王曉忠 李 娜 王芊蔚 黃瑞哲 張月嬌

Fas 通過死亡域關(guān)聯(lián)（fas-associating with death domain protein，F(xiàn)ADD）在細胞凋亡信號通路中扮演關(guān)鍵角色，是由腫瘤壞死因子受體超家族介導(dǎo)的。FADD 與Fas分子胞質(zhì)區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可促進凋亡信號的傳遞，形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。FADD 基因在肺癌、肝細胞癌、乳腺癌的進展存在密切聯(lián)系，過度表達可導(dǎo)致腫瘤的進展及預(yù)后不良。腫瘤中FADD 的作用主要表現(xiàn)為促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，過度表達可增強腫瘤細胞的凋亡抵抗性，從而促進腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，因此，F(xiàn)ADD已成為腫瘤治療的重要靶點之一。深入研究FADD的分子機制，有助于揭示腫瘤發(fā)生的機制，為腫瘤的治療提供新的思路和方法[1～7]。根據(jù)目前的報道，F(xiàn)ADD 基因在程序性死亡過程中扮演關(guān)鍵角色，它通過調(diào)控半胱氨酸酶8 和蘇氨酸蛋白激酶1 基因的表達水平[8～10]，激活NF-κB，促進促炎細胞因子和趨化因子的釋放，從而促進腫瘤炎癥浸潤和進展。FADD 基因的Ser194 位點磷酸化降低與化療耐藥性和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且還能形成炎癥小體。目前對FADD 基因在泛癌研究方面的了解仍然很有限[11，12]，此外，F(xiàn)ADD 基因在腫瘤免疫細胞中的作用也還不清楚。本研究利用頭頸鱗狀細胞癌的數(shù)據(jù)對FADD 基因進行了綜合分析，以明確該基因在頭頸鱗狀細胞癌中的預(yù)后影響。

資料與方法

1. FADD基因在人類泛癌組織中的表達水平

下載來自于GTEx 數(shù)據(jù)庫和TCGA 數(shù)據(jù)庫的表達譜數(shù)據(jù)，其來源于33 種不同類型的癌癥和癌旁正常組織的原始數(shù)據(jù)，包括腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)，宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結(jié)腸癌(COAD)、彌漫性大B 細胞淋巴瘤(DLBC)、食管癌(ESCA)、多形成性膠質(zhì)細胞瘤(GBM)、腦低級別膠質(zhì)瘤(LGG)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、腎透明細胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、急性髓細胞樣白血病(LAML)、肝細胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、間皮瘤(MESO)、卵巢漿液性囊腺癌(OV)、胰腺腺癌(PAAD)、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、肉瘤(SARC)、皮膚黑素瘤(SKCM)、胃癌(STAD)、甲狀腺癌(THCA)、胸腺癌(THYM)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)、子宮肉瘤(UCS)和葡萄膜黑色素瘤(UVM)。所有表達譜文件均為通過log2 轉(zhuǎn)換進行標(biāo)準(zhǔn)化，提取頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)組織中FADD 基因表達水平。

2. FADD基因的預(yù)后分析

應(yīng)用R語言“survminer”進行生存分析，F(xiàn)ADD基因在頭頸鱗狀細胞癌中的預(yù)后指標(biāo)進行相關(guān)分析，應(yīng)用單因素生存分析計算風(fēng)險比及95%置信區(qū)間，根據(jù)FADD 基因的高、低分組繪制Kaplan-Meier 曲線，評價FADD 基因的高、低分組對生存差異(OS、DSS、PFS)的影響。

3. 腫瘤突變負荷與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)性分析

UCSC Xena(http://xena.ucsc.Edu/)下載TCGA 數(shù)據(jù)庫中33 種癌癥類型的突變數(shù)據(jù)，利用Perl 腳本根據(jù)腫瘤突變負荷定義計算每個樣品的腫瘤突變負荷（TMB）。應(yīng)用斯皮爾曼相關(guān)分析計算頭頸鱗狀細胞癌中腫瘤突變負荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與FADD 基因表達相關(guān)性。結(jié)果以R語言中“fmsb”包繪制雷達圖（***P＜0.001;**P＜0.01;*P＜0.05）。

4. FADD基因和腫瘤免疫浸潤的相關(guān)性分析

下載來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的33種癌癥與癌旁正常組織的表達譜數(shù)據(jù)集，應(yīng)用“Immuneeconv”R 包，集成TIMER 和xCell 兩種算法，對FADD 表達譜文件和FADD 在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中的免疫浸潤進行評估，F(xiàn)ADD 基因表達水平以log2 TPM 值展示。采對FADD 基因和免疫檢查點進行斯皮爾曼相關(guān)分析。應(yīng)用R 語言“heatmap”R 包繪制熱圖。隨后應(yīng)用TIMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome. shinyapps. io/timer/），對HNSCC行腫瘤免疫浸潤評估及分析。

5. 多因素COX回歸分析

使用TCGA portal 分析FADD 基因?qū)︻^頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的FADD 基因、年齡、性別、種族、臨床分期、腫瘤純度，總生存期等臨床數(shù)據(jù)，進行多因素COX 回歸分析，分析HNSCC 中FADD 基因表達水平與臨床參數(shù)的關(guān)系。

6. 免疫組化驗證

2021 年1 月至2022 年12 月，經(jīng)陜西省咸陽市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者自愿簽署知情同意書。采用隨機數(shù)字表法收集頭頸鱗狀細胞癌患者30 例。總共60 個樣本包括癌和癌旁健康組織。術(shù)后病理檢查主要記錄腫瘤大小、分化程度、TMN 分期、FADD 免疫組化數(shù)據(jù)，從術(shù)后出院開始隨訪，時間為4～6個月。

主要試劑：不同濃度梯度的乙醇、PBS 緩沖液、3%過氧化氫、10%正常山羊血清、0.01 M 檸檬酸緩沖液、二甲苯，抗體由馬克西姆生物科技有限公司提供，產(chǎn)地為中國福州。DAB 顯色液（目錄號AR 1022）購自中國武漢博斯特生物科技有限公司。FADD 抗體（1：500；目錄號CY7126)，購自上海泊灣生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)親和純化山羊抗兔IgG(1:20 00；目錄號sa00001-2)，購自中國武漢博斯特生物科技有限公司。

主要實驗步驟：①石蠟切片，脫蠟至水。②抗原修復(fù)。用檸檬酸緩沖液修復(fù)高壓抗原，空氣注入高壓鍋2 分鐘，冷卻至室溫。③3%H2O2室溫孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。④5%BSA 室溫孵育30 分鐘，阻斷非特異性抗原反應(yīng)。⑤加入一抗工作液稀釋一抗，稀釋倍數(shù)為1:500，1%BSA。4℃孵育過夜，然后用PBS 緩沖液洗3 次，每次3 分鐘。⑥每節(jié)加2 滴稀釋比1:2000,1%牛血清白蛋白稀釋室溫孵育30 分鐘。PBS 沖洗3 次，每次3 分鐘。⑦DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，并用中性樹脂密封。

7. 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS22.0 軟件和Rx64 3.6 軟件，頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)的癌組織與癌旁正常組織之間的FADD 基因差異表達采用t檢驗Kaplan-Meier 生存分析采用Log-rank 檢驗法，對于頭頸鱗狀細胞癌的生存分析評價，使用Cox 比例風(fēng)險模型計算HR 和p值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。臨床病理相關(guān)分析采用logistic 回歸分析，生存分析應(yīng)用Kaplan Meier 檢驗。FADD 在顯微鏡下觀察實驗結(jié)果，并在相同條件下拍照進行后續(xù)分析。FADD 陽性信號位于細胞質(zhì)和細胞核上，蘇木精染色后，治療組呈棕黃色，呈強陽性信號。陽性細胞數(shù)＜10%為陰性，陽性細胞數(shù)＞10%為陽性，P值＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1. FADD基因在33種癌癥中的差異表達分析

在TCGA portal 數(shù)據(jù)庫（www.tcgaportal.org)中，F(xiàn)ADD 基因在腫瘤組織中表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05，圖1、圖2）。FADD 基因在18 種惡性腫瘤中過度表達（圖2）；FADD 基因在BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSCC-HPVpos、HNSCC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ、SKCM、STAD、THCA、UCEC 癌癥譜中異常高表達，其中FADD 基因在頭頸鱗狀細胞癌中最顯著：HNSCC（P=3.05E-23）。

圖1 FADD基因在33種癌癥中的表達水平

圖2 FADD基因在33種癌組織中與癌旁正常組織的差異表達***P＜0.001;**P＜0.01; *P＜0.05

2. FADD 基因?qū)︻^頸鱗狀細胞癌的OS、DSS、PFS三項預(yù)后指標(biāo)的影響

在頭頸鱗狀細胞癌中，對FADD 基因表達水平和生存指標(biāo)包括總生存率（overall survival，OS）、疾病特異性生存期（disease specific survival，DSS）、無進展生存期（progression-free survival，PFS）進行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，在總生存率方面，頭頸鱗狀細胞癌中FADD 基因高表達組的總生存率顯著低于FADD 基因低表達組（P＜0.05，圖3A）。此外，F(xiàn)ADD基因?qū)NSCC（P＜0.05）的疾病特異性生存期有顯著影響，即FADD 基因高表達組，相對于低表達組在頭頸鱗狀細胞癌中疾病特異性生存期較短（P＜0.05，圖3B）。在無進展生存期方面，F(xiàn)ADD 基因?qū)NSCC（P＜0.05）的無進展生存期有顯著影響，既FADD 基因高表達組的無進展生存期顯著低于FADD 基因低表達組（P＜0.05，圖3C）。Cox回歸模型分析表明，F(xiàn)ADD 基因的高表達是包括HNSCC 在內(nèi)的8種腫瘤類型患者OS 的危險因素（圖4）。在頭頸鱗狀細胞癌中，F(xiàn)ADD 基因的表達與OS（圖4）、DSS（圖5）、PFS（圖6）顯著相關(guān)。

圖3 頭頸鱗狀細胞癌中，F(xiàn)ADD基因高、低風(fēng)險組對HNSCC的總生存率（P=0.005）、疾病特異性生存期（P=0.042）、無進展生存期（P=0.037）均有顯著影響(P＜0.05)

圖4 COX比例風(fēng)險模型揭示FADD基因?qū)NSCC總生存率有顯著影響(P＜0.001)

圖5 COX比例風(fēng)險模型揭示FADD基因?qū)NSCC疾病特異性生存期的差異影響(P＜0.01)

圖6 COX比例風(fēng)險模型揭示FADD基因?qū)NSCC無進展生存期的差異影響(P＜0.05)

COX 比例風(fēng)險模型揭示，F(xiàn)ADD 基因?qū)NSCC的總生存率有顯著影響（P＜0.001，圖4 所示）。FADD 基因?qū)NSCC（P=0.009）的疾病特異性生存期有顯著影響（P＜0.01，圖5 所示）。FADD 基因?qū)NSCC 的無進展生存期有顯著影響（P＜0.05，圖6所示）。

3. FADD 基因突變與腫瘤突變負荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的相關(guān)性分析

利用UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（https://xena.ucsc.edu/）下載TCGA 數(shù)據(jù)庫中33 種腫瘤類型的突變數(shù)據(jù)，進一步分析FADD 基因突變與腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的相關(guān)性，結(jié)果表明包括頭頸部鱗狀細胞癌在內(nèi)的10種腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定型與FADD 基因突變存在顯著相關(guān)性。頭頸部鱗狀細胞癌的微衛(wèi)星不穩(wěn)定型與FADD 基因突變呈明顯相關(guān)（P＜0.05），與FADD 基因突變呈正相關(guān)，其余腫瘤則與FADD 基因突變呈負相關(guān)（圖7A）。再對FADD 基因突變與泛癌的腫瘤突變負荷進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示FADD 基因突變對頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤突變負荷無顯著影響（P＞0.05，圖7B）。

圖7 FADD基因突變與腫瘤突變負荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的相關(guān)性分析

4. FADD 基因與頭頸部鱗狀細胞癌的免疫浸潤分析

將FADD 基因表達譜數(shù)據(jù)與免疫增強劑之間進行斯皮爾曼相關(guān)性分析，結(jié)果顯示頭頸部鱗狀細胞癌中FADD 基因的表達水平與CD276 的表達水平成正相關(guān)，而與CD27浸潤水平呈負相關(guān)（圖8A），具體而言，與TGFB1（R=0.341）、CD276（R=0.42）的表達水平呈正相關(guān)。FADD 的表達水平與CD27（R=-0.215）的表達水平呈負相關(guān)（圖8B），從而說明FADD 在調(diào)節(jié)免疫細胞浸潤和免疫增強劑的功能中發(fā)揮重要作用。

圖8 FADD基因在泛癌的免疫浸潤

5. 多因素COX回歸分析

研究納入下列指標(biāo)：FADD 基因、年齡、性別、種族、臨床分期、腫瘤純度，應(yīng)用多因素Cox分析，研究發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗狀細胞癌中，F(xiàn)ADD 基因、年齡和腫瘤分期（stageⅣ）都被確定為危險因素，即與較短的總生存期相關(guān)（P＜0.05）。這意味著FADD 基因的差異表達量、年齡較大以及腫瘤處于較晚期（stageⅣ）都會對頭頸鱗狀細胞癌患者的預(yù)后產(chǎn)生不良影響。

6. FADD 基因在頭頸部鱗狀細胞癌中免疫細胞浸潤分析

研究發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）與FADD基因的差異表達之間存在密切相關(guān)。此外，通過分析腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和腫瘤突變負荷等指標(biāo)，也發(fā)現(xiàn)了HNSCC 與FADD 基因的密切相關(guān)性。進一步應(yīng)用TIMER 數(shù)據(jù)庫對HNSCC 中FADD 基因表達水平，與免疫浸潤細胞之間的關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)特定的免疫細胞亞型與HNSCC 密切相關(guān)（圖9A-C）。具體而言，F(xiàn)ADD 基因的表達與靜息CD4 T 細胞、M0巨噬細胞、中性粒細胞浸潤、樹突狀細胞呈正相關(guān)（圖9D），而與CD8 T 細胞、B 細胞呈負相關(guān)（圖9D）。HNSCC 這些結(jié)果表明FADD 基因在HNSCC 的發(fā)生和免疫浸潤中可能發(fā)揮重要的作用。

圖9 HNSCC免疫細胞浸潤狀況及FADD基因與細胞亞型的相關(guān)分析

7. 免疫組織化學(xué)驗證

研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ADD 基因染色呈陽性，棕黃色顆粒位于細胞核、細胞質(zhì)。相比于陰性對照組(0.1 mol/L PBS)，陽性表達率在腫瘤細胞中明顯高于正常的頰黏膜(圖10)，此外，F(xiàn)ADD 基因的高表達與HNSCC組織以及預(yù)后較差相關(guān)。

圖10 FADD在正?？谇唤M織、頰黏膜中分化鱗狀細胞癌、舌根鱗狀細胞癌的差異表達

表1 納入HNSCC的臨床參數(shù)指標(biāo)、FADD基因表達量進行多元回歸分析

討論

FADD 基因作為腫瘤壞死因子受體超家族介導(dǎo)的傳遞凋亡信號，是細胞壞死的負調(diào)控關(guān)鍵基因，其作為死亡受體和啟動caspase-8/caspase-10 之間的橋梁，可以介導(dǎo)與死亡受體和caspases 的相互作用，誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。有研究使用了Lasso Cox 回歸分析模型來構(gòu)建頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）中自噬相關(guān)基因（ARGs）的預(yù)測模型[13]。研究發(fā)現(xiàn)FADD的免疫組化過表達與HNSCC 患者的總生存期風(fēng)險比增加密切相關(guān)[14]。然而，該研究缺乏免疫組織化學(xué)評估，研究建議在HNSCC 的預(yù)后評估中應(yīng)考慮應(yīng)用FADD 過表達的免疫組織化學(xué)評估。此外，通過比較來自GEO 數(shù)據(jù)集的HPV 陽性和HPV 陰性HNSCC患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究確定了與HPV相關(guān)的標(biāo)志物。研究選了7 個與HPV 陽性相關(guān)的標(biāo)志物，包括CDKN2A，CELSR3，DMRTA2，SERPINE1，TJP3，F(xiàn)ADD 和IGF2BP2[15]。這些標(biāo)志物可能有助于預(yù)測HPV 陽性HNSCC 患者的預(yù)后。在已經(jīng)發(fā)表的研究中，在HNSCC 研究中，F(xiàn)ADD 構(gòu)建的聯(lián)合模型的預(yù)后價值已經(jīng)被研究，但其單個基因在HNSCC 預(yù)后評估中的研究仍未展開。本研究通過應(yīng)用GTEx數(shù)據(jù)庫和TCGA 數(shù)據(jù)庫中HNSCC 的表達譜文件，研究FADD 基因在該癌癥中的預(yù)后價值。結(jié)果表明，F(xiàn)ADD 基因可作為一種用于預(yù)測HNSCC 患者預(yù)后的標(biāo)志物，并與腫瘤免疫浸潤細胞的類型相關(guān)聯(lián)。FADD 基因是HNSCC 中一種被研究廣泛的基因，不僅在HNSCC 的發(fā)生過程中起到重要的作用，而且在該癌癥的預(yù)后中也具有重要意義。本項研究證明，F(xiàn)ADD 基因在HNSCC 的預(yù)后中具有非常顯著的價值，其基因表達水平能夠預(yù)測HNSCC患者的預(yù)后。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability, MSI)是一種基因組異常，常見于各種癌癥。FADD 蛋白參與細胞對外部應(yīng)激信號的反應(yīng)，激活程序性細胞死亡途徑。目前的研究表明，F(xiàn)ADD 基因的突變與淋巴瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌等多種癌癥相關(guān)[16～19]，而且目前發(fā)現(xiàn)FADD 基因突變可能與結(jié)直腸癌的MSI 相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，與微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）結(jié)直腸癌相比，MSI 結(jié)直腸癌中FADD 基因的表達水平較低[20]，這一觀察結(jié)果暗示FADD 可能在調(diào)節(jié)癌細胞微衛(wèi)星穩(wěn)定性中發(fā)揮作用。進一步的研究表明，F(xiàn)ADD 與錯配修復(fù)系統(tǒng)（MMR）之間存在功能關(guān)系。MMR 是一種DNA 修復(fù)機制，對維持微衛(wèi)星的穩(wěn)定性起著重要作用。一些研究報道表明，F(xiàn)ADD 通過促進MMR 向細胞核的募集參與了MMR 功能的調(diào)節(jié)。FADD 基因的敲除導(dǎo)致MMR 蛋白的表達減少，從而導(dǎo)致MSI。除了結(jié)直腸癌，MSI 和FADD 突變也與乳腺癌、胃癌和淋巴瘤有關(guān)[21]。總之，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）與FADD 基因的突變和表達水平低有關(guān)，F(xiàn)ADD 基因可能通過調(diào)節(jié)微衛(wèi)星穩(wěn)定性參與癌細胞的形成。FADD 基因與頭頸癌MSI 的關(guān)系尚未被充分研究，需要進一步的研究來確定它們之間的關(guān)聯(lián)。

有研究提示FADD 可能參與了口腔癌的免疫調(diào)節(jié)，與自噬有關(guān)[22]。FADD 是死亡受體介導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵受體蛋白，與先天免疫、炎癥和癌癥的發(fā)生有關(guān)[23]。有研究應(yīng)用基因集富集分析顯示，F(xiàn)ADD相關(guān)基因顯著富集于免疫相關(guān)通路。相關(guān)性分析顯示FADD 的上調(diào)與口腔癌的低生存率和免疫浸潤相關(guān)[22]。相對于CD276 基因低表達，CD276 基因高表達已被證實癌癥患者的預(yù)后不良，CD276 在腫瘤中參與調(diào)控細胞增殖、凋亡、侵襲、細胞周期、細胞分化、細胞自噬、充質(zhì)轉(zhuǎn)化。瓦伯格效應(yīng)（Warburg Effect）也是由CD276促進的。本研究觀察CD276在HNSCC 腫瘤高表達，F(xiàn)ADD 表達量的增加與CD276呈正相關(guān)，也發(fā)現(xiàn)FADD 表達增加與CD27 呈負相關(guān)，而CD27通過局部共刺激在T 細胞活化中起關(guān)鍵作用信號，被認(rèn)為是腫瘤治療中的免疫調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點[24]。一些研究表明，F(xiàn)ADD 基因可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫細胞的功能來影響HNSCC 預(yù)后。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)FADD 基因水平與HNSCC 中腫瘤免疫浸潤細胞靜息CD4 T 細胞、M0 巨噬細胞、中性粒細胞浸潤、樹突狀細胞呈正相關(guān)，而與CD8 T細胞、B細胞呈負相關(guān)。這一結(jié)果表明FADD 基因在調(diào)節(jié)腫瘤免疫系統(tǒng)中具有重要的作用，從而影響HNSCC 患者的預(yù)后?？傊?，F(xiàn)ADD 基因在HNSCC 的預(yù)后中具有顯著價值，該研究為HNSCC 患者的治療提供了新思路，也為患者的預(yù)后評估提供了新的方法。