韓旭 高春燕 朱麗華

1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063210;2唐山市婦幼醫(yī)院檢驗(yàn)科

肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae,Sp)能夠?qū)е乱幌盗袊?yán)重的感染性疾病:非侵襲性感染(中耳炎和肺炎),侵襲性感染(腦膜炎和敗血癥)。兒童下呼吸道感染發(fā)病率和死亡率主要?dú)w因于Sp感染。據(jù)報(bào)道全球范圍內(nèi)Sp每年造成約58.2～92.6萬(wàn)名5歲以下兒童死亡[1]。我國(guó)是全球Sp所致疾病負(fù)擔(dān)最高的國(guó)家之一,且兒童Sp檢出率呈逐年上升趨勢(shì)[2-5]。且Sp的多重耐藥菌(multi-drug resistance ,MDR)嚴(yán)重降低了抗生素的有效性,已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的問題。隨著基因測(cè)序技術(shù)在耐藥機(jī)制中的研究,耐藥相關(guān)基因分析不僅可以為Sp感染治療用藥提供理論支持,有利于保障多重耐藥感染患兒的治療效果,還為MDR的防范提供指導(dǎo)[6]。遺傳多樣性分析表明,不同基因的變異與特定的抗生素耐藥性有關(guān)[1]。dpr基因(DNA binding protein starved cells-like peroxide resistance protein)是鏈球菌中dps的同源基因[7],是肺炎鏈球菌R6株全基因測(cè)序中的第1430號(hào)基因[8],目前尚無(wú)dpr基因突變與Sp耐藥相關(guān)性的研究。本研究對(duì)2020年唐山市婦幼醫(yī)院收治的兒童感染性疾病病原菌分布情況、兒童Sp感染臨床資料特點(diǎn)以及兒童Sp的耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 統(tǒng)計(jì)2020年1月～12月,唐山市婦幼醫(yī)院收治的兒童感染性疾病共2996例,其中Sp感染806例,占26.9%。標(biāo)本來(lái)源:痰液751例,血液18例,腦脊液1例,肺泡灌洗液12例,分泌物24例。侵襲性感染19例,非侵襲性感染787例;男496例,女310例。剔除來(lái)自同一患兒臨床標(biāo)本相同部位分離出的重復(fù)菌株。

1.2研究方法

1.2.1藥物敏感性試驗(yàn)及生化反應(yīng) 據(jù)菌落形態(tài)以及全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑,進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn),篩選出Sp。參照 2020年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100-S30文件推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2.2Sp DNA的提取與測(cè)序 Sp DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,測(cè)序由武漢凡樸科技有限公司完成。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 使用細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)WHONET5.6軟件對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行分析,用SPSS22.0軟件對(duì)dpr基因突變情況與耐藥及生化反應(yīng)關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料用率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不敏感率=耐藥+中介/總例數(shù)。

2 結(jié)果

2.1兒童感染性疾病感染特征分析

2.1.1兒童感染性疾病中各病原菌分布情況 在2020年我院收治的兒童感染疾病病原菌2996株中,Sp、金黃色葡萄球菌、卡他布蘭漢菌位列前三。其中,Sp分離率最高,達(dá)到26.9%(806/2996)見圖1。

圖1 2020年兒童病原生物分離率

2.1.2兒童Sp感染的臨床資料特點(diǎn) Sp感染發(fā)病率以12～36個(gè)月最高,占48.9%(394/806);四季均可發(fā)病,但秋冬兩季明顯升高?；純阂苑尾扛腥?、非侵襲性感染為主。見表1。

表1 806例兒童Sp感染臨床資料特點(diǎn)

2.1.3Sp耐藥情況 2020年我院收治兒童感染Sp的806例,未發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺耐藥株,對(duì)奎奴普丁、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率較高,見表2。

2.2Sp中dpr基因突變情況 本次研究隨機(jī)抽取MDR的Sp菌株42株進(jìn)行dpr基因測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與Genebank(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)中R6菌株(GenBank登錄號(hào)ASM704v1)的dpr基因進(jìn)行blast比對(duì)。結(jié)果顯示: dpr基因突變率達(dá)到40.5%(17/42),單基因突變與多基因突變比例為1:2(6:12)。氨基酸突變的位點(diǎn)及突變率見圖2,126號(hào)、133號(hào)、156號(hào)氨基酸突變率最高,均為11.9%;其次為58號(hào)。

圖2 dpr基因突變位點(diǎn)和突變率

2.3dpr基因突變與耐藥的關(guān)系 dpr基因未突變株和突變株與常見抗生素耐藥關(guān)系,見表3。dpr基因突變與復(fù)方新諾明耐藥性相關(guān)(P<0.05),與其他抗生素耐藥性無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表3 dpr基因突變與抗生素耐藥的相關(guān)性

2.4dpr基因突變與生化反應(yīng)的關(guān)系 細(xì)菌在新陳代謝過(guò)程中進(jìn)行各種生物化學(xué)反應(yīng)。因細(xì)菌的種類不同,催化這些反應(yīng)的酶類及其活性也有所差異,代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦各不相同。42株Sp經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏檢測(cè)系統(tǒng)。共測(cè)試43個(gè)生化反應(yīng),其中各菌株間結(jié)果出現(xiàn)差異的生化反應(yīng)有:L-纈氨酸-7-氨酸-4-甲基香豆素(LVAL)、絲氨酸-酪氨酸-7-氨酸-4-甲基香豆素(SETY)、普魯蘭多糖(PUL)、腺嘧啶脫氧核苷(THY)、D-海藻糖(TRL)、4-MU-BD-半乳糖苷(BDGAL)、4-MU-BD-葡萄苷(BDGLU)、4-MU-N-乙酰-BD-氨基葡糖苷(NAG)、4-MU-AD-半乳糖苷(ADGAL)、對(duì)硝基苯-BD-半乳糖苷(GALB),dpr基因是否發(fā)生突變與全自動(dòng)細(xì)菌鑒定檢測(cè)系統(tǒng)中各生化反應(yīng)的關(guān)系,見表4。dpr基因的突變與THY (腺嘧啶脫氧核苷)有相關(guān)性(P<0.05),其他生化反應(yīng)不相關(guān)(P>0.05)。

表4 dpr基因突變與生化反應(yīng)的相關(guān)性分析

3 討論

本研究806例Sp感染患兒中侵襲性感染比例較低,為2.4%,通常兒童腦脊液樣本非常有限,血培養(yǎng)的陽(yáng)性率也不高,這對(duì)侵襲性Sp的診斷帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[10]。本次研究中Sp感染中男女比例與其他研究相一致,臨床實(shí)踐中應(yīng)特別關(guān)注患兒性別的問題[11];24～36個(gè)月的患兒自身免疫力較低,活動(dòng)范圍及飲食結(jié)構(gòu)的改變等原因造成發(fā)病率最高。Sp感染具有較強(qiáng)的季節(jié)差異,秋季和冬季是該病流行的季節(jié),12月、1月達(dá)到高峰。秋冬季天氣干燥,冷空氣加大對(duì)鼻咽黏膜的損傷,從而為病原體的侵入提供便利。此外,該時(shí)期流感、副流感等呼吸道病毒性疾病頻發(fā),也會(huì)增加Sp感染的機(jī)率。

從Sp感染的耐藥情況來(lái)看,奎奴普丁、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率很高,均在90%以上,青霉素的耐藥率為68.4%,復(fù)方新諾明的耐藥率也達(dá)到了50.7%,與中國(guó)兒童細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)組 2020年兒童細(xì)菌感染及耐藥監(jiān)測(cè)耐藥率一致[12-13]。因此紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、青霉素在本地區(qū)已不能再作為臨床治療Sp感染的選擇。雖然已經(jīng)采取了許多措施來(lái)規(guī)范醫(yī)院抗生素的使用,但抗生素的濫用仍然很普遍[14]。本次研究結(jié)果顯示利奈唑胺、莫西沙星、萬(wàn)古霉素等抗生素具有較高的敏感率,但其并非治療患兒的首選用藥,利奈唑胺可造成骨髓抑制,莫西沙星可能影響兒童關(guān)節(jié)和軟骨發(fā)育,萬(wàn)古霉素可引起腎毒性, 因此,臨床醫(yī)生對(duì)兒童選擇用藥時(shí)應(yīng)該避免藥物的毒副作用,謹(jǐn)慎用藥[15]。

本研究簡(jiǎn)要地分析了Sp分離株中存在的dpr基因變異,并分析了基因變異與特定抗生素耐藥的相關(guān)性。細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中由于基因變異,使其對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力發(fā)生了變化,從而代謝產(chǎn)物較突變前不同,進(jìn)而導(dǎo)致了生化反應(yīng)中THY與dpr基因突變存在相關(guān)性。細(xì)菌的生化反應(yīng)也是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。MDR分離株表現(xiàn)出一系列耐藥機(jī)制,包括藥物靶點(diǎn)的修飾、治療藥物的失活和外排泵的過(guò)表達(dá)[16]。有研究表明Sp中近90%的多態(tài)性是通過(guò)基因重組交換引入的[17-18]。Sp的基因組可塑性很強(qiáng),有助于疫苗逃逸和抗生素抗性分離株的快速發(fā)展。有研究表明,在一輪轉(zhuǎn)化中單個(gè)細(xì)胞中可發(fā)生29個(gè)以上基因重組,而在臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度高達(dá)50 Kb的基因重組株,基因組的多樣性可能導(dǎo)致抗生素耐藥相關(guān)基因的快速傳播[19-20]。造成dpr基因突變的原因和耐藥具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討,但基于核酸擴(kuò)增技術(shù)在耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用可以大大縮短臨床報(bào)告時(shí)間,應(yīng)盡早精準(zhǔn)用藥,進(jìn)行靶向治療,確定關(guān)鍵的耐藥相關(guān)基因位點(diǎn),為臨床選擇抗生素提供幫助,也為選擇新的抗生素作用位點(diǎn)及研制特異性更強(qiáng)的疫苗等提供理論依據(jù)。