植物中也有類似現(xiàn)象[36-37]。授粉后，發(fā)現(xiàn)4 h時胼胝質(zhì)及?1,3-葡聚糖酶含量隨時間的延長而升高，這可能是由于授粉后花粉的萌發(fā)生長中需要大量的胼胝質(zhì)形成花粉管壁。隨胼胝質(zhì)含量的升高，?1,3-葡聚糖酶含量也升高，使胼胝質(zhì)的含量處于合適的范圍以促進花粉壁的形成[38]；4 h后自交柱頭內(nèi)胼胝質(zhì)和?1,3-葡聚糖酶的含量變化趨于平穩(wěn)，而雜交柱頭胼胝質(zhì)含量開始增加且顯著高于自交，這可能是雜交不親和柱頭內(nèi)胼胝質(zhì)含量的快速增加影響花粉管的正常生長，需要降解部分胼胝質(zhì)來促進花粉管的正常生長，因此會導致?1,3-葡聚糖酶含量增加，但?1,3-葡聚糖酶的增加速度低于胼胝質(zhì)合成的速度，所以未能降解過多的胼胝質(zhì)，使胼胝質(zhì)在花粉管中異常沉積。

圖11 芍藥PlCalS5與其他物種CalS5系統(tǒng)進化樹

A: 10 μmol·L-1ABA; B: 100 μmol·L-1ABA

3.2 芍藥PlCalS的基因序列及表達模式分析

CalS家族基因在植物中參與許多重要的生理過程，已在許多物種中被鑒定[22,39]。本研究在芍藥柱頭轉(zhuǎn)錄組中鑒定并命名了8個，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)為1 745—1 951 aa，與玉米中編碼的蛋白質(zhì)大小類似[40]。對牡丹、擬南芥、葡萄和芍藥的CalS蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)該基因家族可分為3個分支，其中、、與親緣關系較近。擬南芥在花粉管伸長過程中參與了胼胝質(zhì)屏障和花粉管壁的形成[41]，與位于同一分支且同源性較高，推測也可能參與芍藥柱頭花粉管的生長。作為胼胝質(zhì)合成的關鍵基因，基因編碼一個具有多個跨膜結(jié)構(gòu)的大蛋白，通常包括Vta1、FKS1和Glucan_synthase三個結(jié)構(gòu)域[22]。Motif結(jié)構(gòu)分析表明該家族成員較為保守，8個成員包含-1,3-葡聚糖合成酶結(jié)構(gòu)域和FKS1結(jié)構(gòu)域這兩個典型的保守結(jié)構(gòu)域，只有、和含有Vta1結(jié)構(gòu)域，推測CalS基因家族可能在進化中變化較少且功能穩(wěn)定。胼胝質(zhì)合成酶基因通過調(diào)節(jié)胼胝質(zhì)沉積在植物生長發(fā)育過程中起著關鍵作用[42]。大部分會調(diào)控花藥中胼胝質(zhì)的沉積，以促進花粉的正常發(fā)育[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，篩選出的8個在雜交組合不同時期的基因表達量均高于自交組合（除外），可能增加了胼胝質(zhì)的合成，從而使雜交柱頭中出現(xiàn)胼胝質(zhì)堆積，影響了花粉管的生長。

不同植物中的作用不同，但參與胼胝質(zhì)合成的功能是保守的[43-44]。目前關于的功能已在多個物種中有所研究，擬南芥中花粉壁發(fā)育的四分體時期需要大量胼胝質(zhì)的合成，突變后會破壞雄性減數(shù)分裂過程中胼胝質(zhì)的沉積，導致無法形成正常的花粉壁[38,45]；水稻中的在合成小孢子的胼胝壁、調(diào)節(jié)花粉活力和決定雄性育性方面起著至關重要的作用[39]；梨中的會通過控制胼胝質(zhì)的合成來維持花粉管的正常生長[17]。編碼一種直接影響花粉管胼胝質(zhì)的花粉特異性蛋白，調(diào)控花粉發(fā)育階段到花粉管伸長階段的胼胝質(zhì)合成[46]，是芍藥中唯一與同源的基因，且具有合適的蛋白定位，因此推測在芍藥遠緣雜交不親和的胼胝質(zhì)沉積中起了重要作用。在雜交后24 h表達量較高，同時在這個時期，花粉管中產(chǎn)生了大量的胼胝質(zhì)，由此推測的高表達造成胼胝質(zhì)大量沉積，使花粉管生長堵塞、扭曲、纏繞。

3.3 ABA調(diào)控胼胝質(zhì)基因誘導胼胝質(zhì)的沉積

ABA也會通過信號通路調(diào)控胼胝質(zhì)的沉積與降解[47]。Liu等[48]發(fā)現(xiàn)ABA可誘導作物胼胝質(zhì)合成酶活性增加，同時抑制-1,3-葡聚糖酶水平，促進胼胝質(zhì)沉積。ABA不僅通過影響胼胝質(zhì)合成酶基因的表達調(diào)控胼胝質(zhì)的沉積，還會影響授粉親和性。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)雜交柱頭ABA的含量顯著高于自交柱頭，并且高含量的ABA會抑制柱頭上花粉的萌發(fā)，從而抑制花粉管的生長以影響授粉親和性[30]，本研究施用不同濃度ABA處理后，發(fā)現(xiàn)對高濃度ABA更為敏感，且發(fā)現(xiàn)雜交柱頭ABA含量處于高水平，由此推測在芍藥的雜交柱頭中，異源花粉的刺激可能會增強某個ABA合成途徑，ABA可能通過正調(diào)控胼胝質(zhì)基因誘導胼胝質(zhì)的沉積，從而抑制花粉的萌發(fā)與花粉管的伸長，以進一步影響授粉的親和性。

4 結(jié)論

從芍藥柱頭轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出8個PlCalS基因家族成員，均含有完整FKS1及-1,3-葡聚糖合成酶保守結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進化分析將PlCalS聚類在2個亞族。芍藥PlCalS家族成員的蛋白保守基元類似，且具有較高的保守性。8個基因在自交和雜交的不同處理中均出現(xiàn)差異表達，其中在雜交處理中的表達量較自交處理顯著上調(diào)，可能與雜交不親和性有關。在不同濃度的ABA誘導下，對高濃度的ABA表現(xiàn)得更為敏感，其可能通過正調(diào)控胼胝質(zhì)基因從而誘導胼胝質(zhì)的沉積，影響授粉的親和性，參與雜交不親和過程。

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Identification of Callose Synthetase Gene Family and Functional Analysis of

HE Dan1,2, YOU XiaoLong1, HE SongLin1,2, ZHANG MingXing1, ZHANG JiaoRui1, HUA Chao1, WANG Zheng1, LIU YiPing1

1College of Landscape Architecture and Art, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2College of Horticulture Landscape Architecture, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, Henan

【Objective】 The CalS family plays an important role in regulating callose synthesis in plants. In this study, the members of the CalS family were identified and their bioinformatics and expression patterns were analyzed, which provided an evidence for distant cross incompatibility of(). 【Method】The pollen germination and tube growth in self- and cross-pollinated stigma were observed by fluorescence microscope. The callose content, endogenous Abscisic acid (ABA) content and-1,3-glucanase activity in stigma were measured. Eight members of the CalS family were cloned, and Expasy, MEME, TBtools, MEGA 7.0 and so on were used to predict the basic physicochemical properties and conserved motifs of proteins of thefamily members and to construct a phylogenetic evolutionary tree. The expression of eightin stigma at 24 h of self-pollination, 24 h of cross-pollination and 36 h of cross-pollination were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Multiple sequence alignment ofwas performed, a phylogenetic tree was constructed, and the expression characteristics of【Result】Fluorescence microscopic observation of pollen tube showed that callose plugging occurred in the stigma of hybrid, which restricted the pollen germination and tube growth. Callose content in cross-pollinated stigma was found to be higher in most periods than that in self-pollinated stigma. Then, the callose activity of-1,3-glucose and ABA content in stigma with different pollination affinity showed regular differences. The members of thefamily ofwere identified and named by integrity analysis of the structural domains and sequence matching, and 15 conserved motifs with stable distribution in thefamily were encoded by every eight genes. Multi-species phylogenetic relationships showed that thefamily could be divided into three branches, with thefamily distributed in only two branches, of whichwas more closely related to,and. The bioinformatics analysis showed that the eight family members encoded 1 745-1 951 amino acids, with a total number of 28 583-31 870 atoms and isoelectric points of 7.99-9.13. The analysis of the FPKM values in transcriptome showed that thePlCalS family members were highly expressed in the same period of hybridization and at 36 h of hybridization under the same treatment. qRT-PCR showed that the relative expression levels of 8 genes at 24 h of self-pollination were lower than those at 24 h and 36 h of cross-pollination. In addition, thegene was found to be more sensitive to high ABA treatment. 【Conclusion】 There were eight gene members in the CalS family of, which played an important role in regulating the callose formation of. The expression level of thegene in cross-pollinated stigma was higher than that in self-pollinated stigma in most periods, which might be involved in callose abnormal deposition. Heterologous pollen stimulation to the stigma ofcould enhance a certain ABA synthesis pathway. ABA induced callose deposition by positively regulating the expression of callose synthesis genes, thus inhibiting pollen germination and tube elongation, and finally affecting pollination compatibility.

; distant hybridization incompatibility; CalS gene family; gene expression analyses

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.011

2023-01-09；

2023-04-27

國家自然科學基金（31600568，31870698）、河南省自然科學基金（232300420006）、河南省高等學校重點科研項目（23A220001）

賀丹，E-mail：dandan990111@163.com。通信作者何松林，E-mail：hsl213@yeah.net

（責任編輯 趙伶俐）