鄧 愉 曹牛奔 劉笑夢 于維先

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為結(jié)締組織破壞，牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒脫落。革蘭氏陰性菌—牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）是牙周炎的主要病原菌[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)革蘭氏陰性菌在生長過程中能夠通過外膜的囊泡化產(chǎn)生一種直徑約50～250 nm的球形雙層膜狀結(jié)構(gòu)，稱為外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）。OMVs 主要含有磷脂、脂多糖、外膜和周漿間隙的蛋白質(zhì)、核酸、酶和毒力因子等，在生物分子的傳遞、細(xì)胞間相互作用、生物膜形成及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[2，3]。更重要的是，OMVs 似乎比親本細(xì)菌更具有優(yōu)勢性。例如，OMVs 可以免受蛋白水解酶降解，在遠(yuǎn)端器官或組織中傳播[4]。

20 世紀(jì)80 年代，Williams 首次報道P.gingivalis能夠產(chǎn)生OMVs[5]。OMVs攜帶大量親本細(xì)菌的毒力因子，擁有P.gingivalis的基本生物學(xué)特性，如誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、損害宿主細(xì)胞和將毒力因子傳遞到宿主細(xì)胞[6]，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本文綜述了牙齦卟啉單胞菌外膜囊泡（Porphyromonas gingivalisouter membrane vesicles,P. gingivalisOMVs）的產(chǎn)生、毒力作用及其對牙周炎的影響，旨在為牙周炎的預(yù)防和治療提供新思路。

一、P.gingivalis OMVs的形成機(jī)制及影響因素

1.形成機(jī)制

OMVs 是由細(xì)菌外膜包裹周質(zhì)內(nèi)容物、肽聚糖片段和核酸通過出芽的方式形成[7]。OMVs 的形成機(jī)制目前尚未完全闡明。當(dāng)前已建立的假說試圖從分子水平解釋OMVs 的形成機(jī)制：①細(xì)菌外膜和肽聚糖之間共價鍵的丟失或重新定位，以及細(xì)菌外膜的生長速度較細(xì)胞壁快，使得細(xì)菌外膜突出，從而引發(fā)囊泡形成[8]；②肽聚糖片段或錯誤折疊蛋白質(zhì)的累積對細(xì)菌外膜施加膨脹壓力，導(dǎo)致外膜膨脹，最終收縮形成囊泡[9]；③磷脂、脂多糖和其他特定分子富集在細(xì)菌外膜上，使得細(xì)菌外膜的曲率發(fā)生變化從而產(chǎn)生OMVs[10]；④Roier 等人提出了一種可由磷脂轉(zhuǎn)運體VacJ/Yrb ABC 調(diào)節(jié)OMVs 產(chǎn)生的機(jī)制。首先VacJ/Yrb基因表達(dá)的減少或缺失導(dǎo)致磷脂在細(xì)菌外膜中積聚，這種不對稱膨脹會觸發(fā)細(xì)菌外膜向外膨脹；其次細(xì)菌外膜上的正曲率和負(fù)曲率將導(dǎo)致磷脂進(jìn)一步富集，并支持細(xì)菌外膜出芽，最終釋放形成OMVs[11]。上述機(jī)制可能都參與了P.gingivalisOMVs的形成，但P.gingivalis在不同的環(huán)境條件下或在不同的生長階段產(chǎn)生OMVs 的機(jī)制是否一致還有待研究。

2.影響因素

OMVs 是細(xì)菌對各種外部應(yīng)激的反應(yīng)產(chǎn)物，其包含的物質(zhì)是動態(tài)的，可根據(jù)不同的生長條件進(jìn)行調(diào)整[12]。首先，OMVs的形成受基因調(diào)控。P.gingivalis菌株根據(jù)菌毛主要亞單位FimA 的基因型分為六種類型（Ⅰ型和Ib-V 型）。Ⅰ型（ATCC 33277）和Ⅲ型（ATCC 49417）菌株分泌的OMVs 要比Ⅳ型（W83）菌株的多。當(dāng)Ⅳ型FimA 基因被插入Ⅰ型菌株時，F(xiàn)imA 親本菌株和受體菌株形成的OMVs 數(shù)量相似，這表明菌毛亞型參與了P.gingivalisOMVs 的形成[13]。編碼牙齦蛋白酶的rgpA 基因的缺失也會導(dǎo)致OMVs 的生成減少[14]。其次，OMVs 的生成數(shù)量及內(nèi)容物還會隨著環(huán)境的變化而變化，尤其在應(yīng)激條件下，例如PH值和溫度的變化、低濃度血紅素、噬菌體感染以及與宿主細(xì)胞和其它細(xì)菌的相互作用等，都會增加OMVs的生成和釋放[12，15]。

二、P.gingivalis OMVs的成分及作用

OMVs 為球形納米蛋白脂質(zhì)體，具有體積小且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點，能更好的進(jìn)入深層組織，激活宿主炎癥反應(yīng)[15，16]。OMVs中的脂多糖、蛋白質(zhì)等毒力因子以及遺傳物質(zhì)等在促進(jìn)疾病發(fā)展、調(diào)節(jié)菌斑生物膜以及使細(xì)菌發(fā)生免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[17～19]。

1.脂多糖

脂多糖是革蘭氏陰性菌的基本結(jié)構(gòu)，是革蘭氏陰性菌表面最豐富的抗原[20]。脂多糖由脂質(zhì)A、多糖核心和一條稱為O 抗原的多糖長鏈組成[16]。P.gingivalisOMVs中富含大量脂多糖，與OMVs 的形成及蛋白質(zhì)內(nèi)容物的組成有關(guān)[9]。P.gingivalis表達(dá)兩種類型的脂多糖，帶中性電荷的脂多糖和帶負(fù)電荷的脂多糖，其中帶負(fù)電荷的脂多糖的O 抗原鏈有助于OMVs 的形成[21]。另外，根據(jù)多糖的組成或長度，脂多糖可選擇性的將外膜蛋白組裝到OMVs 中，這一機(jī)制促進(jìn)牙齦蛋白酶優(yōu)先組裝到OMVs 中[22]。牙齦蛋白酶可導(dǎo)致不同類型的細(xì)胞死亡，包括內(nèi)皮細(xì)胞、人牙齦成纖維細(xì)胞、人牙齦上皮細(xì)胞以及成骨細(xì)胞[23]，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

2.蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示OMVs 與親本細(xì)菌外膜具有相似的蛋白質(zhì)圖譜[24]，但OMVs 中的蛋白質(zhì)組成和特定蛋白質(zhì)的相對豐度與親本細(xì)菌表面不同[25]。通過比較OMVs 和細(xì)菌外膜中外膜蛋白的相對豐度，發(fā)現(xiàn)具有C 末端結(jié)構(gòu)域的蛋白和一些脂蛋白優(yōu)先被分選到OMVs，而Ton-B依賴性轉(zhuǎn)運蛋白和具有外膜蛋白A樣蛋白肽聚糖結(jié)合基序的蛋白質(zhì)優(yōu)先保留在細(xì)菌外膜[26]。富集C 末端結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠與帶負(fù)電荷的脂多糖連接促進(jìn)電子致密表面層的形成，為OMVs 提供光滑的表面，研究發(fā)現(xiàn)，具有光滑表面的OMVs 在與宿主細(xì)胞膜相互作用時能夠保持其球形結(jié)構(gòu)，而粗糙型OMVs 結(jié)構(gòu)會發(fā)生扭曲。OMVs的結(jié)構(gòu)又會影響OMVs的內(nèi)化：球形納米顆粒傾向于被宿主細(xì)胞膜完全包裹，而結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲的納米顆粒傾向于留在細(xì)胞表面[21，27]。牙齦蛋白酶是OMVs 中的主要致病蛋白，具有蛋白水解活性，可以直接和（或）間接破壞牙周組織，已被認(rèn)為是重要的毒力因子[28]。有研究表明，具有C 末端結(jié)構(gòu)域的牙齦蛋白酶在OMVs 中表現(xiàn)出中高比率，且含量是親本細(xì)菌的三到五倍[29]，在細(xì)菌聚集及生物膜形成方面發(fā)揮重要作用[20]。

OMVs 中其它富集C 末端結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)也被認(rèn)為與毒力有關(guān)，例如：CPG70 羧肽酶、肽基精氨酸脫亞氨酶及血凝素等[26，30]。其中肽基精氨酸脫亞氨酶能被帶負(fù)電荷的脂多糖修飾，在影響OMVs 的形成，促進(jìn)生物膜形成和OMVs 的表面移位中發(fā)揮重要作用，是牙周炎的潛在致病因素[31]。當(dāng)細(xì)菌在不同的環(huán)境條件下生長時，OMVs 的蛋白質(zhì)組成及含量會發(fā)生變化，這暗示特定蛋白質(zhì)有選擇地進(jìn)入OMVs，但具體機(jī)制還有待深入研究。

3.遺傳物質(zhì)

OMVs 還攜帶有親本細(xì)菌的DNA 以及mRNA、sRNA 和其他非編碼RNA。OMVs 的獨特保護(hù)結(jié)構(gòu)使得OMVs能夠?qū)⒓?xì)菌DNA和信號分子帶到遠(yuǎn)端靶器官而不會被降解。研究發(fā)現(xiàn)，外膜囊泡中的mRNA 可以在進(jìn)入宿主細(xì)胞后被轉(zhuǎn)錄和翻譯[32，33]，sRNA 能夠被包裝至OMVs，調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)[34]。因此OMVs 可以在細(xì)胞間傳遞遺傳信息。

三、P.gingivalis OMVs在牙周炎發(fā)生中的作用

P.gingivalis作為紅色復(fù)合體菌群的核心成員與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[35]。P.gingivalisOMVs能夠發(fā)揮“哨兵”作用提前到達(dá)疾病部位，與宿主細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用[7]。P.gingivalisOMVs 首先黏附定植于上皮細(xì)胞，損害上皮屏障并侵入皮下組織，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞及其它組織細(xì)胞，參與牙周炎癥和組織破壞。

1.P.gingivalisOMVs對牙齦上皮細(xì)胞的作用

P.gingivalis的一個重要特征是它能夠侵入宿主細(xì)胞并在其中存活。在P.gingivalisOMVs 中發(fā)現(xiàn)了幾種與P.gingivalis黏附和侵襲宿主細(xì)胞有關(guān)的膜蛋白，包括FimA、血凝素A 和熱應(yīng)激蛋白[36]。因此，P.gingivalisOMVs 能侵入牙齦上皮細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，且Ⅰ型菌株的OMVs比Ⅳ型菌株的OMVs侵襲力更強(qiáng)[37]。菌毛蛋白和牙齦蛋白酶還為OMVs提供了粘附和蛋白水解的能力，使P.gingivalisOMVs能夠破壞粘膜上皮的完整性，其中牙齦蛋白酶可以特異性降解牙齦上皮細(xì)胞連接粘附分子,導(dǎo)致牙齦上皮對40 kDa右旋糖酐、脂多糖和蛋白聚糖的通透性增大[38]，造成牙齦上皮的進(jìn)一步損傷。細(xì)胞遷移所需的信號分子轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和整合素也能被OMVs降解，導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能受損[39]。

2.P.gingivalisOMVs對免疫細(xì)胞的作用

P.gingivalisOMVs 在穿過宿主上皮細(xì)胞屏障進(jìn)入粘膜下層后，能夠直接與各種免疫細(xì)胞相互作用，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，從而引起免疫反應(yīng)失調(diào)和炎癥。

中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)對抗微生物病原體的主要效應(yīng)體，也是齦溝液中最豐富的細(xì)胞。中性粒細(xì)胞除了作為吞噬細(xì)胞，還可以釋放其細(xì)胞外染色質(zhì)、核蛋白和絲氨酸蛋白酶形成網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps, NETs）。P.gingivalisOMVs 中的牙齦蛋白酶在NETs 的形成中起著雙重作用：牙齦蛋白酶是NETs 形成的有效直接誘導(dǎo)劑，但同時也可阻止NETs 對P.gingivalis的誘捕。這導(dǎo)致牙周袋中存在大量的中性粒細(xì)胞和NETs，但牙周病原體和相關(guān)的病原體也依然大量存在[40]。P.gingivalisOMVs 中富含的脂多糖也會影響中性粒細(xì)胞，包括細(xì)胞因子和NETs 的產(chǎn)生及細(xì)胞死亡。例如脂多糖能夠促進(jìn)炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin, IL）-8 的分泌。IL-8 是一種誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集的趨化因子[41]，這種招募可能會導(dǎo)致牙周組織長時間處于炎癥狀態(tài)。

P.gingivalisOMVs 能夠刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α）、IL-6 和IL-10 等，還會引起巨噬細(xì)胞代謝的改變，從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，這一轉(zhuǎn)變使得線粒體耗氧量減少以及線粒體活性氧生成增加，使得OMVs 更能激活炎癥信號和細(xì)胞焦亡[42]。體外研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalisOMVs 能夠促進(jìn)人U937 巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞表面脂多糖受體CD14的脫落和裂解，這導(dǎo)致巨噬細(xì)胞對脂多糖刺激的反應(yīng)性降低，使P.gingivalis和其它牙周病原體逃避宿主免疫系統(tǒng)的能力增加[43]。OMVs 還可作用于樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟并參與免疫調(diào)節(jié)[44]。

3.P.gingivalisOMVs對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用

在牙周炎的進(jìn)展過程中往往伴隨著新生血管的形成，以修復(fù)炎癥所破壞的牙周組織。體外研究發(fā)現(xiàn)P.gingivalisOMVs 能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, ERK1/2）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）抑制小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶的表達(dá)，以劑量依賴性方式抑制毛細(xì)血管的形成[39，45，46]。P.gingivalisOMVs 中的牙齦蛋白酶能夠降解血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1 和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的連接，導(dǎo)致血管損傷和內(nèi)皮通透性增加，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[47]。P.gingivalisOMVs也被觀察到能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。例如，在γ干擾素刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中加入P.gingivalisOMVs可抑制細(xì)胞表面Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物的上調(diào)，從而調(diào)節(jié)抗原呈遞并有利于病原體的存活[43]。

4.P.gingivalisOMVs對其它組織細(xì)胞的作用

OMVs 已被證明是細(xì)菌和宿主組織之間通信的重要媒介。P.gingivalisOMVs 包含大量微生物相關(guān)分子模式能夠與宿主模式識別受體結(jié)合，啟動促炎級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽的產(chǎn)生[48]，其啟動病原體識別和炎癥信號的方式可能受到所包含的鞘磷脂亞型的限制[39]。在進(jìn)入黏膜下層后，OMVs 中的牙齦蛋白酶既可通過引起細(xì)胞凋亡導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能受損，又能促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)核因子-κB 受體激活因子配體誘導(dǎo)的成熟破骨細(xì)胞的分化并增強(qiáng)破骨細(xì)胞的功能[23，49]，使得骨吸收大于骨再生，最終導(dǎo)致牙齒脫落。

5.調(diào)節(jié)菌斑生物膜

牙菌斑是附著在牙齒表面的一種復(fù)雜生物膜，大約由700 多種細(xì)菌組成。在易感個體中，齦下菌斑生物膜中的細(xì)菌會促使微生物失調(diào)，導(dǎo)致牙齒支持組織逐漸破壞[50]。在菌斑生物膜中不同細(xì)菌之間的相互作用是通過粘附素與其受體之間的特異性識別而建立。P.gingivalisOMVs 中存在多種粘附素，如菌毛、牙齦蛋白酶和血凝素等。因此，P.gingivalisOMVs 可以與其他細(xì)菌相互作用，參與調(diào)節(jié)整個微生物群落[51]。P.gingivalisOMVs 介導(dǎo)了白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的聚集。在沒有OMVs 或熱處理OMVs 的情況下白色念珠菌和金黃色葡萄球菌則不會發(fā)生聚集。因此，P.gingivalisOMVs 可能是這兩種細(xì)菌之間的紐帶[6]。此外，P.gingivalisOMVs 還可以增強(qiáng)福賽坦氏菌對上皮細(xì)胞的附著和侵襲[36]。而P.gingivalisOMVs中的蛋白酶能夠降低具核梭桿菌表面粘附相關(guān)蛋白FadA 和FomA 的表達(dá)水平，抑制具核梭桿菌對口腔上皮細(xì)胞的侵襲及具核梭桿菌的自聚集[52]。P.gingivalisOMVs 可以保護(hù)其它細(xì)菌免受血清殺菌作用的影響，并通過OMVs 中的脂多糖與洗必泰結(jié)合，從而為P.gingivalis和其它口腔細(xì)菌提供保護(hù)[53]。

四、P.gingivalis OMVs應(yīng)用研究前景展望

OMVs 最初被認(rèn)為是細(xì)胞碎片，然而隨著研究的不斷深入，其在細(xì)胞間通訊、防御和宿主的免疫調(diào)節(jié)等過程中的重要作用已被逐步認(rèn)知。近年來，OMVs 在疫苗開發(fā)以及藥物載體等方面顯示出了巨大的應(yīng)用前景。OMVs 具有被免疫細(xì)胞攝取的最佳體積，并且具有結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性，表現(xiàn)為①OMVs在不同溫度及條件下能夠保持完整和穩(wěn)定；②具有無生命活性、非復(fù)制性和佐劑作用，含有大量與親本細(xì)菌相關(guān)的免疫原性成分[54]，能夠引發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[55]。有研究表明，P.gingivalisOMVs能夠作為牙周炎疫苗的候選黏膜免疫原和佐劑[56]，并且已經(jīng)取得了一些令人滿意的結(jié)果。經(jīng)鼻或經(jīng)皮給予P.gingivalis的40-kDa 外膜蛋白可在血清和唾液中誘導(dǎo)特異性血清免疫球蛋白（immune globulin,Ig）G抗體，抑制P.gingivalis的共聚集活性，這意味著這種片段化的外膜蛋白對慢性牙周炎的疫苗接種是有用的[57]。繼而，Nakao 等人又對小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)免疫，評估P.gingivalisOMVs 作為疫苗抗原的能力。在接種P.gingivalisOMVs 后，鼻腔沖洗液和唾液中以O(shè)MVs 的劑量依賴性方式產(chǎn)生P.gingivalis特異性抗體IgA 以及血清中IgG 和IgA 水平顯著升高，分別維持至少28 和18 天[58]。研究人員進(jìn)一步指出，P.gingivalisOMVs 中的脂多糖和帶負(fù)電荷脂多糖的修飾蛋白是導(dǎo)致小鼠體內(nèi)產(chǎn)生P.gingivalis特異性抗體的決定因素[59]。除此之外，與合成載體相比，OMVs具有多種優(yōu)點，如小顆粒尺寸、可靠的載藥能力和優(yōu)良的生物相容性[60]。因此，OMVs 有望成為一種潛在的藥物傳遞系統(tǒng)。

然而，P.gingivalisOMVs 的應(yīng)用仍然面臨一些問題。首先，OMVs 的大規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)還存在一定的難度，達(dá)不到目前臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)；其次，OMVs具有一定毒性，能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生部分毒副作用，需要仔細(xì)衡量免疫效果和潛在副作用之間的平衡；第三，作為藥物遞送的載體，還需要更多的修改技術(shù)來提高其穩(wěn)定性、靶向性和安全性[61，62]；最后，Gabarrini等人從P.gingivalis臨床分離株中初步檢測到肽基精氨酸脫亞氨酶，其中包含的兩種蛋白成分與OMVs相同[63]，但目前關(guān)于P.gingivalis臨床分離株OMVs的研究尚不充分。