魯瑞嬌 李玉霞 謝伊代·阿不都海力力 俞婷婷 馮陽春

肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是肺癌的主要類型，屬于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），在所有NSCLC亞型中，LUAD有著最大的異質(zhì)性和侵襲性，通常從黏膜腺發(fā)展而來，并且與多種基因的突變密切相關(guān)，有著高的腫瘤突變負(fù)荷[1]。LUAD分為非典型腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia,AAH）、原位腺癌（adenocarcinomain situ, AIS）、微浸潤腺癌（minimally invasive adenocarcinoma, MIA）和浸潤性腺癌（invasive adenocarcinoma, IAC）四大類。LUAD具有惡性程度低、發(fā)展緩慢但容易發(fā)生血道和淋巴道轉(zhuǎn)移的特點，吸煙、家族遺傳史和職業(yè)暴露等是主要的危險因素，加上多數(shù)患者在就診時已是中晚期，容易失去最佳治療時機(jī)，因此尋找新的治療靶點對改善預(yù)后有重要意義。近年來，隨著早診早治項目的開展，我國正在逐步建立起肺癌早篩的工作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘LUAD中差異表達(dá)的基因，可輔助高風(fēng)險人群的早期篩查，并有望成為可靠的治療和預(yù)后評估的新靶點。血清分泌型蛋白1（Dikkopf 1,DKK1）是Dikkopf家族的一員，其家族成員還包括DKK2、DKK3和DKK4。DKK1是一種由266個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是Wnt信號通路的負(fù)向調(diào)控因子，其C末端結(jié)構(gòu)域被確定為是完成Wnt通路抑制所必要的結(jié)構(gòu)，同時DKK1也參與c-Jun NH2-末端激酶（JNK）和DKK1/CKAP4信號通路。在膀胱癌中DKK1的表達(dá)升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在正相關(guān)；在骨骼相關(guān)疾病中高DKK1表達(dá)會損害成骨細(xì)胞活性并導(dǎo)致骨質(zhì)流失；在心血管疾病中DKK1的表達(dá)水平已被證明與冠狀動脈粥樣硬化程度呈負(fù)相關(guān)，DKK1高表達(dá)也是NSCLC、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、膽管癌、喉鱗狀細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌等多種癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[2]。同時DKK1水平升高與血管浸潤和轉(zhuǎn)移、淋巴侵襲以及血管內(nèi)皮生長因子-C表達(dá)有關(guān)，提示DKK1可能參與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[3]。有研究[4,5]報道在NSCLC中，DKK1表達(dá)水平不僅高于健康對照組且表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化以及臨床分期等因素相關(guān)，推測DKK1可能是LUAD潛在的生物標(biāo)志物。

本研究通過生物信息學(xué)方法分析DKK1在LUAD發(fā)生發(fā)展中的作用及預(yù)后意義，同時加以實驗進(jìn)行驗證，以期為LUAD患者的預(yù)后評估和免疫治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1DKK1的表達(dá)差異分析 從基因型組織表達(dá)（genotype-tissue expression, GTEx）和癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫獲取LUAD中DKK1mRNA表達(dá)矩陣，使用Wilcoxon檢驗分析DKK1在LUAD組織與正常對照組織中的表達(dá)。基于DKK1的中值表達(dá)，將樣本分為高和低DKK1表達(dá)組，使用“deseq 2”R軟件包以logfc＞1.5和P＜0.05作為閾值參數(shù)，ggplot2[3.3.6]R包對火山圖和熱圖進(jìn)行可視化。

1.2 臨床病理特征相關(guān)性分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取LUAD的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)，對DKK1的表達(dá)與臨床-患者的病理參數(shù)關(guān)系進(jìn)行研究，箱型圖從UALCAN數(shù)據(jù)庫下載。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤分析 使用TISIDB數(shù)據(jù)庫檢索DKK1表達(dá)與LUAD免疫細(xì)胞浸潤水平的聯(lián)系。

1.4 預(yù)后分析 應(yīng)用Kaplan-MeierPlotter數(shù)據(jù)庫，使用Log-rank檢驗，通過“Lung cancer mRNA”模塊探索DKK1與LUAD患者的總生存期（overall survival, OS）、首次進(jìn)展生存期（first progression survival, FP）和進(jìn)展后生存期（postprogression survival, PPS）之間的關(guān)系。

1.5 甲基化水平分析 應(yīng)用Methsurv數(shù)據(jù)庫分析LUAD TCGA數(shù)據(jù)集中DKK1的DNA甲基化狀態(tài)，此外還在LUAD樣本中評估了DKK1的CpG甲基化狀態(tài)的預(yù)后價值。

1.6 功能富集分析 從LinkedOmics數(shù)據(jù)庫LUAD數(shù)據(jù)集中獲取DKK1的共表達(dá)基因，clusterProfiler[4.4.4]包進(jìn)行富集分析，ggplot2包進(jìn)行可視化，通過Fisher精確檢驗進(jìn)行基因本體（gene ontology, GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集顯著性分析。

1.7 免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry,IHC） 經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：K-2022016），收集2016至2017年醫(yī)院手術(shù)的59例石蠟包埋的LUAD樣本，其中男性27例，女性32例；年齡42-73歲，中位年齡57歲；臨床分期I期12例，II期19例，III期24例，IV期4例。從醫(yī)院信息中心獲得其隨訪信息。應(yīng)用Kaplan-Meier曲線經(jīng)Log-rank分析后比較高DKK1表達(dá)組和低DKK1表達(dá)組生存率是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase, SP）檢測石蠟包埋的LUAD病理樣本切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine, DAB）顯色等步驟進(jìn)行免疫組化染色，其中DKK1單克隆抗體購自Abcam公司，配套免疫組化通用試劑購自北京中杉金橋公司。DKK1染色評價標(biāo)準(zhǔn)：（1）陰性（-）：腫瘤細(xì)胞胞漿未見褐色顆粒；（2）弱陽性（+）：腫瘤細(xì)胞胞漿中見染色較淺的褐色顆粒；（3）強(qiáng)陽性（++）：超過50%的腫瘤細(xì)胞胞漿中見棕褐色顆粒。所有病例免疫組化結(jié)果由兩位經(jīng)驗豐富的高級職稱病理醫(yī)師進(jìn)行綜合評估。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用各個數(shù)據(jù)庫默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用Wilcoxon檢驗或χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DKK1的表達(dá)差異 我們獲取目標(biāo)基因在LUAD的表達(dá)情況，如圖1A、圖1B所示。我們發(fā)現(xiàn)在TCGA聯(lián)合GTEx數(shù)據(jù)庫的862個樣本中，DKK1mRNA在LUAD組織中的表達(dá)高于健康組織（P＜0.05）。此外，共鑒定了539個差異表達(dá)基因，其中270個表達(dá)上調(diào)，269個表達(dá)下調(diào)（圖1C），與低表達(dá)組相比熱圖顯示了前10個重要的差異基因（圖1D），其中BRDT、MAGEA10、MAGEA4和CT83與肺癌的關(guān)系曾有報道。

圖1 DKK1的表達(dá)圖譜。A：TCGA聯(lián)合GTEx數(shù)據(jù)庫中LUAD樣本的DKK1表達(dá)情況；B：TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD樣本的DKK1表達(dá)情況；C：DKK1高表達(dá)組和低表達(dá)組的差異基因表達(dá)熱圖；D：前10個重要的差異基因。Fig 1 Expression map of DKK1.A: DKK1 expression of LUAD samples in the TCGA joint GTEx database;B:DKK1 expression of LUAD samples in TCGA database; C: Differential gene expression heatmap of high and low DKK1 expression groups;D: Top 10 important differential genes.ns: not significant.ns: P＞0.05,**P≤0.01.DKK1: Dikkopf 1; TCGA: The Cancer Genome Atlas; LUAD:lung adenocarcinoma;GTEx: genotype-tissue expression; Not sig: not significant.

2.2DKK1表達(dá)的臨床病理特征 與正常對照組相比，LUAD患者具有更高程度的DKK1mRNA表達(dá)，相較于早期癌癥階段，DKK1在晚期癌癥中的表達(dá)較高（圖2A，圖2B），表明了DKK1在腫瘤發(fā)展和遷移中的潛在作用。圖2C和圖2D顯示的則是DKK1的表達(dá)與患者性別以及TP53基因突變狀況的關(guān)系。表1則表明DKK1表達(dá)與患者的診斷年齡相關(guān)，而與其他臨床病理參數(shù)無關(guān)。

表1 DKK1高表達(dá)組和低表達(dá)組的LUAD患者的臨床病理特征Tab 1 Clinicopathological features of LUAD patients with high and low DKK1 expression*

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫中DKK1 mRNA表達(dá)的臨床病理特征。A：樣本類型（健康/原發(fā)腫瘤）；B：腫瘤分期（1、2、3和4期）；C：患者性別（男性和女性）；D：TP53基因突變狀態(tài)（突變和未突變）。Fig 2 Clinicopathological features of DKK1 mRNA expression in the UALCAN database*.A: Sample type (healthy/primary tumor); B: Individual cancer stages (stages 1, 2, 3 and 4); C: Patient’s gender (male and female); D: TP53 mutation status (mutant and non-mutant).*The selection conditions are as follows: (1) gene symbol=DKK1; (2) TCGA dataset=LUAD (515 LUAD samples and 59 normal tissue samples that met the criteria).

2.3DKK1的表達(dá)與LUAD免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)DKK1表達(dá)與多種免疫細(xì)胞的活動相關(guān)，其中與嗜中性粒細(xì)胞（r=0.216,P＜0.001）、伽馬三角洲T細(xì)胞（T gamma delta, Tgd/γδ T）（r=0.155,P＜0.001）、活化樹突細(xì)胞（activated dendritic cell, aDC）（r=0.149,P＜0.001）以及Th1細(xì)胞（r=0.132,P=0.002）表達(dá)水平呈正相關(guān)，與濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cell, TFH）和Th17細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖3A-圖3E）。上述結(jié)果促使我們研究DKK1表達(dá)水平和免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系，當(dāng)DKK1表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組時，我們發(fā)現(xiàn)浸潤性免疫細(xì)胞水平存在顯著差異，包括aDC、嗜中性粒細(xì)胞、Tgd細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、DC和自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞，而肥大細(xì)胞沒有顯著差異（圖4A-圖4H）。

圖3 LUAD中DKK1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系。DKK1在24種免疫細(xì)胞中表達(dá)水平的棒棒糖圖（A），DKK1表達(dá)與中性粒細(xì)胞（B）、Tgd細(xì)胞（C）、aDC細(xì)胞（D）和Th1細(xì)胞（E）之間的相關(guān)性。Fig 3 Relationship between DKK1 expression and immune infiltration in LUAD.Lollipop plot of DKK1 expression levels in 24 immune cells (A),correlation between DKK1 expression and neutrophils (B), Tgd cells (C), aDC cells (D) and Th1 cells (E).aDC: activated dendritic cell.

圖4 DKK1高表達(dá)組和低表達(dá)組之間aDC（A）、嗜中性粒細(xì)胞（B）、Tgd（C）、Th1（D）、Th2（E）、DC（F）、肥大細(xì)胞（G）和NK細(xì)胞（H）浸潤水平的比較。Fig 4 Comparison of aDC (A), neutrophils (B), Tgd (C), Th1 (D), Th2 (E), DC (F), mast cells (G) and NK cells (H) between high and low expression groups.ns: P＞0.05, *P≤0.05, ***P≤0.001.NK: natural killer.

2.4DKK1對LUAD患者預(yù)后的影響 預(yù)后分析顯示，在204602-at（OS: HR=1.38,P=3.6e-07; FP: HR=1.63,P=2.8e-07; PPS: HR=1.26,P=0.028）的LUAD隊列中，DKK1高表達(dá)組和低表達(dá)組的OS、和FP和PPS差異均存在差異（圖5），DKK1表達(dá)增加與患者較差的預(yù)后有關(guān)。提示DKK1的表達(dá)水平可能對LUAD患者生存預(yù)后產(chǎn)生一定影響。

圖5 Kalpan-Meier生存曲線比較肺腺癌中DKK1的表達(dá)：肺腺癌（204602-at）隊列中OS（A）、FP（B）和PPS（C）的生存曲線Fig 5 The Kalpan-Meier survival curve compares DKK1 expression in LUAD: Survival curves for OS (A), FP (B) and PPS (C) in the LUAD (204602-at)cohort.OS: overall survival; FP: first progression survival; PPS: post-progression survival.

2.5 LUAD患者1、3和5年OS的預(yù)后列線圖 構(gòu)建以T分期、腫瘤狀態(tài)、病理分期和DKK1表達(dá)水平為參數(shù)的列線圖模型（圖6A），列線圖模型的一致性指數(shù)（concordance index,C-index）為0.709（95%CI: 0.686-0.733）。通過受試者操作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線分析評估了列線圖的預(yù)測能力。在TCGA-LUAD隊列中，1、3和5年OS的列線圖曲線下面積分別為0.735、0.643和0.599（圖6B），提示該模型具有良好的預(yù)測價值。此外，通過校準(zhǔn)曲線來評估列線圖的一致性，結(jié)果顯示3、5年OS率校正曲線與理想?yún)⒖季€接近（圖6C），表示預(yù)測值和實際生存率之間具有良好的一致性。

圖6 肺腺癌患者1、3和5年OS的預(yù)后列線圖。A：列線圖模型；B：用于預(yù)測TCGA-LUAD隊列中1、3和5年OS列線圖的ROC曲線；C：用于預(yù)測TCGA-LUAD隊列中1、3和5年OS的列線圖校準(zhǔn)曲線。Fig 6 Prognostic Nomogram for the 1-year, 3-year and 5-year OS of LUAD patients.A: Nomogram model; B: The ROC curves for predicting the Nomogram of 1-year, 3-year and 5-year OS in the TCGA-LUAD cohort; C: The Nomogram calibration curves for predicting the 1-year, 3-year and 5-year OS of the TCGA-LUAD cohort.ROC: receiver operating characteristic.

2.6DKK1的甲基化狀態(tài)與LUAD患者的預(yù)后有關(guān) 與正常樣本相比，LUAD中DKK1的DNA甲基化水平顯著降低，但在不同癌癥分期中觀察到DKK1甲基化水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖7A-圖7B）。MethSur分析了DKK1基因中DNA甲基化水平和CpG島的預(yù)后值。結(jié)果顯示了18個甲基化的CpG島，其中cg20364839顯示DNA甲基化程度最高（圖7C）。此外，9個CpG島的甲基化水平，即cg01160882、cg076844796、cg08812555、cg09445939、cg09465786、cg1193116、cg18956393、cg27411220和cg27591349與預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）（表2），表明DKK1的甲基化水平有望成為LUAD預(yù)后生物標(biāo)志物。

表2 DKK1基因CpG位點甲基化水平對LUAD患者預(yù)后的影響Tab 2 Effect of methylation level of CpG locus of DKK1 gene on prognosis of LUAD patients

圖7 DKK1的DNA甲基化水平及其在LUAD中的預(yù)后價值。A：正常組織和肺腺癌組織中DKK1啟動子甲基化水平；B：不同腫瘤階段肺腺癌組織中DKK1啟動子甲基化水平；C：Methsurv數(shù)據(jù)庫DKK1基因CpG位點DNA甲基化的熱圖。Fig 7 DNA methylation levels of DKK1 and their prognostic value in LUAD.A: DKK1 promoter methylation levels in normal tissue and lung adenocarcinoma tissue; B: DKK1 promoter methylation levels in lung adenocarcinoma tissues at different tumor stages; C: Heat map of DNA methylation at the CpG site of the DKK1 gene in the Methsurv database.

2.7DKK1在LUAD中的功能富集分析 我們利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫探索了DKK1共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，驗證了DKK1在LUAD中的潛在功能及作用。在LUAD中，2398個基因（深紅點）與DKK1呈顯著正相關(guān)，2399個基因（深綠點）呈負(fù)相關(guān)（FDR＜0.01）（圖8A），使用熱圖顯示與DKK1呈正負(fù)相關(guān)的前50個基因（圖8B，圖8C），其中CREG2、GJB3、TNS4、PLCD3與DKK1表達(dá)相關(guān)性最強(qiáng)（r=0.478、0.467、0.461、0.459和P=1.05e-30、3.17e-29、1.87e-28、3.75e-28）。我們使用R軟件包對DKK1相關(guān)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO功能注釋表明DKK1共表達(dá)主要參與皮膚發(fā)育、細(xì)胞-基質(zhì)連接、鈣依賴性磷脂結(jié)合；KEGG通路分析表明DKK1共表達(dá)主要與ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)（圖8D）。

圖8 DKK1在LUAD中的功能富集分析。A：LinkedOmics數(shù)據(jù)庫DKK1共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖；B：前50個正相關(guān)基因的熱圖；C：前50個負(fù)相關(guān)基因的熱圖；D：GO和KEGG富集分析。Fig 8 Functional enrichment analysis of DKK1 in LUAD.A: LinkedOmics database DKK1 co-expression network diagram; B: Thermogram of the first 50 positively related genes; C: Thermogram of the first 50 negatively related genes; D: GO and KEGG enrichment analysis.GO: gene ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

2.8 IHC對DKK1在LUAD中高表達(dá)的驗證 我們針對DKK1在LUAD中的表達(dá)及其預(yù)后價值來證實上述發(fā)現(xiàn)，選取來自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的59例石蠟包埋的LUAD樣本進(jìn)行IHC研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，59例LUAD中陰性表達(dá)15例（25.4%，圖9A），弱陽性表達(dá)18例（30.5%），強(qiáng)陽性表達(dá)26例（44.1%，圖9B）。對59例患者進(jìn)行隨訪，其中4例失訪，DKK1低表達(dá)組包括陰性和弱陽性，共33例；高表達(dá)組為DKK1強(qiáng)陽性表達(dá)，共26例。兩組生存率存在統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=3.998,P=0.042），DKK1低表達(dá)組生存率更高（圖9C）。

圖9 DKK1特性的初步實驗驗證。A：DKK1表達(dá)為陰性的免疫組化圖（×100）；B：DKK1表達(dá)為陽性的免疫組化圖（×100）；C：59例LUAD患者不同DKK1表達(dá)量分組預(yù)后情況。Fig 9 Preliminary experimental verification of DKK1 characteristics.A: Immunohistochemistry of DKK1 expression negative (×100); B:Immunohistochemistry of positive expression of DKK1 (×100); C: Prognosis of different DKK1 expression groups in 59 patients with LUAD.

3 討論

肺癌的診治一直以來都是臨床的研究重點，有報告[6]指出肺癌是全球癌癥致死的常見原因，占癌癥致死總數(shù)的18%，近年來，我國肺癌的5年生存率提高了3.6%，但仍有75%的患者處于肺癌晚期，因此需要一個新的指標(biāo)來精準(zhǔn)預(yù)測預(yù)后[7]。DKK1于1998年在非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，由兩個富含半胱氨酸的保守結(jié)構(gòu)域和一個50-55個氨基酸組成的連接區(qū)域構(gòu)成，主要通過與LRP5/6結(jié)合并阻斷Wnt相互作用來抑制Wnt信號傳導(dǎo)，人類DKK1基因位于染色體10q11.2.26上[8-10]。DKK1影響腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究[11-13]顯示，DKK1通過調(diào)控Wnt信號通路，從而對腫瘤細(xì)胞生長、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，對血管生成、腫瘤免疫微環(huán)境、化療耐藥性的影響也有報道。有關(guān)DKK1在NSCLC中的生物學(xué)效應(yīng)有研究[14]發(fā)現(xiàn)DKK1的過表達(dá)促進(jìn)了人NSCLC細(xì)胞系95C的遷移和侵襲；Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)DKK1可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在促進(jìn)細(xì)胞系遷移和侵襲性生長方面發(fā)揮作用；姚伶俐等[16]通過建立H460-DKK1裸鼠移植瘤模型證實了DKK1高表達(dá)促進(jìn)人NSCLC中線性程序性死亡（linearly patterned programmed cell necrosis, LPPCN）和血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry, VM）形成。近年來，生物信息學(xué)研究成為熱點，但DKK1在LUAD中的作用研究較少，故本研究旨在通過生物信息學(xué)方法探索DKK1在LUAD中的表達(dá)和預(yù)后情況以及其在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用和潛在機(jī)制。

有關(guān)DKK1在癌癥中的表達(dá)，一方面認(rèn)為DKK1在膽管癌[17]、食管癌[18]、頭頸癌[19]、肝癌[20]、NSCLC[4]、胃癌[21]和乳腺癌[22]中表達(dá)上調(diào)，另一方面認(rèn)為DKK1在卵巢癌[23]和結(jié)直腸癌[24]中表達(dá)下調(diào)。我們在TCGA聯(lián)合GTEx數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)DKK1在LUAD組織中較正常肺組織表達(dá)明顯上調(diào)，同時通過來自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的LUAD樣本驗證發(fā)現(xiàn)，59例LUAD中陰性表達(dá)占25.4%，弱陽性表達(dá)占30.5%，強(qiáng)陽性表達(dá)占44.1%，實驗驗證結(jié)果與從數(shù)據(jù)庫得出的結(jié)果一致，證明DKK1在LUAD中的高表達(dá)。研究DKK1與LUAD患者病理特征之間的關(guān)系時我們發(fā)現(xiàn)，DKK1在晚期癌癥中表達(dá)高于早期階段，表明潛在的DKK1在腫瘤發(fā)展和遷移中的作用。王中秋等[25]研究發(fā)現(xiàn)DKK1的表達(dá)與NSCLC患者的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis,TNM）分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和血管浸潤有關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)DKK1表達(dá)與患者的診斷年齡相關(guān)，與腫瘤的TNM分期、患者性別以及TP53基因突變等無關(guān)。越來越多的研究[26]證明，免疫細(xì)胞浸潤是腫瘤進(jìn)展和免疫治療的關(guān)鍵因素，也有研究[11]表明，DKK1與多種癌癥的免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)DKK1與aDC、嗜中性粒細(xì)胞和Tgd等多個免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，推斷DKK1可能通過影響免疫細(xì)胞的功能、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性或Wnt信號通路來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。少有研究說明DKK1甲基化在LUAD中的可能性，我們觀察到與正常組織相比LUAD中的DKK1啟動子甲基化水平顯著降低，在研究DKK1甲基化水平與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系中，我們發(fā)現(xiàn)有9個CpG位點的甲基化水平與預(yù)后相關(guān)，我們推測DKK1可能通過甲基化促進(jìn)LUAD的發(fā)生。生存分析結(jié)果顯示DKK1高表達(dá)組的PPS明顯縮短，提示DKK1高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，通過對55例患者的隨訪，我們發(fā)現(xiàn)DKK1低表達(dá)組有更高的生存率，這與我們得出的結(jié)果一致。預(yù)后列線圖模型顯示在TCGA-LUAD隊列中，1、3和5年OS的列線圖曲線下面積均大于0.5，且3和5年預(yù)測值和實際生存率之間具有良好的一致性。與BRDT、MAGEA10、MAGEA4和CT83等差異基因進(jìn)行聯(lián)系后我們發(fā)現(xiàn)，CT83表達(dá)與LUAD患者的預(yù)后相關(guān)[27]；而BRDT的異常激活首先在肺癌中檢測到[28]，MAGEA10、MAGEA4也在肺癌中表達(dá)[29,30]。GO分析發(fā)現(xiàn)，DKK1及其共表達(dá)基因主要參與皮膚發(fā)育、細(xì)胞-基質(zhì)連接、鈣依賴性磷脂結(jié)合。KEGG通路表明，DKK1共表達(dá)主要與ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)，有研究[31]報道在肺癌中ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)與不同的腫瘤分期和人群相關(guān)。至于DKK1與ABC轉(zhuǎn)運蛋白是如何影響LUAD的發(fā)生還需要進(jìn)一步進(jìn)行探究。

綜上所述，本研究主要通過生物信息學(xué)方法分析DKK1在LUAD中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DKK1在LUAD免疫治療和預(yù)后預(yù)測方面的潛在價值，并初步探討了DKK1在LUAD中可能參與的信號通路。同時我們的研究也存在一定的局限性，實驗驗證采用的是回顧性研究，可能存在一定的選擇偏倚，再加上標(biāo)本量的原因，需要后續(xù)加大樣本量來進(jìn)行驗證。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Feng YC conceived and designed the study.Lu RJ and Li YX analyzed the data.Yu TT provided the experimental prototype.Lu RJ, Li YX and Xieyidai A performed the experiments and data collection.Lu RJ and Feng YC co-wrote the paper.All the authors had access to the data.All authors read and approved the fnal manuscript as submitted.